飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃組織結(jié)構(gòu)和瘤胃菌群多樣性和組成的影響

姚喜喜 王 偉 徐成體* 張瑞強(qiáng) 陳永瓏 牛 勇 周雙福

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；3.青海東牧灣農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司，海東 811600)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及周邊地區(qū)的優(yōu)良畜種，為高原人民提供了最基本的生產(chǎn)和生活資料。牦牛與牧民長(zhǎng)期以來(lái)的相互依存關(guān)系，使得牦牛已成為高原歷史文化的重要組成部分，牦牛也為亞洲高原經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)[1]。近年來(lái)，過(guò)度放牧導(dǎo)致了草場(chǎng)的嚴(yán)重退化，牦牛冷季存活率和出欄率嚴(yán)重下降[2]。因此，牦牛的營(yíng)養(yǎng)管理，特別是冷季傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，對(duì)于提高牦牛的健康、營(yíng)養(yǎng)水平和生長(zhǎng)發(fā)育尤為重要。

瘤胃作為將光合作用吸收的光能轉(zhuǎn)化為供人類食用的奶、肉等易消化化合物之間的重要中間媒介[3]，在反芻動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。瘤胃中存在細(xì)菌、古菌、真菌和原生動(dòng)物等復(fù)雜的微生物群落，能夠?qū)㈦y以消化的植物轉(zhuǎn)化為供家畜維持生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量[4]。細(xì)菌約占瘤胃微生物總量的95%[5]。瘤胃的正?；顒?dòng)與瘤胃微生物發(fā)酵關(guān)系密切，是反芻動(dòng)物維持正常生理活動(dòng)的必要保證[6]。以往研究表明，奶牛、肉牛、牦牛、肉羊和山羊等反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落組成對(duì)飼糧粗蛋白質(zhì)、粗纖維、能量水平或飼養(yǎng)方式極其敏感[1,7-9]。據(jù)報(bào)道，高精料飼糧能促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖激活受體(PPAR-α)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃上皮乳頭的發(fā)育[10]。此外，瘤胃代謝產(chǎn)物被微生物用于自我增殖，并與控制微生物代謝及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)途徑的代謝因子相互作用[11]。16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)是分析微生物群落多樣性的可靠方法，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類胃腸道微生物的研究[12-13]。據(jù)韓旭峰[14]報(bào)道，瘤胃微生物受到飼糧營(yíng)養(yǎng)水平的影響。因此，為更好地解釋瘤胃微生物是如何受飼養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變的影響，進(jìn)而如何改變瘤胃發(fā)育，對(duì)促進(jìn)牦牛瘤胃發(fā)育，提高牦牛生長(zhǎng)性能和養(yǎng)殖效率具有重要意義。

鑒于此，本研究從青藏高原高寒牧區(qū)牦牛生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，系統(tǒng)研究放牧和舍飼2種飼養(yǎng)方式對(duì)青海大通牦牛瘤胃組織結(jié)構(gòu)及瘤胃菌群多樣性和組成的影響，提出適宜大通牦牛的冷季飼養(yǎng)方式，為了解牦牛瘤胃內(nèi)特定微生物功能和提高牦牛瘤胃發(fā)育水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用配對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，選取30頭體重[(213.50±13.12) kg]相近、健康狀況良好的2歲大通公牦牛，隨機(jī)分為放牧組和舍飼組，每組15頭牦牛。放牧組牦牛每天07:00—19:00進(jìn)行放牧，放牧期間自由采食和飲水。舍飼組牦牛分3個(gè)獨(dú)立圈舍，每個(gè)圈舍隨機(jī)分配5頭，每日飼喂全混合日糧(TMR)，TMR配方參見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。每日分2次(08:00和17:00)飼喂，自由采食和飲水。試驗(yàn)預(yù)試期15 d，正試期190 d。

1.2 樣品采集與測(cè)定

1.2.1 瘤胃測(cè)序樣本的采集

試驗(yàn)結(jié)束后，將24頭試驗(yàn)牦牛全部禁食24 h，斷水8 h后進(jìn)行屠宰，每頭牦牛采集50 mL瘤胃液，混勻后過(guò)濾，取其中20 mL瘤胃液封裝至5個(gè)5 mL凍存管后立刻放入液氮罐，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存，以備DNA提取和高通量測(cè)序分析。

