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      病理形態(tài)學與乳腺癌HER2過表達/擴增的關(guān)系

      2022-07-11 01:36:46熊怡凡王曉燕黃蓉飛龍小藝張君莉蔣安科
      北華大學學報(自然科學版) 2022年3期
      關(guān)鍵詞:切片沖洗陽性率

      熊怡凡,王曉燕,黃蓉飛,龍小藝,張君莉,蔣安科

      (成都醫(yī)學院臨床醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,四川 成都 610500)

      近年來,乳腺癌發(fā)病呈現(xiàn)逐年增長及年輕化趨勢,其病因尚未完全明確,目前認為,遺傳、飲食、激素及外界理化因素均與其發(fā)病有關(guān)[1].隨著分子生物學、腫瘤免疫學的發(fā)展,惡性腫瘤的相關(guān)研究已步入分子水平階段,故在諸多病因中,激素受體及基因的表達逐漸受到關(guān)注.乳腺上皮細胞在致癌因子作用下出現(xiàn)基因突變,發(fā)生無序的惡性增殖,并隨淋巴及血液循環(huán)在全身播散,形成遠處轉(zhuǎn)移,影響預(yù)后[2].既往研究[3]發(fā)現(xiàn):在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中存在諸多細胞因子參與,這些細胞因子可在一定程度上反映腫瘤的發(fā)展程度及預(yù)后情況.人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)為乳腺癌重要的原癌基因,HER2蛋白參與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展,如今針對HER2基因與蛋白的相關(guān)研究已成為熱點[4].本研究旨在探討乳腺癌病理形態(tài)學與HER2基因擴增及蛋白過表達的關(guān)系.

      1 材料與方法

      1.1 材 料

      納入2018年6月—2021年6月成都醫(yī)學院臨床醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院90例手術(shù)切除的乳腺癌組織標本,獲取的乳腺癌組織標本在離體1 h內(nèi)采用10%福爾馬林固定、石蠟包埋.

      納入標準:患者為女性;初發(fā)病例;病理確診為乳腺癌.

      排除標準:患者術(shù)前曾接受放療、新輔助化療等其他治療;患者病例資料不完整.

      1.2 方 法

      1.2.1 HER2基因擴增檢測

      采用熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)進行HER2基因擴增檢測.將石蠟包埋的乳腺癌組織連續(xù)切片,獲得4 μm切片,置于載玻片上,65 ℃烘烤過夜;組織切片采用二甲苯脫蠟處理,分別浸于無水乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各2 min,去離子水浸泡3 min,吸除多余水分;切片采用30%酸性硫酸鈉處理30 min;2倍檸檬酸鈉緩沖液中漂洗2次,5 min/次;0.4 mL蛋白酶K儲存液(20 mg/mL)用檸檬酸鈉緩沖液稀釋,獲取蛋白酶K工作液,將組織切片浸泡其中,37 ℃孵育30 min,再用2倍檸檬酸鈉緩沖液中漂洗2次,5 min/次;組織切片置于0.1 mmol/L鹽酸中浸泡10 min,再用2倍檸檬酸鈉緩沖液中漂洗2次,5 min/次;組織切片用-20 ℃預(yù)冷的梯度酒精脫水后用丙酮浸泡2 min,自然干燥后加熱至56 ℃;在73 ℃的70%甲酰胺變性液中浸泡5 min,采用預(yù)冷的梯度酒精脫水,自然干燥后預(yù)熱5 min,于組織標本雜交區(qū)域加入10 μL探針復(fù)合物,上蓋封邊,置于濕盒中42 ℃過夜雜交;分別置于50%甲酰胺、2倍檸檬酸鈉緩沖液、0.1% NP-40液、70%乙醇中,自然干燥后加入10 μL DAPI顯色液,封片,熒光鏡下觀察.結(jié)果判讀:紅色信號計數(shù)/綠色信號計數(shù)>2.2為HER2基因擴增,<1.8為不擴增,18~2.2為不確定[5].

