褪黑素引發(fā)對干旱脅迫下黃瓜幼苗生理特性的影響

銀珊珊，周國彥，顧博文，武春成，閆立英，謝 洋

（1河北科技師范學院園藝科學技術學院，河北 秦皇島 066004；2河北省特色園藝種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新利用重點實驗室，河北 秦皇島 066004）

0 引言

黃瓜(Cucumis sativus)是重要的世界性蔬菜，中國黃瓜栽培面積和總產(chǎn)量均居全球首位[1]。作為一種高需水性作物，黃瓜對水分較為敏感[2]。干旱缺水是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素，中國農(nóng)業(yè)水資源嚴重短缺，尤其是在北方地區(qū)，水分利用率低[3]，嚴重制約了設施黃瓜的快速發(fā)展。據(jù)報道，適度的干旱脅迫可以在不降低產(chǎn)量的同時提高品質(zhì)，且水分利用率較高[4-5]。種子萌發(fā)和幼苗形成是被子植物生長發(fā)育的最初階段，也是關鍵的時期，極易受到不良環(huán)境影響，對植物后期的形態(tài)建成和生長發(fā)育產(chǎn)生直接效應[6-7]。因此，增強種子萌發(fā)和幼苗形成階段的耐旱性對黃瓜后期生長發(fā)育有重要影響。

種子引發(fā)通過慢速定量吸水和逐步回干等過程來提高種子活力[8]。種子引發(fā)的原理是通過創(chuàng)造一種低水勢環(huán)境限制種子吸水速率，使種子停留在萌發(fā)的第二階段，利于種子完成萌發(fā)前期生長物質(zhì)代謝，可顯著提高種子的萌發(fā)力及抗逆性[9]。研究表明，水、聚乙二醇(PEG)、茉莉酸甲酯(MeJA)引發(fā)可提高小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)[10]。種子引發(fā)可以提高黃瓜在逆境脅迫下種子的萌發(fā)能力，其中過氧化氫(H2O2)引發(fā)、5-氨基乙酰丙酸引發(fā)可分別促進鹽脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)與幼苗生長[11-13]。

目前，褪黑素(MT)在植物及農(nóng)業(yè)科學領域受到了科研工作者的廣泛關注。研究表明，100 μmol/L MT處理黃瓜幼苗可顯著提高滲透脅迫下黃瓜幼苗的光合速率，抑制葉綠素降解，提高抗氧化酶活性，進而提高黃瓜幼苗的抗旱性[14]。然而，關于MT引發(fā)黃瓜的相關研究還未見報道。本研究以MT作為種子引發(fā)劑處理黃瓜種子，分析MT引發(fā)對干旱脅迫下黃瓜幼苗生理特性的影響，旨在探究MT引發(fā)提高黃瓜抗旱性的機理，為MT作為黃瓜種子引發(fā)劑或包衣劑物料篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗于2021年在河北科技師范學院園藝園林試驗站1號日光溫室進行。供試材料‘津研四號’黃瓜購于天津市薊農(nóng)種子有限公司。MT購于北京索萊寶科技有限公司，其他分析純等藥品由中心實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子引發(fā) 以MT為種子引發(fā)劑，采用2因素裂區(qū)設計方法，利用不同濃度0 μmol/L(A0)、50 μmol/L(A1)、100 μmol/L(A2)、150 μmol/L(A3)的 MT 于 25℃條件下各引發(fā)0 h(B0)、6 h(B1)、12 h(B2)、15 h(B3)。每個引發(fā)處理按四分法隨機分別取50粒種子，3次生物學重復。引發(fā)完成后將種子取出，先用去離子水除去種子表面引發(fā)劑，再用濾紙吸干種子表面的水分，放置室溫下自然回干。

1.2.2 脅迫處理 取引發(fā)和未引發(fā)的種子進行催芽后，播種于10 cm×10 cm的營養(yǎng)缽中。采用基質(zhì)栽培，基質(zhì)配比為草炭:蛭石:珍珠巖=3:1:1。基質(zhì)田間持水量采用環(huán)刀法測定。試驗于2021年5月11日播種，出苗后開始進行干旱處理，設定干旱脅迫土壤水分下限50%田間持水量，上限為75%，對照組(CK)將灌溉水平下限為75%，灌溉上限為田間持水量的100%，A0B0為未引發(fā)種子干旱處理。每個處理3次重復，每個重復15盆。水分控制采用稱重法，當水分達到設計下限值時對黃瓜進行灌水。每7天采用土樣烘干法進行土壤水分校正。