1.2.2 瘤胃組織切片樣品的采集與測(cè)定

為觀察瘤胃組織形態(tài)發(fā)育情況，每頭牦牛剪取2 cm×2 cm大小的瘤胃組織3份，經(jīng)4%多聚甲醛固定后作為固定組織標(biāo)本。所有標(biāo)本送樣至成都里來(lái)生物科技有限公司按病理檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)進(jìn)行。標(biāo)本經(jīng)脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后鏡檢。采用麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行鏡檢圖像采集，每張切片于40倍下觀察全部組織，選擇要測(cè)量的區(qū)域并采集40倍和400倍圖片待測(cè)。用數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA410Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)觀察瘤胃組織，用Motic Images Advanced軟件測(cè)量瘤胃乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、上皮厚度、角質(zhì)層厚度和肌層厚度[16]。

1.2.3 瘤胃細(xì)菌DNA抽提與PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega Bio-Tek, Norcross，美國(guó))說(shuō)明書進(jìn)行24個(gè)牦牛瘤胃細(xì)菌群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測(cè)定DNA濃度和純度；使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR儀：ABI GeneAmp?9700型)。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,27個(gè)循環(huán)；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。PCR反應(yīng)體系為20 μL：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L)0.8 μL，下游引物(5 μmol/L)0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，添加雙蒸水至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)[17]。

1.2.4 瘤胃細(xì)菌Illumina MiSeq測(cè)序

根據(jù)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的標(biāo)準(zhǔn)方案，使用Illumina公司的Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)配對(duì)末端進(jìn)行測(cè)序，然后將純化的擴(kuò)增子等摩爾匯集在一起。

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，美國(guó))進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusTMFluorometer(Promega,美國(guó))對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量[18]。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)[18]。利用Illumina公司的Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用fastp[18](https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH[19](http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE[18]軟件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據(jù)97%[20]的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[21](http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(v138)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，對(duì)每個(gè)OTU代表性序列進(jìn)行分類分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0軟件對(duì)放牧組與舍飼組大通牦牛試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，以P>0.05表示組間差異不顯著，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1和表1可知，飼養(yǎng)方式顯著或極顯著影響了大通牦牛的瘤胃組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)(P<0.05或P<0.01)。舍飼組牦牛瘤胃乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、上皮厚度和角質(zhì)層厚度顯著或極顯著高于放牧組牦牛(P<0.05或P<0.01)，瘤胃肌層厚度顯著低于放牧組牦牛(P<0.05)。

表1 飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃組織結(jié)構(gòu)的影響

圖1 大通牦牛瘤胃組織形態(tài)學(xué)觀察

2.2 飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃菌群Alpha和Beta多樣性的影響

由表2可知，飼養(yǎng)方式顯著或極顯著影響了大通牦牛瘤胃菌群Alpha多樣性(P<0.05或P<0.01)。放牧組牦牛瘤胃菌群Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)極顯著高于舍飼組牦牛(P<0.01)，Simpson指數(shù)則顯著低于舍飼組牦牛(P<0.05)。

表2 飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃菌群Alpha多樣性的影響

圖2的主成分分析(PCA)顯示，受不同飼養(yǎng)方式的影響，牦牛瘤胃菌群Beta多樣性存在差異，表現(xiàn)為放牧組牦牛瘤胃菌群Beta多樣性極顯著高于舍飼組牦牛(P<0.01)。

圖2 大通牦牛瘤胃菌群PCA

2.3 飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃菌群組成的影響

由圖3和表3可知，門水平上，舍飼組牦牛瘤胃菌群中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)的相對(duì)豐度顯著高于放牧組牦牛(P<0.05)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)的相對(duì)豐度顯著或極顯著低于放牧組牦牛(P<0.05或P<0.01)。

表3 大通牦牛瘤胃菌群中相對(duì)豐度在門水平>0.1%的物種

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Proteobacteria：變形菌門；Others：其他。

