復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑對(duì)檸條錦雞兒青貯發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

李勝楠 張 歡 董臣飛 雷曉青 張桂杰*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，銀川 750021；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014；3.云力之星生物科技有限公司，天津 300354)

檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)是主要分布于我國(guó)西北干旱風(fēng)沙區(qū)的豆科灌木，其根系發(fā)達(dá)、繁殖快、固氮能力強(qiáng)[1]。近年來(lái)，寧夏、內(nèi)蒙等荒漠化地區(qū)人工檸條林種植面積持續(xù)增長(zhǎng)。截至2017年，寧夏鹽池縣檸條林種植面積為1.73萬(wàn)hm2，而南部山區(qū)為76萬(wàn)hm2[2]，這些檸條林不僅在荒漠草原防風(fēng)固沙與保持水土方面貢獻(xiàn)突出，而且成為了當(dāng)?shù)厣笠环N重要的粗飼料來(lái)源。因此，合理開(kāi)發(fā)利用檸條錦雞兒資源是增加粗飼料供應(yīng)，發(fā)展現(xiàn)代畜牧業(yè)的有效途徑。

檸條錦雞兒富含粗蛋白質(zhì)和異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸等多種必需氨基酸，還含有生物堿、黃酮類、香豆素類等功能性物質(zhì)，具有較高的飼喂價(jià)值[3]。然而，木質(zhì)素和粗纖維含量隨檸條錦雞兒生育期延長(zhǎng)而增加[4]，同時(shí)其含有鞣酸和一些揮發(fā)性物質(zhì)，因而適口性差，消化率低[5]。研究表明，平茬能促進(jìn)檸條錦雞兒生長(zhǎng)，青貯可軟化其托刺，發(fā)酵后氣味酸香，可提高家畜育肥效果[4，6]。與其他優(yōu)質(zhì)粗飼料相比，檸條錦雞兒碳水化合物含量低，纖維素含量和緩沖能高[7]，并且附生的乳酸菌少，單獨(dú)青貯不易成功。已有研究證實(shí)，青貯飼料品質(zhì)可通過(guò)添加纖維素酶和乳酸菌等生物添加劑得到提高[8-10]。纖維素酶和木聚糖酶可協(xié)同分解纖維素和木聚糖，同時(shí)木聚糖的分解增加了纖維素孔隙度，使其更容易被纖維素酶利用[11]。因而，添加纖維素酶和木聚糖酶青貯發(fā)酵有利于降低檸條錦雞兒纖維素含量。乳酸菌制劑能夠增加豆科飼草青貯初期乳酸菌數(shù)量，促進(jìn)乳酸發(fā)酵。此外，酵母菌通過(guò)調(diào)控植物乳酸桿菌代謝產(chǎn)物抑制梭狀芽孢桿菌和好氧細(xì)菌繁殖，從而減少青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)降解[12]。目前，菌制劑和酶制劑聯(lián)用調(diào)控檸條錦雞兒青貯飼料品質(zhì)的研究尚不多見(jiàn)，因此，本研究選擇青貯專用復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑，探究其對(duì)青貯檸條錦雞兒營(yíng)養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響，為改善檸條錦雞兒青貯品質(zhì)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣地

檸條錦雞兒樣地位于寧夏自治區(qū)吳忠市鹽池縣十六堡新村，屬典型的大陸性季風(fēng)氣候，氣候干燥，降水量少而集中，土壤類型主要為灰鈣土和風(fēng)沙土[13]。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為盛花期寧夏鹽池縣退耕還林帶的人工種植檸條錦雞兒，其種植年限為5年。刈割后立即機(jī)械揉絲粉碎，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

添加劑：復(fù)合菌制劑(酵母菌和植物乳酸桿菌數(shù)量分別為1×1011和5×109CFU/g)和復(fù)合酶制劑(纖維素酶和木聚糖酶活性分別為2×104和2×103U/g)由天津某生物科技公司提供。檸條錦雞兒營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示。