1.2.3 生理指標測定 待出苗后7、14、21、28天分別測定幼苗的葉面積，選定植株的第1片真葉，直尺測量葉片的葉長(L)和葉寬(W)，按式(1)計算葉面積[15]。

于第28天用GFS-3000型便攜式光合儀（德國WALZ公司）、SPAD-502Plus型葉綠素儀（美國KONICA MINOLTA公司）測定同一葉片光合指標和葉綠素含量。

取第28天的苗期植株第3～4片葉進行生理指標測定。采用氮藍四唑光化還原法測定葉片的超氧化物歧化酶(SOD)，紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)，過氧化物酶試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定過氧化物酶(POD)活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量，TTC比色法測定根的根系活力。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)通過使用DPS分析軟件進行單因素方差分析后做平均值多重比較(Duncan)，顯著性檢驗水平為5%。利用SPSS 22.0軟件進行各指標之間相關性分析，利用Excel軟件進行分析及作圖。

隸屬函數(shù)值參考武新娟等[16]的方法計算。

當指標性狀值與抗旱性呈正相關時如式(2)，當指標性狀值與抗旱性呈負相關時如式(3)。

式中，n為指標性狀數(shù)量，為品種抗旱隸屬函數(shù)平均值，平均值越大抗旱性越強。

2 結果與分析

2.1 種子引發(fā)對干旱脅迫下黃瓜幼苗光和特性的影響

2.1.1 對葉綠素含量的影響 干旱脅迫顯著降低了黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量。由圖1可知，與CK相比，A0B0的葉綠素含量下降了5.0%(P<0.05)。MT處理后，各處理的葉綠素含量均高于A0B0，且有顯著性差異，其中 A1B3、A2B2、A3B2處理顯著高于 A0B0，分別增加了22.4%、27.9%、27.3%。只有A2B1處理降低了葉綠素含量，但差異不顯著，其余各處理的葉綠素含量均高于CK，且有顯著性差異。說明MT引發(fā)可提高干旱脅迫下黃瓜苗期葉片葉綠素的合成。

圖1 引發(fā)濃度和引發(fā)時間對干旱脅迫下黃瓜葉片葉綠素含量的影響

2.1.2 對光合指標的影響 由表1可知，干旱脅迫顯著降低了植株的光合速率，與CK相比，A0B0的光合速率下降了57.6%。MT引發(fā)種子處理與A0B0相比，均提高了葉片光合速率，其中處理 A1B3、A2B2、A2B3光合速率分別顯著增加了88.2%、61.3%、85.5%(P<0.05)，與CK相比有顯著性差異；MT濃度為150 μmol/L的處理A3B1、A3B2、A3B3與A0B0相比，提高了光合速率，但差異不顯著，可能的原因是高濃度的MT抑制了植株的光合速率。氣孔導度和蒸騰速率與光合速率變化規(guī)律大體一致，A1B3、A2B2、A2B3的氣孔導度、蒸騰速率顯著高于A0B0；而A0B0的胞間CO2濃度最大，各處理均降低了胞間 CO2濃度 ，其中 A1B2、A1B3、A2B3顯著低于 A0B013.2%、16.5%、12.6%。說明MT引發(fā)可降低干旱脅迫對黃瓜葉片光合效率的影響。

表1 引發(fā)濃度和引發(fā)時間對干旱脅迫下黃瓜葉片光合指標的影響

2.1.3 對植株葉面積的影響 黃瓜苗期葉面積隨著黃瓜營養(yǎng)生長不斷增大（圖2），干旱脅迫影響了葉片的生長，A0B0處理顯著低于CK處理，較CK平均降低了33.8%(P<0.05)。除去處理 A1B1、A3B1外，其余各處理與A0B0相比，也均可顯著提高黃瓜葉面積，但與CK相比差異不顯著。在定植后第7、14天以A2B1處理葉面積最大，顯著高于其他處理，較A0B0分別顯著提高45.9%、45.5%；在定植后第21、28天以A1B3處理葉面積最大，顯著高于其他處理，較A0B0分別顯著提高62.0%、111.1%。說明在黃瓜苗期MT引發(fā)可顯著提高干旱脅迫下植株的葉面積。