由圖4和表4可知，屬水平上，舍飼組牦牛瘤胃菌群中克里斯滕森菌科_R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)、毛螺菌科_NK3A20群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)、CAG-35、瘤胃球菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)、瘤胃球菌科_UCG-001(Ruminococcaceae_UCG-001)、Candidatus_Saccharimonas的相對(duì)豐度顯著或極顯著高于放牧組牦牛(P<0.05或P<0.01)，瘤胃球菌科_NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、理研菌科_RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)和普雷沃氏菌科_UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)的相對(duì)豐度顯著或極顯著低于放牧組牦牛(P<0.05或P<0.01)。

表4 大通牦牛瘤胃菌群中相對(duì)豐度在屬水平>1%的物種

Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科_R-7群；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科_NK4A214群；Prevotella_1：普氏菌屬_1；Ruminococcus_2：瘤胃球菌屬_2；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科_RC9腸道群；Lachnospiraceae_NK3A20_group：毛螺菌科_NK3A20群；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科_UCG-014；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬_1；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group：產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科_UCG-005；Unclassified_o_Clostridiales：未分類梭菌目；Ruminococcaceae_UCG-001：瘤胃球菌科_UCG-001；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃氏菌科_UCG-003；Ruminococcaceae_UCG-011：瘤胃球菌科_UCG-011；Ruminococcaceae_UCG-010：瘤胃球菌科_UCG-010；Others：其他。

2.4 瘤胃組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)與瘤胃菌群的相關(guān)性

通過(guò)皮爾遜相關(guān)性研究瘤胃組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)與屬水平相對(duì)豐度差異較大的瘤胃菌群的關(guān)系(圖5)可知，Christensenellaceae_R-7_group和Ruminococcus_2的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度和乳頭寬度均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與上皮厚度和角質(zhì)層厚度均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Lachnospiraceae_NK3A20_group的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度和乳頭寬度均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與肌層厚度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Prevotellaceae_UCG-003的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度和乳頭寬度均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Rikenellaceae_RC9_gut_group的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、上皮厚度和角質(zhì)層厚度均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

藍(lán)色和紅色分別代表負(fù)相關(guān)和正相關(guān)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃組織結(jié)構(gòu)的影響

牦牛由于生長(zhǎng)環(huán)境高寒低氧的特殊性，造成了牦牛對(duì)粗飼料具有較強(qiáng)的消化能力。瘤胃作為反芻動(dòng)物消化粗飼料的大型厭氧發(fā)酵罐，通過(guò)瘤胃微生物的降解作用或發(fā)酵作用可將植物飼料轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，為機(jī)體提供能量。據(jù)Sosin-Bzducha等[22]報(bào)道，瘤胃組織發(fā)育狀況會(huì)顯著影響反芻動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用程度，在犢牛飼糧中，用青貯玉米籽粒代替干玉米飼喂?fàn)倥ｏ@著增加了瘤胃乳頭長(zhǎng)度，明顯改善了瘤胃上皮厚度和角質(zhì)層厚度。此外，瘤胃上皮對(duì)VFA的吸收速率在很大程度上取決于轉(zhuǎn)運(yùn)體的可用性和乳頭表面積，有50%～85%的VFA被瘤胃上皮直接吸收，因而瘤胃的發(fā)育水平對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)VFA的吸收非常關(guān)鍵[23]。Miller等[23]研究表明，奶牛的瘤胃上皮細(xì)胞隨著飼糧和生理變化而發(fā)生變化，從干奶牛飼糧到泌乳牛飼糧的轉(zhuǎn)變顯著促進(jìn)了奶牛瘤胃乳頭的發(fā)育，增強(qiáng)了瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)VFA的吸收能力和適應(yīng)性。本研究通過(guò)對(duì)表征瘤胃組織形態(tài)學(xué)特征等發(fā)育指標(biāo)的評(píng)價(jià)，分析了牦牛瘤胃組織結(jié)構(gòu)，以揭示飼養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變對(duì)大通牦牛瘤胃組織發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)，舍飼組大通牦牛瘤胃乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、上皮厚度和角質(zhì)層厚度均顯著或極顯著高于放牧組牦牛，可能是因?yàn)榉拍两M牦牛長(zhǎng)期攝入的天然牧草數(shù)量有限，造成瘤胃中VFA的含量較低，一定程度上限制了瘤胃乳頭、上皮和角質(zhì)層的發(fā)育。Merchen等[24]報(bào)道了瘤胃中VFA的含量對(duì)羔羊瘤胃乳頭、上皮和角質(zhì)層的發(fā)育有顯著影響，飼喂粗飼料會(huì)顯著降低羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、上皮厚度和角質(zhì)層厚度，這與本研究結(jié)果一致。舍飼條件下，瘤胃吸收VFA的能力較強(qiáng)，瘤胃乳頭發(fā)育較好，角質(zhì)層的完整性以及角質(zhì)層細(xì)胞的角化程度在很大程度上影響了瘤胃上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸，因此，舍飼組牦牛瘤胃上皮厚度和角質(zhì)層厚度的增加促進(jìn)了牦牛瘤胃的發(fā)育，促進(jìn)了瘤胃對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本研究中，舍飼組牦牛瘤胃肌層厚度極顯著低于放牧組，這可能是放牧組牦牛采食的是粗飼料的原因，研究表明，粗飼料可以刺激瘤胃壁肌肉的發(fā)育和提高肌層厚度[25]。