      1.2.2 HER2蛋白、雌激素受體、孕激素受體表達檢測

      采用免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)進行HER2蛋白、雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)表達檢測.將石蠟包埋切片的乳腺癌組織恒溫(68 ℃)烘烤30 min,二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水;3%過氧化氫孵育10 min,PBS沖洗3次,5 min/次;置于枸櫞酸抗原修復(fù)液,高壓鍋加熱,沸騰15 min,冷卻至室溫,蒸餾水漂洗2次,PBS沖洗3次,5 min/次;37 ℃下羊血清工作液中封閉30 min,倒除多余液體;加入50 μL一抗,4 ℃孵育過夜,PBS沖洗3次,5 min/次;倒除PBS,滴加50 μL生物素標記的二抗,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次,5 min/次;倒除PBS,加入50 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次,5 min/次;倒除PBS,滴加50 μL新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺溶液,顯微鏡下觀察染色3 min,沖洗;蘇木精復(fù)染,沖洗,0.1%鹽酸酒精分化,沖洗,PBS返藍;梯度酒精脫水,干燥封片,光鏡下觀察.結(jié)果判讀:HER2表達-:10%以內(nèi)腫瘤組織細胞膜呈弱棕黃色,或無棕黃染色;+:10%以上腫瘤部分細胞膜呈弱棕黃色;++:10%以上細胞膜呈現(xiàn)完整的弱至中等強度棕黃色;+++:30%以上細胞膜全層高強度棕黃色,以+++為陽性結(jié)果.ER、PR表達-:陽性細胞率5%以內(nèi);+:陽性細胞率5%~25%;++:陽性細胞率25%~50%;+++:陽性細胞率超過50%[6].

      1.3 觀察指標

      乳腺癌組織樣本中HER2基因擴增及HER2蛋白表達情況;采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析FISH、IHC兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性,并分析HER2基因擴增/蛋白過表達與患者病理形態(tài)學特征的關(guān)系.

      1.4 統(tǒng)計學分析

      2 結(jié) 果

      2.1 乳腺癌組織樣本HER2基因擴增情況

      90例乳腺癌組織標本中,F(xiàn)ISH檢出HER2基因擴增32例,陽性率為35.56%.見表1.

      表1 乳腺癌組織樣本HER2基因擴增情況Tab.1 HER2 gene amplification in breast cancer tissue samples (n=90)

      2.2 乳腺癌組織樣本HER2蛋白表達情況

      90例乳腺癌組織標本中,IHC檢出HER2蛋白過表達24例,陽性率為26.67%.見表2.

      表2 乳腺癌組織樣本HER2基因擴增情況Tab.2 HER2 gene amplification in breast cancer tissue samples (n=90)

      2.3 FISH、IHC檢測結(jié)果相關(guān)性分析

      Spearman分析顯示:FISH、IHC檢測結(jié)果存在相關(guān)性(P<0.05).見表3.

      表3 FISH、IHC檢測結(jié)果相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of FISH and IHC test results

      2.4 HER2基因擴增/蛋白過表達與患者病理形態(tài)學特征的關(guān)系

      HER2基因擴增、蛋白過表達陽性率在不同年齡階段、月經(jīng)狀況、病理類型、TNM分期患者中差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在不同組織學分級、腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、雌激素受體(ER)表達情況、孕激素受體(PR)表達情況的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).見表4.

      3 討 論

      乳腺癌的預(yù)后主要取決于早期診斷及有效的治療方案,尤其對于早期患者而言,除了腫瘤分級等信息之外,明確其個體生物學信息對于治療方案的選擇具有重要意義[7].

