β-羥基-β-甲基丁酸在水產(chǎn)動物中應(yīng)用的研究進展

楊晨斌 閻斌倫,3 高 煥,3 牟 華,3*

(1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室/江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222005；3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222005)

β-羥基-β-甲基丁酸(β-hydroxy-β-methylbutyrate，HMB)是必需氨基酸亮氨酸的中間代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在于自然界的各種動植物體內(nèi)，目前主要通過人工化學(xué)合成的方法獲得。HMB因具有促進動物體肌肉生長、延緩肌肉疲勞、防止肌肉萎縮、增加免疫力等作用而被作為營養(yǎng)補充劑廣泛應(yīng)用。2011年，我國衛(wèi)生部批準β-羥基-β-甲基丁酸鈣(β-hydroxy-β-methylbutyrate calcium，HMB-Ca)作為食品添加劑進入新資源食品目錄。隨著高密度集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷攀升，但水產(chǎn)養(yǎng)殖動物表現(xiàn)出生長緩慢、肌肉品質(zhì)和免疫力下降等問題[1-3]，嚴重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。目前，越來越多的綠色添加劑被應(yīng)用于水產(chǎn)動物飼料中以改善動物的生長性能和免疫功能等[4-6]。HMB作為飼料添加劑在提高水產(chǎn)動物生長性能和抗病力等方面也表現(xiàn)出了較好的效果[7-10]。本文綜述了HMB的作用機制及其對水產(chǎn)動物生長性能、蛋白質(zhì)代謝、脂質(zhì)代謝、肌肉品質(zhì)和免疫功能的影響，并與在畜禽等其他動物中的研究做比較，分析了目前HMB在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用進展與不足。

1 HMB的代謝及其作用機制

亮氨酸是動物的必需氨基酸之一，絕大部分的亮氨酸會通過周轉(zhuǎn)用于合成自身的蛋白質(zhì)，只有少量的亮氨酸(大約5%)會在體內(nèi)經(jīng)過代謝后最終轉(zhuǎn)化為HMB[11]。因為HMB有許多與亮氨酸相似的作用，故HMB被認為是亮氨酸發(fā)揮作用的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物。HMB合成的第1步是亮氨酸在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下被轉(zhuǎn)氨為α-酮異己酸(α-ketoisocaproate acid，KIC)，這一步主要發(fā)生在肝臟外組織中(如骨骼肌等)。大部分KIC被轉(zhuǎn)運至肝臟線粒體后通過支鏈酮酸脫氫酶的作用產(chǎn)生異戊酰輔酶A再生成三羧酸循環(huán)的中間代謝物乙酰輔酶A和乙酰乙酸[12]。只有極少部分KIC通過KIC雙加氧酶代謝產(chǎn)生HMB[11-12]。除隨尿液排出以外，體內(nèi)的部分HMB生成β-羥基-β-甲基丁酸-CoA后經(jīng)酯化轉(zhuǎn)化為β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A(β-hydroxy-β-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)，最終合成膽固醇[12]。HMB的代謝過程如圖1所示。

AKG：α-酮戊二酸α-ketoglutarate；BCAT：支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶branched chain amino acid transferase；BCKD：支鏈酮酸脫氫酶branched chain ketoacid dehydrogenase；Glu：谷氨酸 glutamic acid；HMB：β-羥基-β-甲基丁酸β-hydroxy-β-methylbutyrate；KIC：α-酮異己酸α-ketoisocaproate acid；Leu：亮氨酸leucine。

HMB具有促進動物體肌肉生長、延緩肌肉疲勞、防止肌肉萎縮、增強免疫功能等作用，因而被廣泛應(yīng)用于運動補劑、健身產(chǎn)品以及高端保健食品等。HMB發(fā)揮作用的可能機制(圖2)包括：1)直接或間接增加肌肉細胞中能量產(chǎn)生，增強代謝效率。攝食HMB產(chǎn)生的HMG-CoA會在HMG-CoA合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A進而增加三羧酸循環(huán)的中間代謝物乙酰輔酶A含量，直接增加ATP的產(chǎn)生[12]；HMB還通過增加線粒體生物合成提高能量代謝，Stancliffe等[14]發(fā)現(xiàn)HMB可使C2C12細胞的線粒體生物合成增加50%。2)提高肌肉細胞膜的完整性。受損傷的肌肉細胞可能不能夠產(chǎn)生足夠的HMG-CoA以維持正常的細胞功能[15]，而HMB可通過轉(zhuǎn)化為HMG-CoA合成膽固醇進而促進肌肉細胞膜的修復(fù)[13]。3)上調(diào)生長激素(growth hormone，GH)和胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)的表達[16]，誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細胞和成肌因子的激活，促進肌肉生長和再生[17-18]。4)通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路增加蛋白質(zhì)合成。HMB可誘導(dǎo)小鼠C2C12細胞mTOR、p70核糖體蛋白S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1，p70S6K1)和真核起始因子4E結(jié)合蛋白-1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein-1，4EBP-1)表達上調(diào)以及蛋白質(zhì)合成增加[19]。5)通過調(diào)控蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)抑制蛋白質(zhì)降解。離體和在體試驗均證明HMB可抑制泛素-蛋白酶體途徑進而減少蛋白質(zhì)降解[20-21]；此外，HMB還會抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)和溶酶體系統(tǒng)誘導(dǎo)的自噬過程，減弱骨骼肌蛋白質(zhì)降解[22]。6)調(diào)控脂質(zhì)代謝。通過調(diào)節(jié)腸道菌群和激活腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α，AMPKα)通路，抑制脂肪酸合成，促進脂肪分解和脂肪酸氧化，從而抑制動物脂肪沉積和肥胖[23-24]。7)增強機體免疫功能。畜禽動物和魚類中均證明HMB通過提高吞噬細胞的吞噬活性、溶酶體活性以及免疫球蛋白含量等增強動物免疫力[8,25]。