表1 檸條錦雞兒營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以花期檸條錦雞兒為青貯原料，試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)組，分別為對(duì)照組(CK組)、添加0.05%復(fù)合菌制劑組(F組)、添加0.1%復(fù)合酶制劑組(X組)和添加0.05%復(fù)合菌制劑+0.1%復(fù)合酶制劑組(FX組)。

采用Aurora型手持式近紅外光譜儀測(cè)定檸條錦雞兒水分含量，調(diào)節(jié)水分含量至65%左右，將其與添加劑按上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案混合。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)稱取500 g左右調(diào)制好的樣品裝入聚乙烯袋(20 cm×30 cm)，真空封口機(jī)抽真空和密封，置于室內(nèi)(25 ℃左右)避光保存，貯藏60 d后測(cè)定營(yíng)養(yǎng)成分、發(fā)酵特性、微生物數(shù)量及有氧穩(wěn)定性。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 原料與青貯飼料化學(xué)成分測(cè)定

取200 g檸條錦雞兒原料和青貯飼料，置于105 ℃烘箱中殺青30 min，65 ℃烘干至恒重，測(cè)定干物質(zhì)(dry matter，DM)含量。將烘干樣用DJ-10A粉碎機(jī)粉碎，過(guò)2 mm篩后用于測(cè)定營(yíng)養(yǎng)成分含量。采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)含量[14]，采用范式洗滌纖維法測(cè)定酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)含量[15]，采用自動(dòng)脂肪分析儀(XT15i，ANKOM公司，美國(guó))測(cè)定粗脂肪(ether extract，EE)含量，采用灼燒恒質(zhì)量法測(cè)定粗灰分(Ash)含量，采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)含量[16]。總可消化養(yǎng)分(total digestible nutrient，TDN)計(jì)算公式[17]如下：

TDN(%)=88.9-(ADF×0.779)。

1.4.2 青貯發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定

青貯60 d后，取5 g樣品放入含45 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩使其完全浸入水中，4 ℃下封口保存24 h，用4層紗布過(guò)濾獲得浸提液，利用雷磁PHS-3G精密pH計(jì)測(cè)定pH。采用苯酚-次氯酸鈉比色法[18]測(cè)定氨態(tài)氮(NH3-N)含量，以氨態(tài)氮/總氮(NH3-N/TN)表示。乳酸(lactic acid，LA)含量使用乳酸測(cè)試盒(A019-2-1型，南京建成生物工程研究所)測(cè)定[19]。參照許慶方等[20]的方法利用日本島津LC-16高效液相色譜儀測(cè)定乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)含量。根據(jù)《粗飼料品質(zhì)評(píng)價(jià)手冊(cè)》V-Score評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和所測(cè)青貯飼料中NH3-N、乙酸、丙酸和丁酸含量進(jìn)行發(fā)酵品質(zhì)評(píng)價(jià)，總評(píng)分為NH3-N、乙酸+丙酸和丁酸3項(xiàng)得分之和，滿分100分；將青貯飼料劃分為3個(gè)等級(jí)，分別為良好(>80分)、尚可(60～80分)和不良(<60分)[21]，V-Score評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 V-Score評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 微生物數(shù)量測(cè)定

利用稀釋平板涂布法對(duì)微生物菌落中乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、酵母菌(yeast)和霉菌(mold)進(jìn)行計(jì)數(shù)。乳酸菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，酵母菌和霉菌選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。將接種好的MRS培養(yǎng)基于37 ℃厭氧生化箱中培養(yǎng)48 h，PDA培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)24～36 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，用lg(CFU/g)表示計(jì)數(shù)單位。

1.4.4 有氧穩(wěn)定性測(cè)定

青貯60 d后，立即將青貯飼料混合均勻裝入新的青貯袋中，在發(fā)酵袋幾何中心處插入溫度記錄儀(HOBO Pendant Temperature/Light，美國(guó))，扎緊封口，在袋子上扎一些小孔通氣，置于室溫下保存。在室內(nèi)不同位置放置3個(gè)溫度記錄儀，記錄儀每30 min自動(dòng)記錄1次溫度，當(dāng)青貯袋中的溫度高于室溫2 ℃時(shí)停止計(jì)時(shí)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以P<0.05為差異顯著判斷。

