“葡萄糖氧化酶+過氧化氫酶+檸檬酸”組合添加劑對商品肉兔生產(chǎn)性能、免疫指標(biāo)及養(yǎng)分表觀消化率的影響

詹海杰 李燕平 曹 亮 黨文慶 樊愛芳 任克良

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太原 030032)

全球每年消耗抗生素總量的90%用在了食源動物身上，致使細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題日益突出，2020年我國飼料端全面禁止添加抗生素，因此要求我們業(yè)界要進(jìn)一步提高動物營養(yǎng)與保健，調(diào)整飼料營養(yǎng)設(shè)計，選用新型綠色添加劑產(chǎn)品，維護動物食品安全和公共衛(wèi)生安全。酶制劑是通過生物技術(shù)方法產(chǎn)生的一類高效、專一、綠色、無殘留的活性成分，具有抑菌、抗氧化、中止炎癥、降低腹瀉率等作用[1]。研究表明，由于酶制劑的替抗功能具有條件性、輔助性和累積性的特點，通過組合酶和配合酶制劑的篩選和高效配制才能達(dá)到較好的替抗效果[2]。目前，酶制劑作為一種飼料添加劑已廣泛應(yīng)用于肉雞、蛋雞和仔豬的生產(chǎn)過程，而應(yīng)用于反芻動物和生長兔方面的研究相對較少[3]。檸檬酸作為有機酸化劑是一種生產(chǎn)中應(yīng)用較多的酸化劑，對畜禽具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、降低胃和腸道pH等作用。飼糧中添加檸檬酸可以顯著提高生長肉兔的平均日增重，降低腹瀉率、死亡率[4]。本試驗在前期開展的單酶、單酸化劑試驗基礎(chǔ)上以“葡萄糖氧化酶+過氧化氫酶+檸檬酸”組合添加劑替代抗生素進(jìn)行試驗，旨在探索其替代抗生素添加劑或抗生素類動物保健品應(yīng)用于商品肉兔飼糧中的效果，為其在商品肉兔綠色養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葡萄糖氧化酶(10 000 U/g)、過氧化氫酶(200 000 U/g)為山東某酶制劑公司產(chǎn)品，檸檬酸為濰坊英某有限公司生產(chǎn)的食品級一水檸檬酸。

1.2 試驗飼糧

對飼料原料的營養(yǎng)價值進(jìn)行測定后，參考任克良[5]推薦的肉兔配合飼料生產(chǎn)技術(shù)，以玉米、麥麩、豆粕、花生秧、豆秸桿粉等飼料原料配制基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼糧配方的基礎(chǔ)上，分別添加低、中、高3種劑量的組合添加劑，制成3種試驗飼糧。組合添加劑按照設(shè)定的劑量添加于預(yù)混料中，混合均勻。此外，再在基礎(chǔ)飼糧配方的基礎(chǔ)上添加抗生素，配制1種含抗生素飼糧。各飼糧均加工成直徑為5 mm的顆粒飼料后備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 試驗設(shè)計

試驗選取健康的35日齡斷奶伊拉商品肉兔300只(公母各占1/2)，按照體重和性別隨機分為5組，每組60個重復(fù)，每個重復(fù)1只兔?？瞻讓φ战M飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素對照組飼喂在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加抗生素(恩拉霉素20 g/t+金霉素52.5 g/t)的含抗生素飼糧，試驗1組、試驗2組、試驗3組飼喂在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上分別添加低劑量(葡萄糖氧化酶200 g/t+過氧化氫酶114 g/t+檸檬酸1.0%)、中劑量(葡萄糖氧化酶400 g/t+過氧化氫酶228 g/t+檸檬酸1.0%)、高劑量(葡萄糖氧化酶800 g/t+過氧化氫酶456 g/t+檸檬酸1.0%)組合添加劑的試驗飼糧。預(yù)試期5 d，正試期30 d。飼養(yǎng)試驗在肉兔養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行，半開放式兔舍，通風(fēng)良好。試驗兔每天飼喂1次，自由采食和飲水。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生產(chǎn)性能(生長性能、腹瀉率和死亡率)

試驗期間，每周一清晨飼喂前對試驗兔進(jìn)行空腹稱重，記錄飼喂量，并計算平均日采食量、平均日增重及料重比。

記錄每日腹瀉、死亡的試驗兔，對死亡兔進(jìn)行剖檢，分析死亡原因，計算腹瀉率和死亡率。

腹瀉率(%)=[腹瀉只日數(shù)∕(試驗只數(shù)×試驗天數(shù))]×100[6]； 死亡率(%)=(死亡個體數(shù)∕試驗只數(shù))×100。

