桑葉提取物對斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、抗氧化能力和免疫功能的影響

宋 敏 王超普,2 鄧 盾 劉志昌 陳秋雨 崔藝燕 魯慧杰 李貞明 余 苗 遆俊嶺 馬現(xiàn)永,4*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東畜禽肉品質量安全控制與評定工程技術研究中心，廣州 510640；2.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528225；3.廣東廣匯農(nóng)牧有限公司，韶關 512040; 4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

仔豬在早期斷奶時，其消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，加之受采食方式、環(huán)境和營養(yǎng)變化等諸多應激因素的影響，仔豬腸道結構形態(tài)和功能易發(fā)生改變，對營養(yǎng)物質的消化吸收功能下降，機體免疫能力和抗病力降低，容易發(fā)生腹瀉等疾病，引起仔豬斷奶應激綜合征，從而造成仔豬生產(chǎn)性能下降甚至死亡[1-2]。我國規(guī)定，從2020年7月1日起飼料全面禁抗。如何在無抗條件下，降低斷奶仔豬腹瀉、提升仔豬機體抗氧化能力和免疫力，從而提高其生產(chǎn)性能已成為當今養(yǎng)豬業(yè)的重點。因此，開發(fā)具有提高抗氧化能力和增強免疫力的綠色飼料添加劑成為提升斷奶仔豬健康養(yǎng)殖的重要手段和研究熱點。

桑葉是?？浦参锷涞娜~子，在我國的種植面積高達100萬hm2，分布遍及全國[3]。桑葉具有較高的營養(yǎng)價值，除了含有豐富的碳水化合物、蛋白質、粗脂肪、粗纖維、維生素和礦物質等營養(yǎng)物質，桑葉中還含有桑葉多酚、黃酮、多糖以及生物堿等多種生物活性物質，具有降血糖、抗氧化和提高免疫力等多種功效[4-7]，理論上具有很高的飼用價值。然而，桑葉中含有單寧、植物凝集素等抗營養(yǎng)因子，過量添加不僅會影響飼糧的適口性，還會降低畜禽對蛋白質的利用，阻止機體對鈣的吸收[8]。而將桑葉分離提純并加工成桑葉提取物(mulberry leaf extract，MLE)，不僅能夠降低單寧、植物凝集素等這些抗營養(yǎng)因子的含量，同時還能將桑葉中的桑葉多酚、黃酮、多糖和生物堿等活性成分分離并提純出來。因此，MLE作為一種綠色飼料添加劑，以其特有的純天然、安全、多功效和毒副作用小等特性引起了畜牧業(yè)的廣泛關注。研究表明，在畜禽和水產(chǎn)飼料中添加MLE能夠改善飼料的消化率和利用率，提高動物機體的抗氧化能力、免疫功能和生長性能，改善畜禽、水產(chǎn)產(chǎn)品的肉品質和屠宰性能[9-13]。目前，MLE在動物養(yǎng)殖中的應用大多集中在家禽和水產(chǎn)上，而其對豬的影響則少有報道。因此，本試驗以斷奶仔豬作為研究對象，通過在飼糧中添加1 000 g/t的MLE，探討其對仔豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、消化酶活性、抗氧化能力以及免疫功能的影響，旨在為MLE在仔豬飼糧中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用MLE由廣州市某公司提供，由桑葉粉的乙醇浸提物濃縮后噴霧干燥制成。其主要活性成分為桑葉黃酮、桑葉多酚、桑葉多糖和生物堿，其中桑葉總黃酮含量為20.51%。

1.2 試驗設計

試驗選取48頭初始體重為(8.287±0.141) kg且健康的(28±1)日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶閹公豬，隨機分為2組，每組6個重復，每個重復4頭豬。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組(MLE組)在基礎飼糧中添加1 000 g/t的MLE(產(chǎn)品企業(yè)標準制定前進行了梯度試驗，確定推薦的劑量為1 000 g/t)。試驗期為28 d。玉米-豆粕型基礎飼糧參照NRC(2012)仔豬營養(yǎng)需要量配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。飼糧按試驗期分為2個階段，分別為斷奶前期(7～11 kg)和斷奶后期(12～25 kg)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)維生素-礦物預混料為每千克飼糧提供 The vitamin-mineral premix provided the following per kg of diets：VA 9 600 IU，VD3 3 000 IU，VE 1 500 IU，VK3 3 mg，VB1 2.25 mg，VB2 7.5 mg，VB6 5 mg，VB12 0.03 mg，煙酸 nicotinic acid 30 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 15 mg，葉酸 folic acid 1.5 mg,生物素 biotin 0.15 mg; Fe 120 mg，Cu 16 mg，Se 0.5 mg，Co 0.4 mg，Zn 80 mg，Mn 70 mg，I 0.70 mg。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所全封閉式仔豬試驗場進行。豬舍內(nèi)溫度控制在(25±1) ℃，相對濕度控制在(50±5)%。每個重復的4頭仔豬在同一欄中飼養(yǎng)。試驗期間所有仔豬自由采食和飲水，每次喂食遵循少量多次原則，每天早晚觀察斷奶仔豬的精神狀態(tài)。每天定時清掃豬舍，以保持豬舍清潔。定期對豬舍進行消毒，消毒及免疫程序均按照豬場常規(guī)程序進行。

