道地中藥材川貝母特異性PCR鑒別方法研究

張富麗，張義蓉，蘭青闊，楊曉鳳，劉 煒，付紹兵，劉 茜，陳 敏，尹 全

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，成都 610066；2天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，天津 300381；3青海綠康生物開發(fā)有限公司，青海 海東 810500）

0 引言

川貝母為百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)多種植物[川貝母（卷葉貝母）(Fritillaria cirrhosa)、暗紫貝母(Fritillaria unibracteata)、甘 肅 貝 母 (Fritillaria przezvalskii)、梭砂貝母(Fritillaria delavayi)、太白貝母(Fritillariataipaiensis)或瓦布貝母(Fritillaria unibracteata var.wabuensis)]干燥鱗莖的總稱[1-2]。它生長在廣大高海拔地區(qū)，處在青藏高原的邊界。它味道微苦，具有清熱潤肺、止咳化痰的功效[3-4]，是中醫(yī)治療中常用的名貴藥材，也是許多保健食品的重要原料。受限于生長環(huán)境條件和栽培技術(shù)，川貝母類資源短缺，商品價(jià)格一直居高不下，需求量大，致使一些不法分子用其他類似的藥材混充川貝母銷售，導(dǎo)致市場上出現(xiàn)了眾多的混淆品和偽品，嚴(yán)重影響川貝母的市場秩序，損害消費(fèi)者的利益[5]。中藥材是傳統(tǒng)醫(yī)術(shù)指導(dǎo)下應(yīng)用的原生藥材，講究地道藥材，其品質(zhì)和療效受品種、特定自然條件、生態(tài)環(huán)境的地域影響明顯[6]。藥材是否真實(shí)、正統(tǒng)，直接影響其使用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。浙貝母(Fritillariae thunbergii)、湖 北 貝 母 (Fritillaria hupehensis)、平 貝 母 (Fritillaria ussuriensis)、伊 貝 母(Fritillaria pallidiflora)、土 貝 母 (Bolbostemma paniculatum)、光慈姑(Tulipa edulis)等是常見的川貝母的混淆品及偽品[7-8]。通常情況下，貝母偽品與正品雖然外觀相似，但藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值相差甚遠(yuǎn)，甚至還含有對(duì)人體有害的成分，對(duì)藥用和食用安全造成極大的威脅[7]。因此，科學(xué)有效的川貝母真?zhèn)舞b定技術(shù)對(duì)于打擊制售假的不法行為、保障用藥及食用安全具有非常重要的意義。