2.2 種子引發(fā)對干旱脅迫下黃瓜幼苗酶活性和MDA的影響

由圖 3 可知，A1B2、A1B3、A2B3種子引發(fā)處理的SOD活性分別較A0B0提高5.4%、26.1%、5.1%，A2B1、A2B2處理SOD值低于A0B0，其余各處理均與A0B0無顯著性差異，其中A3B1、A3B2、A3B3處理的SOD值均低于A0B0，可能是因為高濃度的MT有抑制作用，說明適量濃度的MT引發(fā)可通過激發(fā)SOD酶活性有效減輕干旱脅迫對黃瓜苗期的傷害。MT引發(fā)處理的A1B1、A2B3、A3B1與A0B0相比POD酶有顯著性差異，其活性分別提高86.2%、42.4%、173.2%，其余各處理均與A0B0無顯著性差異。處理A2B3、A3B1、A3B2顯著提高了CAT酶活性，與A0B0相比分別提高了38.8%、50.6%、48.6%，處理A1B1、A2B2的CAT酶活性低于A0B0，其余各處理均與A0B0無顯著性差異。A0B0的MDA含量最多，MT引發(fā)處理對MDA含量有明顯的抑制作用，各處理的MDA含量均顯著低于A0B0，分別降低了19.6%～80.7%，說明MT引發(fā)是通過提高葉片的SOD、POD、CAT酶活性來提高植株的抗旱性。

圖3 引發(fā)濃度和引發(fā)時間對干旱脅迫下黃瓜葉片酶活性和MDA的影響

2.3 種子引發(fā)對干旱脅迫下黃瓜幼苗根系活力的影響

由圖4可知，干旱脅迫顯著降低了黃瓜植株的根系活力，MT引發(fā)處理后，與A0B0相比，各處理均增加了干旱脅迫下植株的根系活力。處理A1B2、A1B3、A2B2、A2B3、A3B2均顯著增加了植株根系活力，分別較A0B0增加了98.7%、134.7%、59.0%、154.0%、148.5%，說明適量的濃度和時間可以增強黃瓜苗期的根系活力。

圖4 引發(fā)濃度和引發(fā)時間對干旱脅迫下黃瓜根系活力的影響

2.4 干旱脅迫下各指標相關性分析

由表2可知，黃瓜11個指標中，光合速率與蒸騰速率之間呈極顯著正相關關系；胞間CO2濃度與蒸騰速率、氣孔導度、葉面積呈顯著負相關關系，與光合速率呈極顯著負相關關系；葉綠素與根系活力之間呈顯著正相關關系；其他性狀間相關系數(shù)均不顯著。

表2 黃瓜干旱脅迫下各指標相關性分析

2.5 種子引發(fā)對植株耐旱性的綜合評價

11種不同處理的植株抗旱性強弱不同，通過利用模糊隸屬函數(shù)法進一步對結果進行綜合分析，綜合評價值顯示抗旱性有強到弱依次為A1B3>A2B3>CK>A1B2>A3B1>A2B2>A3B2>A3B3>A1B1>A2B1>A0B0（表 3）。所有處理都排名都大于處理A0B0，其中以處理A1B3隸屬函數(shù)值最大，其次是A2B3，且大于處理CK，表明MT引發(fā)處理可以增強干旱脅迫下植株的抗旱性。

表3 各引發(fā)處理的綜合抗旱隸屬函數(shù)值

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)不同引發(fā)時間、濃度的MT對黃瓜的生長發(fā)育有不同影響。其中，100 μmol/L MT引發(fā)種子12 h，葉片中葉綠素含量最高，較對照增幅達27.9%；50 μmol/L和100 μmol/L MT引發(fā)種子15 h的植株光合速率最高，較對照增幅約80%以上；50 μmol/L MT引發(fā)種子15 h的植株在第21、28天葉面積最大；50 μmol/L MT引發(fā)種子15 h的葉片SOD含量最高；150 μmol/L MT引發(fā)種子6 h的葉片POD含量最高；150 μmol/L MT引發(fā)種子12 h的葉片CAT含量最高；100 μmol/L MT引發(fā)種子15 h的根系活力最強，增幅較對照達154.0%；隸屬函數(shù)綜合分析表明，50 μmol/L和100 μmol/L MT引發(fā)種子15 h對干旱脅迫緩解效果最佳。研究結果可為MT作為黃瓜種子引發(fā)劑或包衣劑物料篩選提供參考依據(jù)。

4 討論

黃瓜作為一種高耗水性作物，對水分十分敏感。干旱缺水是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素，有效提高植株水分利用率、增強植株耐旱性是促進設施黃瓜節(jié)水增質(zhì)的重要途徑。本研究對黃瓜種子進行不同濃度和時長MT引發(fā)處理后，在干旱脅迫下進行苗期試驗，通過測定干旱脅迫下苗期葉片抗氧化酶活性、光合指標、葉綠素含量、根系活力等指標分析MT引發(fā)對黃瓜耐旱性的影響。