2 結(jié) 果

2.1 添加劑對(duì)檸條錦雞兒青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響

如表3所示，F(xiàn)、X和FX組青貯飼料WSC含量顯著低于CK組(P<0.05)；其中，F(xiàn)X組青貯飼料WSC含量最低，為1.36%。F、X和FX組青貯飼料NDF含量顯著低于CK組(P<0.05)；其中，F(xiàn)X組青貯飼料NDF含量最低，為65.31%。X和FX組青貯飼料ADF含量顯著低于CK組(P<0.05)，TDN含量顯著高于CK組(P<0.05)。各組之間青貯飼料DM、CP、EE和Ash含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 各組檸條錦雞兒青貯營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 添加劑對(duì)檸條錦雞兒青貯發(fā)酵特性的影響

如表4所示，F(xiàn)、X和FX組青貯飼料pH、丙酸含量和NH3-N/TN顯著低于CK組(P<0.05)，乳酸含量和乳酸/乙酸顯著高于CK組(P<0.05)；其中，F(xiàn)X組青貯飼料乳酸含量和乳酸/乙酸最高。X組青貯飼料乙酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)。各組均未檢測(cè)到丁酸。

表4 各組檸條錦雞兒青貯的發(fā)酵品質(zhì)(干物質(zhì)基礎(chǔ))

依據(jù)NH3-N/TN、乙酸、丙酸和丁酸含量測(cè)定結(jié)果，采用V-Score評(píng)分體系對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果如表5所示，CK組青貯飼料總分最低，為89.96；F、X和FX組青貯飼料總分均在90分以上，等級(jí)均為良好。

表5 各組V-Score得分

2.3 添加劑對(duì)檸條錦雞兒青貯微生物數(shù)量的影響

如表6所示，F(xiàn)、X和FX組青貯飼料乳酸菌數(shù)量顯著高于CK組(P<0.05)；其中，F(xiàn)X組青貯飼料乳酸菌數(shù)量最高，為7.80 lg(CFU/g)。FX組青貯飼料酵母菌數(shù)量顯著低于其他各組(P<0.05)，F(xiàn)組青貯飼料酵母菌數(shù)量顯著高于其他各組(P<0.05)。各組之間青貯飼料霉菌數(shù)量較少，且無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 各組檸條錦雞兒青貯微生物數(shù)量

2.4 添加劑對(duì)檸條錦雞兒青貯有氧穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，在有氧暴露后，CK、F、X和FX組青貯飼料有氧變質(zhì)時(shí)間分別為49.00、48.33、55.33和54.33 h。X和FX組青貯飼料有氧穩(wěn)定性顯著高于CK組和F組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 添加劑對(duì)檸條錦雞兒青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響