川貝母真?zhèn)舞b定主要通過性狀[8]、顯微[8]、理化[9-12]等傳統(tǒng)的鑒別方法實(shí)現(xiàn)，但受主觀經(jīng)驗(yàn)判斷或環(huán)境因素影響大。隨著分子檢測技術(shù)在中藥材鑒定中逐漸得到應(yīng)用和推廣，川貝母鑒定手段亦從形態(tài)表征的宏觀觀測擴(kuò)展到了遺傳物質(zhì)DNA的微觀探測?！吨袊幍洹?020版[1]中收錄的基于貝母屬核糖體DNA(nr DNA)中的Internal Transcribed Spacer(ITS)核酸序列建立的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性(PCR-RFLP)鑒定方法，是目前川貝母真?zhèn)舞b定參考的重要技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。但研究結(jié)果表明，盡管該方法經(jīng)過數(shù)次體系改進(jìn)優(yōu)化，仍然無法避免在川貝母藥材（干鱗莖）鑒定中產(chǎn)生非特異性條帶，易影響結(jié)果判斷[13-14]。且該方法需要對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切后凝膠電泳檢測，耗時(shí)相對(duì)較長。陳士林[15]基于ITS2序列構(gòu)建NJ樹的條形碼檢測技術(shù)，解決了多數(shù)中藥材的真?zhèn)舞b別問題，也適用于川貝母的真?zhèn)舞b定。但該法需要PCR擴(kuò)增，還需要測序比對(duì)數(shù)據(jù)庫，耗時(shí)長、費(fèi)用高。為進(jìn)一步簡化程序，近年來有研究者利用SYBR Green I染料和熒光探針建立PCR技術(shù)鑒定川貝母真?zhèn)蝃16-17]。但SYBR Green I法受非特異性產(chǎn)物影響大，易導(dǎo)致高背景和假陽性而影響鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性[18]。探針法具有高特異性[19]，但需合成價(jià)格較高專用探針，且需費(fèi)用高昂的設(shè)備配套，經(jīng)濟(jì)適用性差，不利于技術(shù)推廣。此外，包括《中國藥典》中DNA條形碼分子檢測方法、PCR-RFLP方法在內(nèi)，現(xiàn)有川貝母分子檢測技術(shù)多基于ITS區(qū)序列建立。ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性具有種內(nèi)相對(duì)一致、種間差異明顯的特點(diǎn)，ITS常用于物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[20-21]。但由于ITS片段不加入成熟核糖體，在物種進(jìn)化過程中承受的自然選擇壓力小，容易發(fā)生堿基突變[20]。作者推測這是導(dǎo)致川貝母PCR-RFLP鑒定方法中PCR擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性條帶或條帶模糊不清的重要原因。特異而穩(wěn)定的內(nèi)源基因代替ITS序列作為物種鑒定的基因標(biāo)記可以克服這樣的問題。因此，本研究篩選克隆川貝母特異內(nèi)源基因序列，以此為基礎(chǔ)建立高特異PCR分子檢測技術(shù)，以期為川貝母真?zhèn)舞b定提供新的技術(shù)選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用的實(shí)驗(yàn)樣品具體來源和信息見表1。對(duì)照藥材川貝母（暗紫貝母）（批號(hào)121000）購自中國食品藥品檢定研究院。川貝母干燥鱗莖樣本由青海綠康生物有限公司搜集，其中卷葉貝母(1-JY-KD)、暗紫貝母(2-AZ-SP)、梭砂貝母(3-SS-KD)、甘肅貝母(5-GS-ZX)分別來自四川、青海、云南、甘肅等地。瓦布貝母(4-WB-SP)采自四川松潘，太白貝母(6-TB-WX)采自重慶巫溪。浙貝母(7-ZBM1)、湖北貝母(8-HBBM)、伊貝母(10-YLBM)、平貝母(9-PBM1)由青海綠康生物有限公司惠贈(zèng)。土貝母(12-TBM1)、光慈姑(11-GCG)購自華御堂中藥材淘寶店、藥王堂淘寶店。10個(gè)含“貝母”標(biāo)識(shí)商品購自成都中藥材市場、藥店、阿里健康大藥房淘寶商城、同芙天貓旗艦店和藏禧堂、栢晟、善一坊等京東商城等，在本研究中作為待測樣品(13-T～22-T)。

表1 樣本信息表

1.2 總基因組DNA的提取

參考張富麗等[22]的方法從樣品中分離純化總基因組DNA。使用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)測定OD260/OD280和OD260/OD230評(píng)價(jià)樣品DNA的質(zhì)量。

1.3 川貝母特異基因片段克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜集貝母甾體皂苷生物合成關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)功能基因同源片段，設(shè)計(jì)兼并引物HMGR-F2(5’-AC(A,T,C)ATGCC(A,T)TC(A,T,C)AT(T,C)GAGGT-3’)/HMGRR2(5’-GTT(A,G)TA(T,C)TTCATGTGGCTCT-3’)。以川貝母、浙貝母、湖北貝母、伊貝母鱗莖樣本DNA為模板，利用 1× HotStar Taq?Plus Master Mix(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)、HMGR-F2/HMGR-R2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，回收特異條帶進(jìn)行克隆測序。根據(jù)川貝母與其他貝母中得到的序列中不同堿基位點(diǎn)，設(shè)計(jì)川貝母特異的引物BMH-F2(5’-AGCGAGAGACGACATCAGAGA-3’)/BMH-R2(5’-AGGTTGGCACAGTTGGAGG-3’)。再次以川貝母樣本DNA為模板，利用引物BMH-F2/BMH-R2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到川貝母基源樣本特異性條帶，回收并送克隆測序。進(jìn)一步地設(shè)計(jì)引物BM-P1(5’-ACCGC TGCCCAGACCTA-3’)、BM-P2(5’-CCGTTCCTCCA ACTGTGC-3’)、BM-P3(5’-AGAACATCAGAAAAAA TCCGTG-3’)、BM-P4(5’-ATCGGGGAAACGACCCT ATC-3’)分別用于先后2次步移克隆。用EcoRV、DraI、PvuⅡ和StuⅠ（BD Genome WalkerTMUniversal Kit，Clontech公司）4種內(nèi)切酶構(gòu)建川貝母全基因組酶切庫，步移克隆操作按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 40 s，72℃ 45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳分析，回收特異性帶并送擎科生物（Tsingke Biological Technology，成都）克隆測序。采用Primer Premier 5.0（Premier公司，加拿大）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用AlignX軟件及DNAman軟件對(duì)序列進(jìn)行同源性分析及拼接。