1.4.2 養(yǎng)分表觀消化率

在試驗結(jié)束前試驗兔達(dá)到65日齡時，每組各選取體重基本相同的試驗兔8只(公母各占1/2)置于消化代謝籠內(nèi)采用全收糞法進(jìn)行消化試驗，用于測定養(yǎng)分表觀消化率。消化試驗期間將試驗兔放置于消化代謝籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)，自由飲水。每天定期收集糞便記錄糞便的重量，在收集糞樣過程中將飼糧、毛發(fā)等去除干凈，糞樣置于4 ℃冰箱保存。記錄每只試驗兔每天的投料量和剩料量，計算耗料量；待4 d的收糞期結(jié)束后，將糞樣混勻，置于65～70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重，于空氣中放置24 h與空氣中水分平衡后，粉碎制樣，過40目標(biāo)準(zhǔn)篩，檢測常規(guī)養(yǎng)分含量。參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[7]的方法對飼糧和糞樣中各養(yǎng)分含量進(jìn)行測定。

養(yǎng)分表觀消化率計算公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×(攝入飼糧中該養(yǎng)分量-糞中該養(yǎng)分排出量)∕攝入飼糧中該養(yǎng)分量。

1.4.3 免疫指標(biāo)(免疫器官指數(shù)、血清免疫指標(biāo))

試驗結(jié)束時，每組選擇8只接近平均體重的試驗兔屠宰后，取胸腺、脾臟及圓小囊，去除包圍物后分別稱重，計算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及圓小囊指數(shù)，計算公式如下：

胸腺指數(shù)(g/kg)=胸腺重量/宰前活體重；脾臟指數(shù)(g/kg)=脾臟重量/宰前活體重；圓小囊指數(shù)(g/kg)=圓小囊重量/宰前活體重。

試驗結(jié)束前3天，每組各選8只(4公4母)試驗兔進(jìn)行耳靜脈采血，采集的血液靜置30 min，待血液凝固后，3 000 r/min離心10 min，收集血清裝入EP管中于-20 ℃保存，用于測定血清免疫指標(biāo)。血清免疫指標(biāo)均采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定，其標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.99。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。腹瀉率、死亡率采用卡方檢驗。除腹瀉率、死亡率外，試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 組合添加劑對商品肉兔生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，飼糧中添加不同劑量的組合添加劑對肉兔的末重、平均日增重、平均日采食量及料重比均沒有顯著影響(P>0.05)。

表2 組合添加劑對商品肉兔生長性能的影響

由表3可知，經(jīng)卡方檢驗分析，各組肉兔的腹瀉率、死亡率差異不顯著(P>0.05)，3個試驗組中以試驗3組的腹瀉率和死亡率最低。

表3 組合添加劑對商品肉兔腹瀉率和死亡率的影響

2.2 組合添加劑對商品肉兔養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表4可知，試驗2組的粗蛋白質(zhì)表觀消化率最低，與抗生素對照組差異顯著(P<0.05)，空白對照組、試驗1組、試驗3組與抗生素對照組差異不顯著(P>0.05)；抗生素對照組的粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維表觀消化率顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于空白對照組及各試驗組，空白對照組與各試驗組差異不顯著(P>0.05)；干物質(zhì)、淀粉和粗脂肪表觀消化率各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表4 組合添加劑對商品肉兔養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 組合添加劑對商品肉兔免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，試驗3組的圓小囊指數(shù)最大，與抗生素對照組、試驗2組差異極顯著(P<0.01)；試驗2組的圓小囊指數(shù)最小，與空白對照組、試驗3組差異極顯著(P<0.01)。

表5 組合添加劑對商品肉兔免疫器官指數(shù)的影響

由表6可知，試驗2組的血清免疫球蛋白A(IgA)含量最高，與空白對照組、抗生素對照組差異極顯著(P<0.01)，與試驗1組差異顯著(P<0.05)，同時試驗3組也顯著高于空白對照組和抗生素對照組(P<0.05)；試驗2組、試驗3組的血清分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量較高，與空白對照組差異極顯著(P<0.01)；試驗1組、試驗2組的血清免疫球蛋白M(IgM)含量較高，與空白對照組和抗生素對照組差異顯著(P<0.05)；血清白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量以試驗2組最高，與空白對照組差異極顯著(P<0.01)，同時試驗3組也顯著高于空白對照組(P<0.05)。與空白對照組和抗生素對照組相比，飼糧中添加不同劑量的組合添加劑提高了肉兔血清中的免疫球蛋白和細(xì)胞因子的含量，說明該組合添加劑提高了肉兔機體的免疫反應(yīng)且替抗效果較好。