1.4 樣品采集

試驗結束前3 d(第26～28天)，每天早上收集糞樣。試驗結束后，將每頭仔豬的全部糞樣混合均勻，然后置于105 ℃烘箱中烘干至恒重，再將烘干的糞樣粉碎過40目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

第28天試驗結束時，所有仔豬禁食12 h，每個重復選取1頭接近平均體重的斷奶仔豬進行頸靜脈采血，用含抗凝劑(肝素鈉)的采血管收集血液，顛倒混勻，室溫靜置30 min后，3 500 r/min、4 ℃離心10 min，收集血漿，分裝于1.5 mL離心管中，并于-80 ℃保存，用于血漿抗氧化和免疫指標的檢測。仔豬采血后屠宰，取肝臟組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干后迅速切小塊，分裝于凍存管并轉移至液氮中，-80 ℃保存，用于肝臟抗氧化指標的檢測。用載玻片分別刮取空腸和回腸的腸黏膜，分裝于1.5 mL離心管中，立即置于液氮中保存，用于測定腸道消化酶活性。

1.5 指標測定

1.5.1 生長性能和腹瀉率

試驗第1天和第28天測定各組斷奶仔豬空腹體重。試驗期間記錄每個重復的總采食量，試驗結束后計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。每天早晚2次仔細檢查斷奶仔豬的肛門，觀察有無腹瀉情況并記錄，試驗結束后，根據(jù)以下公式計算每欄仔豬的腹瀉率：

腹瀉率(%)=100×[仔豬腹瀉頭次總和/(仔豬頭數(shù)×試驗天數(shù))]。

1.5.2 養(yǎng)分表觀消化率

采用內(nèi)源指示劑——鹽酸不溶灰分(AIA)法進行養(yǎng)分表觀消化率的測定，飼糧和糞便中AIA含量參考GB/T 23742—2009測定；干物質含量參考GB/T 6435—2006測定；粗蛋白質含量參考GB/T 6432—2018測定；粗脂肪含量參考GB/T 6433—2006測定；粗纖維質含量參考GB/T 6434—2006測定；粗灰分含量參考GB/T 6438—2007測定。養(yǎng)分表觀消化率計算公式如下：

養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-[(飼糧中AIA含量/糞樣中AIA含量)×(糞樣中該養(yǎng)分含量/飼糧中該養(yǎng)分含量)×100]。

1.5.3 消化酶活性

采用空腸和回腸的腸黏膜測定脂肪酶和淀粉酶活性，使用南京建成生物工程研究所試劑盒，根據(jù)試劑盒的說明書進行測定。

1.5.4 抗氧化能力

使用南京建成生物工程研究所試劑盒對血漿和肝臟中總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性等抗氧化能力指標進行測定。檢測過程嚴格按照說明書的步驟進行。

1.5.5 免疫功能

血漿中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量等免疫功能指標均使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定，試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行獨立樣本t檢驗(t-test)，測定結果以“平均值±標準誤”(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05≤P<0.10表示有顯著趨勢。

2 結 果

2.1 MLE對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

由表2可知，與對照組相比，MLE組斷奶仔豬ADFI和F/G無顯著性差異(P>0.05)，但其ADG有增加的趨勢(0.05≤P<0.10)，且腹瀉率顯著降低(P<0.05)。

表2 MLE對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

2.2 MLE對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表3可知，2組之間粗蛋白質、粗纖維和粗灰分的表觀消化率無顯著性差異(P>0.05)；但與對照組相比，飼糧添加1 000 g/t的MLE可顯著提高粗脂肪的表觀消化率(P<0.05)，并有提高干物質表觀消化率的趨勢(0.05≤P<0.10)。