1.4 川貝母基因片段物種特異性驗(yàn)證

根據(jù)從川貝母中得到的核酸序列，設(shè)計(jì)川貝母特異性檢驗(yàn)引物BMH-TF(5’-CGAGAGACGACATCAG AGAACTT-3’)/BMH-TR(5’-CTTGGGATTGCTACTG CGTTA-3’)以及BMH-YF(5’-CAGCAGGAATCCCAA GC-3’)/BMH-YR(5’-GGTTGGCACAGTTGGAGG-3’)分別在120、234 bp位點(diǎn)和不同靶標(biāo)長度進(jìn)行驗(yàn)證。以卷葉貝母、暗紫貝母、梭砂貝母、甘肅貝母、瓦布貝母、太白貝母等所有貝母基源DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上。

1.5 高特異PCR方法建立

以 BMH-TF(5’-CGAGAGACGACATCAGAGAACTT-3’)/BMH-TR(5’-CTTGGGATTGCTACTGCGTTA-3’)為引物，以50 ng/μL川貝母DNA為模板，1× Hot-Star Taq?Plus Master Mix(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。配制0.1、0.12、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L不同濃度梯度引物，在50、52、54、56、58、60、62℃不同退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增分析，取最優(yōu)引物濃度和最適退火溫度作為川貝母PCR檢測條件。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

以川貝母各基源種、浙貝母、湖北貝母、平貝母、伊貝母、土貝母、光慈姑DNA為模板，采用本研究中川貝母特異檢測引物及構(gòu)建的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增分析，測試方法的特異性。

將川貝母DNA模板進(jìn)行不同濃度梯度稀釋后作為模板，采用川貝母特異檢測引物及構(gòu)建的PCR方法驗(yàn)證測試方法的檢測下限，即靈敏度。

同時(shí)采用本研究中構(gòu)建的PCR方法對(duì)市場中購買樣品進(jìn)行檢驗(yàn)測試，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次，每次設(shè)3個(gè)平行樣品。采用《中國藥典》（2020版）[1]中RFLPPCR方法平行地驗(yàn)證構(gòu)建方法的有效性，測試方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 川貝母特異基因片段

通過兼并引物對(duì)HMGR-F2/HMGR-R2從川貝母中得到501 bp核苷酸序列，經(jīng)比對(duì)與Fritillaria unibracteata 3-hydroxy-3-methyl qlutaryl coenzyme A reductase(HMGR)mRNA序列有99%同源性。在此基礎(chǔ)上，在川貝母與浙貝母、湖北貝母、伊貝母等同源基因差異最大區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，在川貝母中得到341 bp特異序列（圖1A），進(jìn)一步通過步移克隆得到610 bp特異核酸序列（圖1B）。將該序列提交至NCBI Genbank庫，登錄號(hào)為MN151370。分別在2個(gè)不同位點(diǎn)、不同靶標(biāo)長度設(shè)計(jì)BMH-TF/BMH-TR和BMH-YF/BMHYR引物對(duì)，以川貝母DNA為模板，PCR擴(kuò)增分別得到120、234 bp特異性條帶（圖1A），明確本研究中克隆得到的片段為川貝母基源種特異基因序列。

圖1 川貝母特異基因片段及引物位置示意圖

2.2 川貝母特異PCR檢測方法建立

不同引物濃度在不同退火溫度下的擴(kuò)增分析結(jié)果如圖2A所示，引物濃度0.4 μmol/L、退火溫度56℃為擴(kuò)增得到清晰、特異性條帶的最佳條件。采用BMHTF/BMH-TR引物對(duì)，在上述條件的PCR條件下，可在川貝母陽性對(duì)照品(P121000)、卷葉貝母(1-JY-KD)、暗紫貝母(2-AZ-SP)、梭砂貝母(3-SS-KD)、瓦布貝母(4-WB-SP)、甘肅貝母(5-GS-ZX)、太白貝母(6-TB-WX)等川貝母基源中擴(kuò)增到120 bp單一清晰目標(biāo)帶，而在陰性對(duì)照(Water)以及浙貝母(7-ZBM1)、湖北貝母(8-HBBM)、平貝母(9-PBM1)、伊貝母(10-YLBM)、光慈姑(11-GCG)和土貝母(12-TBM1)等非川貝母中不產(chǎn)生擴(kuò)增條帶（圖2B）。以上結(jié)果表明，引物BMH-TF/BMHTR可對(duì)川貝母對(duì)照品及川貝母基源物種進(jìn)行特異性擴(kuò)增，本研究中建立的PCR方法對(duì)川貝母具有特異性。