表6 組合添加劑對商品肉兔血清免疫指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 組合添加劑對商品肉兔生產(chǎn)性能的影響

葡萄糖氧化酶作為一種綠色添加劑可以改善畜禽腸道消化環(huán)境、消除自由基、維持腸道菌群平衡[8]。過氧化氫酶具有清除自由基和過氧化物的功能，具體表現(xiàn)為維持腸上皮細(xì)胞功能，促進(jìn)畜禽生長發(fā)育[9-10]。而檸檬酸不僅是三羧酸循環(huán)的代謝中間產(chǎn)物，同時還具有提高機體免疫力、促進(jìn)畜禽生長發(fā)育的作用[11]。范秋麗等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼糧中添加適量的葡萄糖氧化酶、溶菌酶和腐殖酸鈉對黃羽肉雞的平均日增重、料重比無顯著影響。唐明紅[13]在飼糧中添加過氧化氫酶后發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶可以改善肉仔雞的生長性能。在飼糧中添加過氧化氫酶還可以改善仔豬的抗氧化能力，緩解肝臟損傷，最終表現(xiàn)為仔豬生長性能的提高[14]。鄭曉君[15]在基礎(chǔ)飼糧中添加不同劑量的檸檬酸后發(fā)現(xiàn)，適量的檸檬酸可顯著提高肉雞的出欄體重和成活率。以上研究結(jié)果說明葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和檸檬酸的添加可以提高畜禽的生產(chǎn)性能?；谇叭说难芯?，本試驗將葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、檸檬酸組合加入到肉兔基礎(chǔ)飼糧中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的組合添加劑均可以改善肉兔的末重和平均日增重，且料重比與空白對照組相比均有所降低；同時發(fā)現(xiàn)，不同劑量的組合添加劑對肉兔的末重和平均日增重?zé)o顯著影響，而料重比在低劑量時最佳。本課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)二甲酸鉀和磷酸復(fù)合酸化劑的添加劑量對商品肉兔的末重、平均日增重和料重比影響較小[16]，單獨添加檸檬酸可提高肉兔的生產(chǎn)指標(biāo)，且添加劑量對生產(chǎn)指標(biāo)無顯著影響[4]。上述結(jié)果說明，單一使用酸化劑或酶制劑可提高畜禽的生產(chǎn)性能，且添加劑量對畜禽的生產(chǎn)性能基本無影響，而2類或2類以上的組合添加劑不僅可以提高畜禽的各項生產(chǎn)性能指標(biāo)，還往往存在低劑量即可達(dá)到降低料重比的效果。

腹瀉是斷奶幼兔生產(chǎn)過程中最嚴(yán)重的疾病，發(fā)病率和死亡率均居疾病之首。研究發(fā)現(xiàn)酶制劑具有減輕腸道炎癥反應(yīng)、抗腹瀉等功效[17]，而酸化劑能提高家畜和家禽的免疫能力[18]。目前，酶制劑和酸化劑在降低斷奶仔豬腹瀉率和死亡率方面的報道較多。在斷奶仔豬飼糧中添加酸化劑后試驗組仔豬腹瀉率和平均日增重均有所改善[19]。李潔云等[20]將益生菌、酸化劑、精油和酶制劑的復(fù)合添加劑加入到斷奶仔豬飼糧中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個試驗組的腹瀉率顯著低于對照組。費洪標(biāo)等[21]發(fā)現(xiàn)，在斷奶獺兔飼糧中添加0.10%或0.15%的酸化劑均可以明顯降低腹瀉率和死亡率。3種添加劑形成的復(fù)合添加劑在降低兔腹瀉率方面的應(yīng)用較少，與添加劑應(yīng)用于仔豬腹瀉方面的結(jié)果類似，本研究中添加高劑量組合添加劑的試驗組肉兔腹瀉率、死亡率最低，與抗生素對照組接近，隨著組合添加劑添加劑量的提高，對肉兔腹瀉的影響逐漸增強。