表3 MLE對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 MLE對斷奶仔豬消化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧添加1 000 g/t的MLE可極顯著提高斷奶仔豬空腸中脂肪酶的活性(P<0.01)，并顯著提高回腸中脂肪酶的活性(P<0.05)，而對空腸和回腸中淀粉酶的活性無顯著性影響(P>0.05)。

表4 MLE對斷奶仔豬消化酶活性的影響

2.4 MLE對斷奶仔豬抗氧化能力的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧添加1 000 g/t的MLE可顯著提高斷奶仔豬血漿中GSH-Px的活性和T-AOC(P<0.05)，而對血漿中MDA含量、T-SOD和CAT活性無顯著性影響(P>0.05)。同時，與對照組相比，飼糧添加1 000 g/t的MLE可顯著提高斷奶仔豬肝臟中T-SOD的活性(P<0.05)，而對肝臟中CAT和GSH-Px活性、MDA含量以及T-AOC無顯著性影響(P>0.05)。

表5 MLE對斷奶仔豬抗氧化能力的影響

2.5 MLE對斷奶仔豬免疫功能的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧添加1 000 g/t的MLE顯著降低了斷奶仔豬血漿中TNF-α的含量(P<0.05)，同時顯著提高了血漿中IgA和IgM的含量(P<0.05)，而對斷奶仔豬血漿中IgG的含量無顯著性影響(P>0.05)。

表6 MLE對斷奶仔豬免疫功能的影響

3 討 論

3.1 MLE對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

桑葉中除了含有桑葉黃酮、桑葉多糖、生物堿和甾醇類等多種對畜禽生長有益的天然活性物質外，還含有單寧、植物凝集素等抗營養(yǎng)因子，大量添加到飼糧中不僅會影響飼糧的適口性，還會阻礙蛋白質和鈣的吸收利用，從而降低畜禽生長性能[10,14]。MLE可將桑葉中的活性物質分離提純并加以濃縮，使其充分發(fā)揮功效。Zhao等[15]研究表明，飼糧中添加桑葉多糖可降低早期斷奶仔豬的腹瀉率，改善其腸道微生態(tài)環(huán)境，提高仔豬的生長性能。此外，李婉濤等[16]研究發(fā)現(xiàn)，育肥豬飼糧中添加0.3%的杜仲和MLE能夠提高育肥豬的ADG和飼料報酬，從而提高其生產(chǎn)性能。與前人研究結果相一致，在本試驗中，飼糧添加1 000 g/t的MLE能顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，并有提高斷奶仔豬ADG的趨勢，這可能跟MLE中的多種活性物質改善了仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境，促進了腸道健康，提高了機體抗氧化能力和免疫力有關。

3.2 MLE對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率和消化酶活性的影響

仔豬斷奶時，由于其消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，仔豬往往存在胃酸分泌不足，腸道內(nèi)消化酶活性較低等問題，這造成斷奶仔豬對飼糧中營養(yǎng)物質的消化吸收能力下降，影響其生長性能[17]。養(yǎng)分表觀消化率是評價動物對營養(yǎng)物質的消化能力以及飼糧營養(yǎng)價值的重要指標。本試驗結果顯示，與對照組相比，MLE組斷奶仔豬對粗脂肪的表觀消化率顯著提高，對干物質的表觀消化率也有升高的趨勢。同時，與對照組相比，飼糧添加MLE顯著提高了斷奶仔豬空腸和回腸中脂肪酶的活性，表明MLE通過提高仔豬腸道內(nèi)脂肪酶的活性提高了對粗脂肪的表觀消化率。趙衛(wèi)國等[11]研究表明，在肉用四季鵝飼糧中分別添加0、2%、4%、6%和8%的桑葉粉，鵝對干物質、粗灰分、粗蛋白質、粗纖維和粗脂肪的利用率和能量利用率均隨著桑葉粉添加比例的增加而呈現(xiàn)下降趨勢，說明桑葉中存在抗營養(yǎng)因子，在飼糧中添加時應選擇適當劑量。而本試驗中添加的MLE不含有抗營養(yǎng)因子，且濃縮了桑葉中含有的多糖、多酚和黃酮等多種活性物質，因此未出現(xiàn)營養(yǎng)物質消化率下降的現(xiàn)象。有研究表明，在飼糧中添加適量的桑葉黃酮能夠改善斷奶犢牛胃腸道形態(tài)，提高消化酶的活性[18]；還能提升綿羊對營養(yǎng)物質的消化率[19]。此外，Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MLE可提高大鯢消化酶活性并改善腸道發(fā)育狀況，從而促進其對營養(yǎng)物質的消化吸收和利用。因此，在本試驗中，MLE提高斷奶仔豬腸道內(nèi)脂肪酶的活性和粗脂肪的表觀消化率與MLE中含有的桑葉黃酮等活性物質有關。