      HER2是在諸多惡性腫瘤中導(dǎo)致癌變頻率較高的原癌基因.HER2原癌基因位于17q21染色體,是一種有酪氨酸激酶活性的生長因子受體,在正常狀況下具有調(diào)節(jié)組織生長的作用,但當其基因結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變時,可能影響細胞分裂進程[8].HER2可抑制腫瘤細胞凋亡,并通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子的表達而促進血管新生,進而促進腫瘤生長,還可使腫瘤細胞具有更強的侵襲性,導(dǎo)致腫瘤發(fā)展[9].既往[10-11]報道顯示:乳腺癌患者中約有30%存在HER2基因擴增及蛋白過表達,這些患者平均生存期相對較短,且對三苯氧胺等常規(guī)治療藥物也表現(xiàn)出明顯的耐藥性,預(yù)后更差,但其對紫杉類、蒽環(huán)類藥物及曲妥珠單抗聯(lián)合化療反應(yīng)較好.FISH為檢測HER2基因擴增的金標準,IHC為檢測HER2蛋白表達的最常用手段.本研究顯示:90例乳腺癌組織標本中,F(xiàn)ISH檢出HER2基因擴增32例,陽性率為35.56%;IHC檢出HER2蛋白過表達24例,陽性率為26.67%,與既往報道[12]相符.Spearman分析顯示,F(xiàn)ISH、IHC檢測結(jié)果存在相關(guān)性,故而可將HER2基因擴增或HER2蛋白表達+++作為HER2陽性標志,以此指導(dǎo)臨床治療,對于HER2蛋白表達+、++者建議行FISH檢測.

      據(jù)相關(guān)[13]報道,乳腺癌的年輕患者預(yù)后不理想,但HER2基因擴增/蛋白過表達與年齡的關(guān)系在諸多報道中結(jié)論不一.宋天豹等[14]針對原發(fā)性乳腺癌的報道顯示,HER2過表達與患者年齡呈負相關(guān)關(guān)系,且可作為HER2基因擴增/過表達的獨立相關(guān)因素.但本研究結(jié)果顯示:HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率在不同年齡階段中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示HER2基因擴增/蛋白過表達與患者年齡無關(guān),分析結(jié)論差異可能受年齡分界、樣本量等諸多因素的影響.除此之外,HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率在絕經(jīng)前、絕經(jīng)后、非浸潤性、浸潤非特異性、浸潤特異性患者及TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明HER2基因擴增/蛋白過表達與患者月經(jīng)狀況、病理類型、臨床分期均無明顯相關(guān)性.組織學分級在一定程度上反應(yīng)腫瘤惡性程度,也是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素.本研究結(jié)果顯示:HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率在不同組織學分級中差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),即隨著乳腺癌組織學分級提高,HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率隨之增加,這一結(jié)果與既往研究[15]一致,提示HER2基因擴增/蛋白過表達者腫瘤分化差,預(yù)后不佳.本研究顯示:HER2基因擴增/蛋白過表達率在不同腫瘤大小之間存在顯著差異,腫瘤直徑>5 cm者更易出現(xiàn)HER2基因擴增/蛋白過表達,腫瘤直徑<2 cm的則陽性率最低.腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌風險評級的重要參考因素,本研究結(jié)果顯示:乳腺癌伴隨腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HER2基因擴增及蛋白過表達更高,原因可能為HER2基因表達產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細胞增殖分化的作用,HER2表達陽性者腫瘤細胞之間黏附作用相對更弱,故更容易出現(xiàn)擴散或轉(zhuǎn)移.乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與性激素的作用密切相關(guān),而ER、PR作為激素受體在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16].既往研究[17]證實:ER、PR表達對乳腺癌治療方案的選擇及預(yù)后預(yù)測具有重要的指導(dǎo)價值.本研究顯示:ER/PR陰性患者HER2基因擴增及蛋白過表達率更高,與既往研究[18]一致,其原因為ER/PR陰性者腫瘤細胞增殖不受激素調(diào)控影響,組織分化較差,HER2基因更易出現(xiàn)免疫擴增,繼而導(dǎo)致HER2蛋白高表達,而ER/PR陽性者惡性程度一般更低,且對內(nèi)分泌治療更為敏感.

      綜上所述,乳腺癌組織學分級、腫瘤直徑、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER/PR受體表達均與HER2基因擴增/蛋白過表達有關(guān),了解HER2表達狀況對于乳腺癌的準確診斷及治療方案的選擇具有指導(dǎo)意義.

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