AMPKα：腺苷酸活化蛋白激酶α AMP-activated protein kinase α；GH：生長激素growth hormone；HMB：β-羥基-β-甲基丁酸β-hydroxy-β-methylbutyrate；IGF-Ⅰ：胰島素樣生長因子-Ⅰ insulin-like growth factor-Ⅰ；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mammalian target of rapamycin。

2 HMB在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用

HMB在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用和研究主要集中在探究其對魚類生長性能、蛋白質(zhì)代謝和免疫功能的影響，而對脂質(zhì)代謝和肌肉品質(zhì)影響的研究較少(表1)。

表1 β-羥基-β-甲基丁酸在水產(chǎn)動物中應(yīng)用的研究

*表示飼料中β-羥基-β-甲基丁酸的適宜添加水平。

2.1 HMB對水產(chǎn)動物生長性能的影響

飼料中添加0.1% HMB-Ca使大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)幼魚的終末體重增加了13.3%，特定生長率增加了5.88%，對其存活率、攝食率和飼料效率均沒有顯著影響[7]。同時離體試驗也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加3種不同濃度(25、50和100 μg/mL)的HMB-Ca均可顯著提高大菱鲆肌肉細胞的增殖率，即促進了大菱鲆肌肉細胞的生長[7]。相似地，飼料中添加0.1% HMB也顯著增加了大黃魚(Larimichthyscrocea)的增重率和特定生長率[8]。然而，飼料中添加HMB未能顯著提高尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[30]和雜交條紋鱸(Moronechrysops×M.saxatilis)[31]的生長性能。王磊[7]推測不同的試驗結(jié)果可能是由于不同的試驗對象和試驗條件造成的。以尼羅羅非魚為研究對象的養(yǎng)殖試驗僅進行了2周，以雜交條紋鱸為研究對象的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，魚的終末體重僅比初始體重增加了1倍。這可能是由于養(yǎng)殖時間太短和體重增加太少的原因，沒有足夠的空間表現(xiàn)出HMB的有益作用，輕微的有益趨勢在生物統(tǒng)計學(xué)上并未顯現(xiàn)出顯著差異。大量研究已證明，飼料中適宜水平的HMB可提高畜禽動物的生長性能。在巴馬香豬飼糧中添加0.13% HMB顯著提高了其生長性能[33]。Qiao等[34]研究表明，飼糧中添加0.1% HMB-Ca可顯著改善肉雞的生長性能，促進胸肌發(fā)育，且在生長初期效果較為明顯，這可能與血清中甲狀腺激素水平的提高有關(guān)。然而，HMB對蝦蟹類等其他水產(chǎn)動物生長性能的影響還未見報道。