青貯過(guò)程中，WSC含量直接關(guān)系到青貯調(diào)制難易程度，其作為微生物發(fā)酵底物，能為微生物增殖提供能量來(lái)源。本試驗(yàn)中，F(xiàn)、X和FX組青貯飼料WSC含量顯著低于CK組，F(xiàn)X組青貯飼料WSC含量最低。這可能是因?yàn)镕組中本身富含乳酸菌，為滿足生長(zhǎng)繁殖而利用了大量WSC，從而降低了青貯飼料中殘余的WSC含量。此外，有益微生物利用纖維素酶降解纖維成分所產(chǎn)生的WSC作為碳源，促進(jìn)了自身生長(zhǎng)和繁殖[22]，因而X組中殘余的WSC含量較低。FX組WSC含量最低，這可能由于復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑之間存在復(fù)雜作用，具體原因需進(jìn)一步研究。飼草纖維含量對(duì)反芻動(dòng)物的干物質(zhì)采食量和消化率有重要影響，其中ADF含量與動(dòng)物飼草消化率呈負(fù)相關(guān)，ADF含量越低，消化率越高，飼喂價(jià)值越大[23]。酶制劑對(duì)植物纖維成分的降解作用已被國(guó)內(nèi)外許多研究證明[23-24]。本研究表明，與CK組相比，F(xiàn)組青貯飼料NDF含量顯著降低，而ADF含量無(wú)顯著差異，可能因?yàn)闄帡l錦雞兒細(xì)胞壁成分復(fù)雜，且木質(zhì)素含量較高，并與半纖維素結(jié)合成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[25]，致使復(fù)合菌附著能力有限。X組青貯飼料NDF和ADF含量低于CK組，表明酶制劑可有效降低檸條錦雞兒青貯纖維含量，從而提高其適口性。酶制劑可促進(jìn)檸條錦雞兒細(xì)胞壁纖維成分降解，為乳酸菌生產(chǎn)乳酸提供了額外的底物[5]，同時(shí)促進(jìn)微生物快速利用底物并產(chǎn)生具有溶解纖維活性的微生物酶[26]。FX組青貯飼料NDF和ADF含量低于F和X組，說(shuō)明同時(shí)添加復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑有利于降低檸條錦雞兒青貯中纖維含量，改善飼草消化率。謝鳳蓮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，使用復(fù)合菌和纖維素酶處理可顯著降低艾草青貯的NDF和半纖維素含量，這與本研究結(jié)果相似。TDN含量是衡量飼料養(yǎng)分整體性營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)好壞和飼料采食量的重要指標(biāo)，其含量越高表明飼料養(yǎng)分越全面[27-28]。本試驗(yàn)中，與CK組相比，X和FX組青貯飼料TDN含量顯著升高，且FX組青貯飼料TDN含量最高，說(shuō)明青貯中同時(shí)添加復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑能夠提高飼料利用率。通過(guò)對(duì)青貯營(yíng)養(yǎng)成分分析，表明復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用可降低纖維含量，較好地保存檸條錦雞兒青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分，具有較高的飼喂價(jià)值。

3.2 添加劑對(duì)檸條錦雞兒青貯發(fā)酵特性的影響

pH、有機(jī)酸和NH3-N含量能夠直觀反映青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，其中乳酸含量越高，NH3-N、丙酸和丁酸含量越低，青貯品質(zhì)越好[28-29]。與CK組相比，F(xiàn)、X和FX組青貯飼料pH均降至4.2以下，且未檢測(cè)到丁酸，說(shuō)明青貯飼料品質(zhì)較好[29]。酶制劑可以促進(jìn)檸條錦雞兒青貯纖維降解，增加發(fā)酵底物，從而促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵，并提高青貯飼料乳酸含量。本試驗(yàn)中，復(fù)合菌制劑中的酵母菌和植物乳酸桿菌在發(fā)酵過(guò)程相互促進(jìn)，酵母菌產(chǎn)生的維生素、氨基酸和生長(zhǎng)因子等促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)[30]。此外，酵母菌還可利用酶制劑降解植物細(xì)胞壁所產(chǎn)生的單糖和雙糖等小分子化合物，刺激乳酸菌繁殖[31]。因此，復(fù)合菌制劑和復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用通過(guò)提高檸條錦雞兒青貯乳酸菌數(shù)量，增加了乳酸含量，從而抑制丙酸生成。青貯飼料中NH3-N主要由植物酶和微生物降解蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)所產(chǎn)生，反映了青貯中蛋白質(zhì)分解程度，NH3-N/TN越低則蛋白質(zhì)分解程度越小，越有利于家畜采食[32]。本試驗(yàn)中，F(xiàn)、X和FX組青貯飼料NH3-N/TN均顯著低于CK組，且FX組青貯飼料NH3-N/TN最低，這說(shuō)明復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用能夠較好地保存檸條錦雞兒的蛋白質(zhì)。有研究表明，青貯中添加植物乳酸桿菌和纖維素酶等生物添加劑可降低pH，抑制植物酶和有害微生物對(duì)青貯飼料中蛋白質(zhì)降解，從而有效降低NH3-N含量，提高青貯飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8]。在青貯60 d后，各組V-Score評(píng)分等級(jí)均為良好。以上分析表明，復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用對(duì)檸條錦雞兒青貯發(fā)酵品質(zhì)的改善效果優(yōu)于二者單獨(dú)使用，同時(shí)許多研究也表明在青貯過(guò)程中同時(shí)添加酶制劑和菌制劑有利于提高青貯發(fā)酵品質(zhì)[26]。因此，同時(shí)添加復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑提高了檸條錦雞兒發(fā)酵品質(zhì)。