4.1 MT引發(fā)對抗旱生理指標的影響

MDA是膜脂過氧化的主要副產(chǎn)物，通常被看作植物細胞膜損傷程度的指示物[17]。在水分虧缺條件下，黃瓜葉片的MDA含量升高，說明在干旱脅迫下，植株體內(nèi)活性氧大量積累，膜功能和結構遭到傷害[18]。本研究表明，干旱脅迫下，黃瓜葉片中MDA含量顯著增加，而MT引發(fā)后，葉片中MDA含量均有不同程度的下降，減輕活性氧對細胞膜的傷害，這與Mohammad[19]在油菜植株中的研究結果一致。

研究表明，植株可以通過保護酶清除逆境環(huán)境中形成的過量氧自由基，以減輕對細胞的傷害[20]，對增強抗逆性、維持植物體正常生長發(fā)育發(fā)揮重要作用[21]。孟祥萍[22]認為，在干旱脅迫下，小麥苗期的抗氧化酶活性在100 μmol/L褪黑素引發(fā)下增加幅度最大。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度及時間的種子引發(fā)可以不同程度增加葉片中SOD、POD、CAT酶活性，其變化趨勢大致相同，但是引發(fā)處理后CAT酶活性增加最為明顯，說明相對于SOD、POD來說，CAT酶可能對MT引發(fā)處理更為敏感。

4.2 MT引發(fā)對根系活力與光合特性的影響

根系活力是衡量根系吸水能力的關鍵生理指標，根系活力高能夠使根系吸取更多水分及營養(yǎng)，以供地上部分生長需要[23]。種子引發(fā)可以提高植株根系活力、根冠比，增加根系長度、體積，從而提高根系生物量的積累，促進生長來提高植株的抗逆性[24-25]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在適量濃度和合適時間的引發(fā)處理下，黃瓜根系活力有效提高。

光合速率作為植物生理性狀的一個重要指標，是估測植株光合生產(chǎn)能力的主要依據(jù)之一[26]。多數(shù)研究認為干旱脅迫可降低黃瓜幼苗植株干重、鮮重和葉面積等生長指標[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，中度干旱脅迫下，對照植株的光合速率、氣孔導度和蒸騰速率顯著降低，胞間CO2濃度明顯上升；MT引發(fā)有效提高了干旱脅迫下黃瓜葉片的光合速率、氣孔導度和蒸騰速率，說明MT引發(fā)處理可以緩解因減少水分流失引起的葉片氣孔關閉，這與Zhang等[30]的研究結果一致。同時中度干旱下，MT引發(fā)較對照提高了葉綠素含量、葉面積，說明MT引發(fā)提高了葉片的光合能力，緩解了干旱脅迫對葉片的傷害。

4.3 隸屬函數(shù)法綜合評價不同引發(fā)處理的黃瓜植株抗旱性

光合指標（光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、胞間CO2濃度）、根系活力及抗氧化酶(SOD、POD、CAT)等指標可以反映黃瓜苗期在干旱脅迫下的生長狀況。不同引發(fā)劑處理后各指標的變化不同，對干旱脅迫的生理反應不同。利用單項指標不能準確反映抗旱性強弱[31]，可用隸屬函數(shù)法綜合評價各處理的抗旱性。本試驗采用隸屬函數(shù)法對11個不同處理測定的10項指標進行分析，篩選出處理組 A1B3(50 μmol/L，15 h)、A2B3(100 μmol/L，15 h)的抗旱性較好。有研究表明，用MT對油菜種子進行引發(fā)的最適濃度為50 μmol/L、6 h[19]，用MT對小麥種子進行引發(fā)的最適濃度為100 μmol/L、18 h[22]，用MT對棉花種子進行引發(fā)的最適濃度為100 μmol/L、24 h[32]，本研究結果與前人結果相近，最佳濃度均在50～100 μmol/L之間，引發(fā)時長的不同可能是與試驗材料本身特性有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用50～100 μmol/L的MT引發(fā)黃瓜種子15 h，在苗期中度干旱脅迫下，可以提高植株根系活力、光合速率、葉綠素含量、SOD和POD活性，降低MDA含量；推測MT引發(fā)黃瓜可通過提高葉片中抗氧化物酶活性、光合參數(shù)及根系活力，從而緩解干旱脅迫對植株造成的傷害。本研究僅以MT引發(fā)劑為例，探究不同干旱脅迫下MT引發(fā)對黃瓜幼苗生理特性的影響，對于干旱脅迫下黃瓜植株后期的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響還有待于進一步研究。此外，開展不同類型引發(fā)劑、新型引發(fā)劑及復合引發(fā)劑對植株逆境響應的影響及其機理研究，對促進種子的萌發(fā)和提高逆境適應性尤為重要。