2.2 HMB對水產(chǎn)動物蛋白質(zhì)代謝的影響

研究表明，HMB可通過調(diào)控mTOR信號通路以及泛素-蛋白酶體途徑等蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)進而影響機體蛋白質(zhì)代謝。在大黃魚中的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.1%和0.8% HMB可提高肌肉中TOR和IGF-Ⅰ的mRNA表達水平，同時降低肌肉中泛素連接酶肌環(huán)指蛋白-1(muscle ring finger-1，Murf-1)的mRNA表達水平，即促進了肌肉蛋白質(zhì)合成而抑制了其分解[8]。相似地，飼料中添加0.1% HMB-Ca顯著降低了大菱鲆幼魚肌肉中泛素連接酶Murf-1和肌肉萎縮盒F基因(muscle atrophy F-box，MAFbx/Atrogin-1)的mRNA表達水平[7]，即抑制了蛋白質(zhì)泛素化過程，降低了肌肉蛋白質(zhì)分解。在哺乳動物中也得到了類似的結(jié)果，HMB誘導(dǎo)小鼠成肌細胞(C2C12)mTOR、p70S6K1和4EBP-1表達上調(diào)以及蛋白質(zhì)合成增加，而且這一過程可被雷帕霉素(mTOR抑制劑)抑制[19]。Aversa等[35]研究發(fā)現(xiàn)，以HMB處理體外培養(yǎng)的小鼠肌管細胞能夠降低Murf-1和MAFbx/Atrogin-1的mRNA及蛋白表達水平。HMB和亮氨酸對機體蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控途徑存在許多重疊或相似之處，在C2C12細胞中的研究證明，HMB抑制饑餓誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的效果優(yōu)于亮氨酸[36]。最近的研究甚至發(fā)現(xiàn)，亮氨酸在C2C12細胞中發(fā)揮抑制蛋白質(zhì)降解作用需要轉(zhuǎn)化為HMB實現(xiàn)[37]。然而在水產(chǎn)動物中，HMB和亮氨酸調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的效果是否存在差異以及亮氨酸是否也需要轉(zhuǎn)化為HMB才能發(fā)揮該調(diào)控作用尚未可知，仍需進一步探究。

2.3 HMB對水產(chǎn)動物脂質(zhì)代謝的影響

除了調(diào)控機體蛋白質(zhì)代謝外，HMB還影響動物脂質(zhì)代謝。然而，目前有關(guān)HMB對水產(chǎn)動物脂質(zhì)代謝影響的報道較少。在大黃魚中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.1% HMB會顯著增加魚體血清甘油三酯和肌肉粗脂肪含量，而對血清中總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量無顯著影響[8]。相似地，在雜交條紋鱸飼料中添加1 000 mg/kg HMB顯著增加了魚體脂肪含量[31]。然而，飼料中添加0.1% HMB-Ca對大菱鲆幼魚的魚體粗脂肪含量無顯著影響[7]。與水產(chǎn)動物中的結(jié)果不同，在畜禽動物中發(fā)現(xiàn)HMB可抑制脂肪沉積，提高瘦肉率。如飼糧中添加HMB減少了肉雞[34]、豬[33]等動物的脂肪沉積。此外，飼糧HMB還會增加豬肌肉中n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)含量[38-39]，即改善肌肉脂肪酸組成。最近在小鼠和巴馬香豬中的研究證明，HMB通過調(diào)節(jié)腸道菌群和激活A(yù)MPKα通路，抑制脂肪酸合成，促進脂肪分解和脂肪酸氧化，從而抑制動物脂肪沉積和肥胖[23-24]。此類研究在水產(chǎn)動物中均未見報道，因此HMB對水產(chǎn)動物脂質(zhì)代謝的影響及其機制有待深入挖掘。

2.4 HMB對水產(chǎn)動物肌肉品質(zhì)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，HMB可以改善動物肌肉品質(zhì)。飼料中添加0.1%和0.2% HMB顯著提高了大黃魚肌肉硬度，0.05%和0.10% HMB顯著增加了肌肉持水力[8]。同樣，飼喂0.1% HMB-Ca顯著增加了大菱鲆幼魚的硬度、彈性和咀嚼性[7]。動物肌肉的質(zhì)構(gòu)參數(shù)(硬度、彈性和咀嚼性等)可以反映肌肉質(zhì)地特性，而質(zhì)地的好壞是評價魚肉品質(zhì)的一個關(guān)鍵指標，也是消費者關(guān)注的重要感官指標，同時在水產(chǎn)品加工流通領(lǐng)域會顯著影響魚肉的加工性能。研究表明，肌纖維作為構(gòu)成肌肉組織的基本單位，其直徑、數(shù)目和類型是肌肉生長和品質(zhì)形成的生物學(xué)基礎(chǔ)，和肉質(zhì)性狀密切相關(guān)，被認為是肌肉質(zhì)地的重要決定因素[40-41]。研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維的密度與肌肉硬度、彈性和咀嚼性等存在正相關(guān)關(guān)系[42-43]。飼料中0.1% HMB-Ca顯著降低了大菱鲆幼魚的肌纖維橫截面積，意味著單位面積內(nèi)存在更多的肌纖維，肌纖維更加細密，這可能是HMB-Ca改善大菱鲆質(zhì)地特性的原因[7]。