3.3 添加劑對(duì)檸條錦雞兒青貯微生物數(shù)量及有氧穩(wěn)定性的影響

乳酸菌是青貯成功的關(guān)鍵微生物，其在厭氧環(huán)境下利用碳源促進(jìn)自身繁殖，從而產(chǎn)生大量乳酸，使pH迅速降至4.2以下，并有效抑制有害微生物生長(zhǎng)繁殖[33]。本試驗(yàn)中，F(xiàn)、X和FX組青貯飼料乳酸菌數(shù)量顯著高于CK組，而F和FX組青貯飼料乳酸菌含量較高，這與孫貴賓等[33]對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，復(fù)合菌制劑中的乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中成為檸條錦雞兒青貯的優(yōu)勢(shì)微生物，主導(dǎo)青貯發(fā)酵進(jìn)程。在厭氧環(huán)境下，酵母菌可分解糖產(chǎn)生乙醇，并在好氧環(huán)境下氧化糖產(chǎn)生水和二氧化碳，使青貯飼料具有酒香味[10]。本試驗(yàn)中，F(xiàn)組青貯飼料酵母菌數(shù)量顯著高于CK組，這可能是由于添加復(fù)合菌制劑的同時(shí)增加了酵母菌含量，而FX組青貯飼料酵母菌數(shù)量顯著低于CK和X組，可能是由于FX組中富含乳酸菌，可產(chǎn)生大量的乳酸，降低了青貯飼料pH，從而抑制了酵母菌繁殖。

青貯飼料一旦與空氣接觸，酵母菌和霉菌等好氧微生物開(kāi)始活躍，并利用青貯中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖，致使青貯飼料變質(zhì)[34]。本試驗(yàn)中，檸條錦雞兒青貯在開(kāi)袋49 h后開(kāi)始變質(zhì)。乙酸是影響青貯飼料有氧穩(wěn)定性的重要因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，在青貯發(fā)酵后期，較高的乙酸含量能夠抑制不良微生物生長(zhǎng)，降低其最大生長(zhǎng)速率，從而使有氧穩(wěn)定性增加[35]。本試驗(yàn)中，X和FX組有氧穩(wěn)定性均得到了改善，而X組青貯飼料乙酸含量高于FX組，有氧穩(wěn)定性更好，說(shuō)明檸條錦雞兒青貯中較高的乙酸含量能夠抑制酵母菌生長(zhǎng)，提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

① 從營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)來(lái)看，復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用比單獨(dú)添加在降低檸條錦雞兒青貯的WSC、NDF、ADF含量和提高TDN含量方面效果更佳。

② 從發(fā)酵特性來(lái)看，復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑單獨(dú)添加和聯(lián)用均可降低檸條錦雞兒青貯的pH和NH3-N含量，提高乳酸含量和乳酸菌數(shù)量；復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用比單獨(dú)添加在降低丙酸含量、酵母菌數(shù)量和提高乳酸/乙酸方面效果更佳。

③ 復(fù)合酶制劑單獨(dú)添加及復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用提高了檸條錦雞兒青貯的有氧穩(wěn)定性。

④ 本試驗(yàn)中，綜合營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵特性和有氧穩(wěn)定性，復(fù)合菌制劑和復(fù)合酶制劑聯(lián)用對(duì)檸條錦雞兒青貯品質(zhì)改善效果最好。