3.2 飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃菌群多樣性和組成的影響

本研究探討了不同飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃菌群多樣性和組成的影響。以往研究表明，飼養(yǎng)方式和飼糧能量水平會(huì)顯著影響甘南牦牛的生長(zhǎng)性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)和瘤胃菌群多樣性與組成[26]。牦牛瘤胃核心菌群由10個(gè)不同的菌群組成，但其相對(duì)豐度可能存在差異[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)方式極顯著影響了大通牦牛瘤胃菌群的Alpha多樣性和Beta多樣性，且均表現(xiàn)為放牧組牦牛極顯著高于舍飼組牦牛。在門水平上，2種飼養(yǎng)方式均以Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria為大通牦牛的瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群；另外，在屬水平上，2種飼養(yǎng)方式間均以Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcus_2和Rikenellaceae_RC9_gut_group為大通牦牛的瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群。Alpha多樣性分析顯示，放牧組牦牛和舍飼組牦牛瘤胃菌群多樣性和豐富度各有不同，這與Zhou等[28]認(rèn)為飼喂粗飼料牦牛瘤胃菌群多樣性和豐富度與飼喂精飼料牦牛存在差異的研究結(jié)果一致，也與Fang等[29]的研究得出的放牧或室內(nèi)養(yǎng)殖會(huì)對(duì)牦牛瘤胃菌群多樣性造成不同的影響的結(jié)論一致。本研究結(jié)果說(shuō)明，牦牛瘤胃菌群多樣性和組成與飼養(yǎng)方式直接相關(guān)。