3.2 組合添加劑對商品肉兔養(yǎng)分表觀消化率的影響

養(yǎng)分表觀消化率反映了畜禽腸道的功能，酸化劑和酶制劑可降低畜禽腸道pH，提高腸道有益菌群的數(shù)量，改善腸道的營養(yǎng)狀況[22]。范京輝等[23]在飼糧中添加葡萄糖氧化酶等酶制劑后發(fā)現(xiàn)酶制劑使黃羽肉雞的總磷和粗蛋白質(zhì)消化率顯著高于對照組。鄭建婷等[24]發(fā)現(xiàn)檸檬酸的添加導(dǎo)致肉兔的粗灰分表觀消化率顯著高于對照組。檸檬酸和磷酸以4∶6混合成的復(fù)合酸化劑也可提高斷奶幼兔的粗蛋白質(zhì)表觀消化率[25]。本試驗中，肉兔的粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維表觀消化率各試驗組之間無顯著差異，但高劑量組合添加劑組肉兔養(yǎng)分表觀消化率各項指標(biāo)比低、中劑量組合添加劑組更接近抗生素對照組。本試驗結(jié)果與已發(fā)表的研究結(jié)果不太一致，試驗肉兔的生理狀況、組合添加劑的選擇及劑量、酶制劑與酸化劑是否具體協(xié)同作用等因素均會影響肉兔對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，以上問題需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3.3 組合添加劑對商品肉兔免疫指標(biāo)的影響

研究表明胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和圓小囊指數(shù)作為免疫器官指數(shù)與免疫功能呈正相關(guān)，在一定程度上能反映畜禽機體健康程度[26]。飼糧中添加一定量的酸化劑和酶制劑可以增強畜禽機體的免疫力。研究顯示，將葡萄糖氧化酶加入到肉兔飼糧中，隨著葡萄糖氧化酶添加量的提高，胸腺重量、脾臟重量和脾臟指數(shù)均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢[27]。將檸檬酸和磷酸混合成的復(fù)合酸化劑加入幼兔飼糧中，隨著復(fù)合酸化劑添加量的增加，幼兔胸腺重量和胸腺指數(shù)與抗生素對照組相比均呈現(xiàn)不同程度的降低，脾臟指數(shù)和圓小囊指數(shù)則沒有顯著變化[25]。本試驗中，試驗3組肉兔的圓小囊指數(shù)高于空白對照組、抗生素對照組和試驗1組、試驗2組，且與抗生素對照組的差異極顯著。飼糧中添加高、中和低劑量的組合添加劑時，肉兔的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)小于空白對照組和抗生素對照組但差異不顯著。綜合以上文獻(xiàn)得出，葡萄糖氧化酶的加入會導(dǎo)致肉兔胸腺重量、脾臟重量和脾臟指數(shù)均提高，檸檬酸等酸化劑的加入使得胸腺重量和胸腺指數(shù)降低，而脾臟指數(shù)和圓小囊指數(shù)無顯著變化。由此推測，本研究中圓小囊指數(shù)增加可能主要是由復(fù)合酶制劑引起的，究其原因可能是由于過氧化氫酶去除腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)達(dá)到對腸上皮細(xì)胞的保護作用導(dǎo)致。

免疫球蛋白是廣泛存在于動物體中的動物蛋白，根據(jù)結(jié)構(gòu)分為IgG、IgA和IgM三大類。IgM是免疫應(yīng)答反應(yīng)中最早產(chǎn)生的，具有殺菌、溶菌等作用，主要作用于機體的早期防御。IgG是初級免疫應(yīng)答中最持久和主要的免疫球蛋白，含量最高且直接參與體液免疫反應(yīng)。IgA分成血清型和分泌型，血清型IgA具有介導(dǎo)調(diào)理吞噬依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)作用，sIgA是機體黏膜防御系統(tǒng)的主要成分[28]。因此，血清中免疫球蛋白含量可直接反映動物體內(nèi)免疫能力的強弱。白細(xì)胞介素是白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，在激活和調(diào)節(jié)動物體免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化等方面起重要作用。其中，IL-6與動物體多種疾病的發(fā)生有一定的關(guān)系，IL-10具有抑制巨噬細(xì)胞的活性等功效。穆淑琴等[14]將葡萄糖氧化酶添加到仔豬飼糧中發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶顯著提高了血清中IgG、IgA、IgM的含量。朱愛民等[29]將不同的酸化劑添加到斷奶仔豬飼糧中發(fā)現(xiàn)檸檬酸可以使仔豬血清中IgG的含量升高。本研究中，中劑量和高劑量組合添加劑可使肉兔血清中IgA、IgM和IL-10的含量顯著增加。綜上所述，由于酸化劑和酶制劑的添加提高了肉兔血清中免疫球蛋白和細(xì)胞因子的含量，從而導(dǎo)致機體的免疫應(yīng)答增強。

4 結(jié) 論

隨著飼糧中“葡萄糖氧化酶+過氧化氫酶+檸檬酸”組合添加劑添加劑量的增加，商品肉兔的死亡率呈下降趨勢，免疫力呈上升趨勢。綜合分析生產(chǎn)性能、養(yǎng)分表觀消化率和免疫指標(biāo)，本試驗條件下以高劑量組合添加劑(葡萄糖氧化酶800 g/t+過氧化氫酶456 g/t+檸檬酸1.0%)的效果較好。