不同抗體檢測方法對豬口蹄疫疫苗臨床免疫效果的評估

譚 濤 任靜雷 倪春霞 辛俊寶 張淑剛*

（1禮藍 （上海）動物保健有限公司，上海 200003；2楊凌金海生物技術(shù)有限公司，陜西楊凌 712100）

口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、可快速遠距離傳播的烈性動物疫病,在豬、牛、羊等偶蹄動物中易廣泛傳播,且是一類人畜共患傳染病[1]。許多國家的口蹄疫呈地方性流行或大流行趨勢,而疫苗接種可以限制疫病的流行并減少養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失。從口蹄疫疫苗的研究和臨床應(yīng)用情況看,當(dāng)前口蹄疫的控制仍然以注射滅活疫苗為主[2-4]。

對于基層豬場而言,疫苗的選擇和評估主要看免疫臨床表現(xiàn),具體來說就是注射疫苗后是否有副反應(yīng)(安全性)和免疫保護率(效力)。養(yǎng)殖戶習(xí)慣于用肉眼觀察到的免疫保護率評估口蹄疫疫苗的免疫,這種方法不夠科學(xué)?？谔阋邷缁钜呙缫泽w液免疫為主,可以用抗體檢測(陽性率、滴度)評估免疫效果。目前國內(nèi)常用口蹄疫抗體檢測方法主要有病毒中和試驗(VNT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)2種方法,其中ELISA法又分為液相阻斷法、固相競爭法和間接法,試劑盒生產(chǎn)廠家很多。為了解豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗的免疫效果,以及臨床上不同抗體檢測方法(試劑盒)的差異,本試驗選用常用的5個品牌ELISA抗體檢測試劑盒及病毒中和試驗共4種檢測方法,檢測豬場免疫口蹄疫O型和A型疫苗后的抗體水平,為生產(chǎn)一線評估口蹄疫疫苗的免疫效果提供數(shù)據(jù)參考[5,6]。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇廣東省佛山市某集團育肥場65日齡左右健康仔豬300頭。

1.2 試驗材料

豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-Ⅲ株),由楊凌金海生物技術(shù)有限公司提供。O型、A型ELISA抗體檢測試劑盒分別購自蘭州獸研生物科技有限公司(以下簡稱“蘭州獸研生物”)、愛德士(IDEXX)、麥迪安(MEDIAN)、金諾(JNT)、標(biāo)馳澤惠(BCZH)。

1.3 免疫及采血方案

根據(jù)豬場免疫程序,對選定的試驗豬在65日齡左右進行第一次免疫,間隔30 d后進行第二次免疫,第一次免疫前、第二次免疫前和第二次免疫后30 d,每次固定相同欄位隨機選取15頭豬進行采血并分離血清,用于抗體檢測。

1.4 抗體檢測方法及結(jié)果判定

抗體檢測采用液相阻斷ELISA、固相競爭ELISA、間接ELISA和病毒中和試驗等4種檢測方法,檢測試劑盒包含臨床常用的5個品牌,各試劑盒名稱、方法類別及陽性判定見表1。

表1 抗體檢測試劑盒類別

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA抗體檢測

對第一次免疫前、第二次免疫前和第二次免疫后30 d相同欄位試驗豬各采集血清15份,用蘭獸研、愛德士(EDEXX)、麥迪安(MEDIAN)、金諾(JNT)、標(biāo)馳澤惠(BCZH)5種ELISA抗體檢測試劑盒進行檢測,陽性率結(jié)果見圖1、圖2。

由圖1、圖2可知,第一次免疫后O型和A型抗體都迅速上升,除JNT的A型外,其他抗體陽性率均在85%～100%,其他試劑盒檢測顯示第二次免疫后抗體陽性率均達到100%。5種檢測試劑盒檢測免疫后O型、A型抗體變化趨勢相似,符合率較高,在一定程度上都能反映免疫后抗體產(chǎn)生的變化規(guī)律。

圖1 不同檢測方法口蹄疫O型抗體陽性率

圖2 不同檢測方法口蹄疫A型抗體陽性率

O型和A型口蹄疫疫苗免疫前的抗體屬于母源抗體,第一次免疫前不同試劑盒之間的陽性率符合度比免疫后抗體陽性率符合度的差異要大,可能與各試劑盒的敏感性有關(guān)。用MEDIAN試劑盒檢測的母源抗體陽性率比其他方法檢測結(jié)果明顯高,除上述原因外,對該方法或該次檢測應(yīng)進一步驗證。本試驗中,相比較于