3.3 瘤胃組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)與瘤胃菌群的相關(guān)性

飼養(yǎng)方式對(duì)大通牦牛瘤胃菌群多樣性和組成有顯著影響。李宏等[30]研究表明，飼養(yǎng)水平對(duì)阿勒泰羊胃腸道發(fā)育、瘤胃發(fā)酵參數(shù)、消化酶活性及瘤胃微生物區(qū)系具有顯著影響，較高的飼養(yǎng)水平能夠顯著改善阿勒泰羊胃腸道發(fā)育、促進(jìn)瘤胃發(fā)酵和改善微生物區(qū)系。舍飼組牦牛瘤胃Christensenellaceae_R-7_group和Ruminococcus_2的相對(duì)豐度極顯著高于放牧組牦牛，Lachnospiraceae_NK3A20_group和Rikenellaceae_RC9_gut_group相對(duì)豐度顯著或極顯著低于放牧組牦牛。Christensenellaceae_R-7_group是Firmicutes家族成員，研究表明，Christensenellaceae_R-7_group能夠迅速對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)作出反映，參與胃腸道蛋白質(zhì)分解代謝，與飼糧蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)[31-32]。本研究中，舍飼組牦牛飼糧蛋白質(zhì)水平高于放牧組牦牛，促進(jìn)了瘤胃Christensenellaceae_R-7_group的定植，使其瘤胃中的相對(duì)豐度極顯著高于放牧組牦牛。舍飼組牦牛瘤胃Ruminococcus_2的相對(duì)豐度極顯著高于放牧組牦牛，Ruminococcus_2被認(rèn)為是瘤胃中具有纖維降解能力的主要細(xì)菌，Ruminococcus_2相對(duì)豐度的改變可以從根本上改變瘤胃中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和利用[32]。Ruminococcus_2的生長(zhǎng)與Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)基因表達(dá)呈正相關(guān)，TLRs基因能夠觸發(fā)免疫應(yīng)答以維持宿主微生物的穩(wěn)態(tài)，并能識(shí)別宿主細(xì)菌及其產(chǎn)物的誘導(dǎo)[33]。本研究中，Christensenellaceae_R-7_group的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度和乳頭寬度均呈極顯著正相關(guān)，Ruminococcus_2的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、上皮厚度和角質(zhì)層厚度呈極顯著正相關(guān)，這是由于舍飼組牦牛瘤胃發(fā)育較好，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而增加了Christensenellaceae_R-7_group和Ruminococcus_2的相對(duì)豐度，促進(jìn)了瘤胃組織的發(fā)育。

此外，Lachnospiraceae_NK3A20_group的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度和乳頭寬度均呈顯著正相關(guān)，與肌層厚度呈顯著負(fù)相關(guān)。Lachnospiraceae_NK3A20_group是反芻動(dòng)物胃腸道菌群的重要組成部分，與丁酸鹽的產(chǎn)生密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，在去勢(shì)牛的瘤胃中，丁酸可以顯著增加瘤胃上皮乳頭的表面積、長(zhǎng)度和寬度[34]。本研究認(rèn)為，Lachnospiraceae_NK3A20_group除了通過(guò)增加丁酸產(chǎn)量促進(jìn)瘤胃的發(fā)育外，還能直接影響瘤胃的發(fā)育。隨著Lachnospiraceae_NK3A20_group豐度的增加，牦牛瘤胃利用率顯著提高，使牦牛在促進(jìn)瘤胃生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)也獲得了更多的能量。Rikenellaceae_RC9_gut_group的相對(duì)豐度與乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、上皮厚度和角質(zhì)層厚度均呈顯著負(fù)相關(guān)，Rikenellaceae_RC9_gut_group屬于理研菌科(Rikenellaceae)，在粗纖維的消化中起著重要作用[7]。舍飼組牦牛瘤胃Rikenellaceae_RC9_gut_group的相對(duì)豐度極顯著低于放牧組牦牛，可能是舍飼組牦牛瘤胃中粗飼料含量較低的緣故。Prevotellaceae_UCG-003的相對(duì)豐度與乳頭寬度呈顯著負(fù)相關(guān)，研究表明，Prevotellaceae_UCG-003對(duì)瘤胃環(huán)境pH較為敏感，瘤胃pH越低，Prevotellaceae_UCG-003的相對(duì)豐度越低[35]。舍飼組牦牛由于瘤胃pH較低，因此Prevotellaceae_UCG-003的相對(duì)豐度也較低。研究發(fā)現(xiàn)Prevotellaceae_UCG-003可以提高飼料效率[36]，同時(shí)Prevotellaceae_UCG-003還可以利用VFA參與糖代謝[37]。這說(shuō)明舍飼組牦牛瘤胃中Prevotellaceae_UCG-003的減少促進(jìn)了瘤胃的生長(zhǎng)發(fā)育，但Prevotellaceae_UCG-003的減少促進(jìn)乳頭長(zhǎng)度增加的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

飼養(yǎng)方式顯著或極顯著影響了大通牦牛的瘤胃組織結(jié)構(gòu)及瘤胃菌群多樣性和組成，且瘤胃組織結(jié)構(gòu)的變化與瘤胃菌群相關(guān)。本研究結(jié)果將為更好地了解牦牛瘤胃內(nèi)特定菌群功能及其在促進(jìn)瘤胃發(fā)育方面的相關(guān)機(jī)制提供理論依據(jù)。