根據(jù)動物骨骼肌肌纖維的形態(tài)、收縮功能和代謝特征可將其分為兩大類，即氧化型(Ⅰ型)纖維和酵解型(Ⅱ型)纖維[44]。不同類型的肌纖維因具有不同的收縮速率和代謝能力而直接影響肌肉品質(zhì)，當肌肉中酵解型肌纖維比例較高時，其較高的糖酵解能力和ATP酶活性會增加肌肉pH下降的速度和程度，進而導(dǎo)致肌肉持水力和質(zhì)地較差[41]。哺乳動物中的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中補充KIC會導(dǎo)致生長豬肌肉支鏈氨基酸失衡，促進肌纖維向酵解型轉(zhuǎn)變，而飼糧添加HMB會促進更多氧化型肌纖維的生成，并促進肌肉生長，尤其是氧化型骨骼肌，這些作用可能與HMB激活A(yù)MPKα-沉默信息調(diào)節(jié)因子1-過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(AMPKα-silent information regulator 1-peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，AMPKα-Sirt1-PGC-1α)軸和線粒體的生物合成有關(guān)[45]。然而，水產(chǎn)動物中缺乏HMB對骨骼肌肌纖維類型影響的報道。

2.5 HMB對水產(chǎn)動物免疫功能的影響

大量研究表明，HMB能改善畜禽動物的免疫功能。Peterson等[25]在體外培養(yǎng)雞巨噬細胞系時添加HMB能夠顯著增強巨噬細胞的吞噬功能，促進細胞增殖，進而改善仔雞的免疫功能。在母豬妊娠后期飼糧中添加15 mg/kg HMB能顯著提高母豬初乳中免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的含量[46]。Zheng等[47]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.60% HMB改善了脂多糖脅迫下仔豬的腸道完整性、功能和微生物區(qū)系，表明HMB可以緩解免疫應(yīng)激引起的腸道功能紊亂。

雖然水生動物的免疫系統(tǒng)與陸生動物不同，但研究表明HMB也能提高水產(chǎn)動物的免疫功能。Estévez等[27]通過細胞培養(yǎng)和養(yǎng)殖試驗表明，HMB能誘導(dǎo)大鱗大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)細胞系多種非特異性免疫基因的表達，而攝食HMB能顯著增加大西洋鮭(Salmosalar)幼魚鰓中抗菌肽的表達，但不影響皮膚中抗菌肽的表達。大黃魚中的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加HMB可顯著提高魚體血清溶菌酶活性以及補體和免疫球蛋白的含量，同時顯著上調(diào)腸道抑炎癥因子白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的基因表達，而下調(diào)促炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNFα)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的表達[8]。Siwicki等[23]通過離體試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加10～100 μg/mL HMB顯著增加了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和鯉魚(Cyprinuscarpio)吞噬細胞的活性，同時顯著提高了伴刀豆球蛋白A和脂多糖刺激的T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖能力。飼料中添加HMB顯著增加了虹鱒多形核白細胞和單個核細胞的呼吸爆發(fā)活性、血漿溶菌酶活性以及血清免疫球蛋白含量，同時提高了虹鱒對殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)感染的抵抗力[9]。在白梭吻鱸(Sanderlucioperca)中也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加50 mg/kg HMB可顯著提高其吞噬細胞的吞噬活性和魚體對魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)感染的抵抗力[10]以及血漿溶菌酶活性和魚體對殺鮭氣單胞菌感染的抵抗力[26]。相似地，體內(nèi)外試驗均證明HMB可顯著提高歐洲巨鯰(Siluriusglanis)的免疫功能[28-29]。然而，也有報道不支持此類結(jié)論，如飼料中添加HMB并未顯著提高尼羅羅非魚感染海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)后抗體的產(chǎn)生以及存活率[30]；HMB不能提高雜交條紋鱸幼魚頭腎細胞內(nèi)外超氧陰離子產(chǎn)生以及血清溶菌酶活性[31]。這些不同結(jié)果可能與不同的物種、生長階段以及養(yǎng)殖周期等有關(guān)。

3 小結(jié)與展望

HMB是一種非常有應(yīng)用前景的營養(yǎng)補充劑，已經(jīng)在臨床和動物中有了大量的試驗及應(yīng)用，且已證明了其安全性。HMB具有多種有益作用，包括促進肌肉蛋白質(zhì)合成、抑制肌肉蛋白質(zhì)降解、提高肌肉品質(zhì)和免疫力等。同時，HMB是一種無氮補劑，應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中對水體的污染小，不會造成水體中氨氮和亞硝酸含量的升高。因此，HMB作為飼料添加劑，在提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生長性能、肌肉品質(zhì)和免疫功能方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。HMB的作用機制非常復(fù)雜，目前還在探索階段，需要大量的試驗驗證。HMB在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用和研究非常有限，許多在畜禽動物中常見的研究在水產(chǎn)動物尤其是甲殼動物中卻鮮有報道，未來需要大量的研究來驗證HMB在水產(chǎn)動物中的作用及其機制。