其他試劑盒,JNT的A型試劑盒檢出的抗體陽性率略低,在其他臨床檢測中也發(fā)現(xiàn)過類似情況,可能是包被的抗原與目前A型毒株的同源性偏低有關(guān),但也不能排除試劑盒批次間或反應(yīng)板間的差異[7]。

2.2 中和抗體檢測

用微量細胞病毒中和試驗檢測采集的血清中口蹄疫抗體的試驗結(jié)果見圖3。微量細胞病毒中和試驗中,檢測到抗體即為陽性,代表有一定的保護力,但通常認為lgSN值≥1.51(lg32＝1.51)對豬只有較好的保護力。由圖3的免疫前后抗體變化趨勢可知,第一次免疫口蹄疫疫苗后其抗體水平迅速上升,抗體滴度lgSN＞1.51；第二次免疫口蹄疫疫苗后其抗體滴度lgSN＞2.0,說明此時的抗體水平對豬只產(chǎn)生了良好的保護力。ELISA抗體與之有相似的變化規(guī)律,也進一步證實了該口蹄疫疫苗的免疫效果和5種ELISA抗體檢測試劑盒對臨床檢測的適用性。

圖3 病毒中和試驗 （VNT）抗體滴度

3 討論

全球口蹄疫主要在非洲、中東、亞洲及南美洲部分地區(qū)流行?？谔阋卟《镜?個血清型中,O型和A型毒株的流行區(qū)域最廣。2021年,東南亞地區(qū)口蹄疫疫情形勢依舊復(fù)雜,柬埔寨、馬來西亞、緬甸、泰國和越南等國均有疫情發(fā)生,且引發(fā)疫情的毒株有多種,對我國口蹄疫的防控存在一定威脅[1,8]。目前我國防控口蹄疫主要采用以免疫控制為主的策略,疫苗免疫是有效防控口蹄疫的綜合措施之一,也是一種經(jīng)濟有效的方式[4]?？谔阋吲R床免疫效果評估主要衡量群體免疫后抗體的合格率?！?022年國家動物疫病免疫技術(shù)指南》在免疫效果評價中推薦了ELISA抗體檢測方法,并指出“免疫合格個體數(shù)量占免疫群體總數(shù)不低于70%的,判定為群體免疫合格”。

本試驗用金海生物提供的豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-Ⅲ株) 免疫65日齡左右仔豬,用目前臨床常用的5種口蹄疫抗體檢測試劑盒檢測免疫后抗體,除JNT的A型抗體外,其他疫苗第一次免疫后的抗體陽性率在85.7%～100%之間,第二次免疫后的陽性率為100%,證明疫苗免疫的有效性,也反映出不同檢測方法的試劑盒之間存在微小差異?？谔阋逧LISA抗體檢測試劑盒既有國產(chǎn)品牌也有進口品牌,包被的反應(yīng)抗原和使用的酶標(biāo)抗體也存在差異,這種差異會導(dǎo)致檢測同一份血清或不同毒株免疫后抗體的陽性率出現(xiàn)一定差異。

口蹄疫病毒中和抗體試驗(VNT)是口蹄疫抗體檢測的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”,本試驗用微量細胞病毒中和試驗對血清抗體進行了檢測,發(fā)現(xiàn)各ELISA抗體陽性率與該方法有較高的符合率,說明目前ELSIA檢測方法具有良好的適用性。本試驗后續(xù)也采用Mya98、Cathay變異株、印度2001和A型流行毒株對金海生物口蹄疫疫苗免疫抗體進行了交叉中和試驗,結(jié)果顯示金?？谔阋咭呙鐚δ壳傲餍卸局昃哂辛己玫慕徊姹Ｗo作用。

4 小結(jié)

試驗結(jié)果顯示,市面上的口蹄疫疫苗對豬群均具有較高的保護效果。養(yǎng)豬企業(yè)可以根據(jù)自己的生產(chǎn)經(jīng)營狀況,選擇合適的口蹄疫疫苗。