2.3 靈敏度

將100 ng/μL的川貝母對(duì)照品(P121000)DNA模板分別稀釋為50、25、10、5、2、0.5、0.1、0.05 ng/L后，取2 μL作為模板，即50 μL反應(yīng)體系中分別含有100、50、20、10、4、1、0.2、0.1 ng川貝母DNA。以無菌水作為空白對(duì)照，采用本研究中構(gòu)建的特異PCR方法進(jìn)行50 μL體系擴(kuò)增分析。如圖2C所示，當(dāng)DNA模板稀釋至2 ng/μL以上，即體系中DNA模板量≥4 ng時(shí)，特異性條帶擴(kuò)增明顯且單一。當(dāng)DNA濃度稀釋至0.5 ng/μL時(shí)，能微弱地看到擴(kuò)增條帶，但相對(duì)模糊，之后的稀釋模板均無擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。由此，確定該方法檢測靈敏度為2 ng/μL，檢測下限為4 ng。

圖2 川貝母基源特異性檢測及檢測靈敏度

2.4 方法適用性分析

為驗(yàn)證構(gòu)建方法的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性，筆者從各種渠道購買10個(gè)樣品，其中5個(gè)樣本(13-T、14-T、17-T、19-T、22-T)明確標(biāo)注為川貝母或川貝（母）粉、3個(gè)樣本(16-T、20-T、21-T)標(biāo)注為貝母或貝母粉、2個(gè)樣本(15-T、18-T)分別標(biāo)注為“平貝母”、“浙貝母”。同時(shí)采用本研究中構(gòu)建的PCR方法和《中國藥典》（2020版）中RFLP-PCR方法[1]平行地對(duì)10個(gè)從市場中購買樣品(13-T～22-T)進(jìn)行檢驗(yàn)測試，以川貝母對(duì)照品(P121000)DNA為陽性對(duì)照、Water為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，3次重復(fù)檢測結(jié)果均一致，具有良好重現(xiàn)性。5個(gè)明確標(biāo)注為川貝母或川貝（母）粉樣本中，編號(hào)為22-T的樣本中未檢測到川貝母特征條帶。而標(biāo)注為貝母的3個(gè)樣本中，僅21-T這個(gè)樣本擴(kuò)增到特異條帶。編號(hào)為15-T的平貝母和18-T的浙貝母中均未擴(kuò)增到目標(biāo)條帶。依據(jù)本研究中建立的PCR檢測方法判定，含“川貝母”或“貝母”標(biāo)記的8個(gè)在售商品樣品中，僅有5個(gè)樣本含有川貝母成分，陽性率僅為62.5%（表2）。采用RFLP-PCR方法平行檢測結(jié)果與上述結(jié)果一致，本文中所示的PCR檢測方法穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確性佳，適用于實(shí)際樣品分析檢測。

表2 川貝母特異PCR方法在實(shí)際樣品分析中的適用性

3 討論

川貝母作為一種名貴中藥材，具有特殊的生境適應(yīng)性，其止咳化痰功效優(yōu)于其他貝母種類。萜類化合物是許多植物體中維持生長發(fā)育、應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫、抵御病原體和害蟲侵襲等重要功效物質(zhì)的主要成分[23]，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR)是該物質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵限速酶，能夠?qū)?-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)化成中間代謝產(chǎn)物甲羥戊酸[24]。因此，本研究欲將HMGR基因作為尋求川貝母基原物種特異性分子標(biāo)記的突破點(diǎn)。如預(yù)期所料，筆者在克隆HMGR同源基因過程中，在川貝母基因組中擴(kuò)增得到其他貝母中未有的條帶，且經(jīng)過測序及不同引物、不同位點(diǎn)驗(yàn)證，明確了其物種特異性。雖然該核酸序列與川貝母特殊生境適應(yīng)力及優(yōu)秀的藥用功效間的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究，但本研究基于該段序列建立特異PCR檢測方法，可簡單有效地鑒別川貝母基原與非川貝母，且實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該鑒定方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性。由于本文中獲取的特異核酸片段來自于川貝母基因組，檢測模板易獲取，不受材料完整度、干燥程度的影響。設(shè)計(jì)的引物具有較強(qiáng)的特異性，目標(biāo)片段大小適中，應(yīng)用該引物可實(shí)現(xiàn)川貝母與其近緣物種快速準(zhǔn)確鑒別。這是在ITS以外，基于內(nèi)源基因片段建立川貝母基源鑒定方法的一次新的重要嘗試，希望能為中藥材基原鑒定新方法研究及標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)體系建立提供參考。