3.3 MLE對斷奶仔豬抗氧化能力的影響

研究表明，桑葉對動物機體中游離的氧自由基、羥自由基和脂類自由基具有較好的清除作用；其中，桑葉中所含的多糖、多酚和黃酮成分除了本身就具有較強的抗氧化作用外，還可直接清除體內(nèi)超氧離子自由基和脂質過氧化物，尤其是對酶類物質不能清除的羥自由基具有較好的清除效果，因此是桑葉發(fā)揮抗氧化活性的主要成分[15,21-23]。盧樺等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加7.5 g/kg的MLE能夠顯著提高大鯢肝臟中T-AOC和T-SOD的活性，同時降低了肝臟中MDA的含量，從而提高了肝臟的抗氧化能力。Andallu等[24]在Wistar大鼠飼糧中添加25%的桑葉粉，發(fā)現(xiàn)其能夠降低大鼠血漿中谷胱甘肽的含量和CAT、GSH-Px、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，表現(xiàn)出了較強的抗氧化作用。與上述研究結果基本一致，在本試驗中，與對照組相比，飼糧添加MLE顯著提高了斷奶仔豬血漿中GSH-Px的活性和T-AOC，同時也顯著提高了肝臟中的T-SOD活性，表明MLE可以增強斷奶仔豬血漿和肝臟中抗氧化酶的活性，從而提高仔豬機體的抗氧化能力。

3.4 MLE對斷奶仔豬免疫功能的影響

MLE對動物機體具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。盧樺等[13]研究表明，在飼糧中添加7.5 g/kg的MLE能夠使大鯢的血漿IgM含量顯著高于對照組。雷春龍等[9]在蛋雞飼糧中添加0.4%和0.8%桑枝葉提取物，發(fā)現(xiàn)其均可提高羅曼粉蛋雞的產(chǎn)蛋率以及血清中IgA、IgM、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子含量。研究證實，在MLE中，桑葉多酚和桑葉多糖是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要活性物質[25]。沈維治等[26]研究發(fā)現(xiàn)，MLE具有明顯的抑菌作用，且其抑菌活性與桑葉多酚的含量成顯著劑量效應關系。Horng等[27]研究表明，桑葉多酚不僅能通過下調(diào)炎癥細胞因子及促炎介質的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)機體的炎癥反應，還可通過抑制核轉錄因子-κB(NF-κB)信號途徑誘導巨噬細胞活化參與的炎癥反應，從而提高機體免疫功能。桑葉多糖對動物機體的免疫調(diào)節(jié)則主要體現(xiàn)為提高機體的體液免疫和細胞免疫[28]。研究表明，桑葉多糖能增強小鼠單核巨噬細胞的吞噬能力，并能直接促進脾淋巴細胞的有絲分裂，激活T細胞[29]。與上述研究結果相一致，本試驗結果顯示，與對照組相比，飼糧添加1 000 g/t的MLE顯著降低了斷奶仔豬血漿中TNF-α的含量，并顯著提高了血漿中IgA和IgM的含量。TNF-α是一種促炎細胞因子，由巨噬細胞和淋巴細胞等細胞分泌，在體內(nèi)具有介導炎癥反應以及調(diào)節(jié)免疫等功能[30]。IgA、IgG和IgM則是機體主要的免疫球蛋白，具有抗體活性，可直接參與動物機體的體液免疫反應。本試驗結果表明，MLE通過降低斷奶仔豬機體的炎癥反應，并提高其體液免疫，從而使仔豬機體的免疫功能得到加強。MLE對仔豬的這種免疫調(diào)節(jié)功能可能與MLE中的桑葉多酚和桑葉多糖等活性物質密切相關。

4 結 論

飼糧添加1 000 g/t的MLE對斷奶仔豬生長性能無顯著影響，但可降低斷奶仔豬腹瀉率，提高其腸道內(nèi)脂肪酶的活性和粗脂肪的表觀消化率，并能提高斷奶仔豬機體的抗氧化能力及免疫功能。