胃癌組織中組織蛋白酶D的表達(dá)及與侵襲基因和預(yù)后的關(guān)系

彭昌能 (郴州市第四人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性組織增生腫瘤，具有明顯的組織浸潤和侵襲特性，表現(xiàn)為細(xì)胞黏附能力下降、穿破基底膜進(jìn)入血液循環(huán)、逃避免疫監(jiān)視及在遠(yuǎn)隔部位生長等[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)的胃癌侵襲轉(zhuǎn)移基因中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)屬于重要的一類，可高效促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力[3-4]。而胃癌組織在浸潤遷移過程中，轉(zhuǎn)移蛋白酶水平會出現(xiàn)相應(yīng)變化，其中包括組織蛋白酶。組織蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族的主要成員,人體中包含11 種，與腫瘤疾病、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等多種重大疾病的進(jìn)展和惡化密切相關(guān)。組織蛋白酶D(CTSD)屬于蛋白水解酶，其水解基質(zhì)特性可加速破壞基底膜、促進(jìn)基質(zhì)溶解，在腫瘤組織的浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[5]。但CTSD在胃癌組織中的表達(dá)意義，以及其胃癌患者預(yù)后之間是否存在聯(lián)系仍屬于目前的研究薄弱方向。基于此，本研究納入92胃癌患者進(jìn)行分析，探討CTSD與胃癌組織侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系，旨在為控制胃癌組織浸潤轉(zhuǎn)移、提高胃癌預(yù)后質(zhì)量提供新思路。

1 資料與方法

1.1研究對象：選取我院2018年2月～2021年2月收治的92例胃癌患者腫瘤組織標(biāo)本作為觀察組，以上述標(biāo)本內(nèi)的非腫瘤胃黏膜組織作為對照組。其中男52例，女40例；年齡50～72歲，平均年齡(61.65±6.25)歲；組織標(biāo)本包括41例胃竇腺癌，27例胃體，24例胃角。所有患者胃癌組織均來自原發(fā)病灶，患者未合并有其他腫瘤疾病，且均未接受放化療。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2方法：本研究試劑及儀器包括olympus顯微鏡，CTSD試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，S-P試劑盒(美國Maxim公司)。所取胃癌組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛溶液固定、脫水，采用S-P 法處理取片：5 μm連續(xù)切片，脫石蠟，采用酒精水化一次阻斷組織氧化，經(jīng)微波抗原修復(fù)后以羊血清封存。研究時(shí)，先取出加入一抗(CTSD單克隆抗體)，置入-4 ℃冰箱留置一夜；取出后再滴入二抗和三抗，DAB顯色處理，再采用酒精梯度脫水、取片[6-7]。本研究在染色流程中設(shè)置對照組，以PBS液替代一抗作為陰性對照。

1.3CTSD結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果由同一位專業(yè)醫(yī)師評估，以顯微鏡觀察每張切片3～5個熱點(diǎn)區(qū)視野內(nèi)的陽性細(xì)胞比例、著色強(qiáng)度。陽性細(xì)胞比例>75%計(jì)為4分，51%～75%計(jì)為3分，26%～50%計(jì)為2分，1%～25%計(jì)為1分，陰性計(jì)為0分。著色強(qiáng)度根據(jù)視野內(nèi)棕色顆粒強(qiáng)度判斷，棕褐色計(jì)為3分，棕黃色計(jì)為2分，淡黃色計(jì)為1分，無明顯顯色計(jì)為0分。陽性細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)與顯色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)相乘，總分12 分，>6分為陽性，反之則為陰性[8]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)組間行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier分析胃癌患者生存率，組間比較行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組標(biāo)本組織中的CTSD、侵襲基因表達(dá)情況比較：觀察組中CTSD、MMP-3陽性表達(dá)率顯著高于對照組，二者組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表1。

表1 兩組標(biāo)本組織中的CTSD及MMP-3表達(dá)情況比較[n(%)，n=92]

2.2CTSD與MMP-3的關(guān)系：在MMP-3陽性表達(dá)中，CTSD陽性表達(dá)率為85.11%(40/47)，在MMP-3陰性表達(dá)中，CTSD陽性表達(dá)率為62.22%(28/45)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 CTSD與MMP-3的關(guān)系(n=92)

2.3CTSD與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系：觀察組中不同胃癌組織學(xué)類型、病理分化程度中的CTSD陽性和陰性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在不同浸潤程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CTSD陽性和陰性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各病理因素間的CTSD表達(dá)情況(n,n=92)

2.4CTSD表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系：本研究隨訪10～40個月，平均隨訪(24.55±10.02)個月。術(shù)后胃癌CTSD陽性表達(dá)生存24例(35.29%)，陰性表達(dá)生存15例(62.50%)。經(jīng)Kaplan-Meier分析，CTSD陽性表達(dá)者平均無進(jìn)展時(shí)間為(27.86±1.40)個月，CTSD陰性表達(dá)者平均無進(jìn)展時(shí)間為(35.17±3.11)個月，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.558，P<0.05)。見圖1。

圖1 CTSD表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

3 討論

胃癌不斷惡化發(fā)展的主要機(jī)制在于胃黏膜上皮的惡性組織浸潤侵襲及轉(zhuǎn)移，其中包含多個復(fù)雜的惡性腫瘤生物學(xué)特征，向鞍區(qū)周圍組織浸潤生長，破壞正常結(jié)構(gòu)[9-10]。原發(fā)病灶內(nèi)的癌細(xì)胞不斷發(fā)展導(dǎo)致細(xì)胞粘附能力下降，癌細(xì)胞脫離病灶游離侵襲病灶周圍組織，穿破基底膜在血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散，避開免疫系統(tǒng)監(jiān)視機(jī)制形成新生血管，在遠(yuǎn)隔部位形成新的病灶繼續(xù)生長[11]。因此，胃癌惡性腫瘤疾病惡化迅速，需探究相關(guān)指標(biāo)在胃癌早期于組織侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系，以此控制胃癌組織浸潤轉(zhuǎn)移，提高胃癌預(yù)后質(zhì)量。

組織蛋白酶存在于動物組織細(xì)胞內(nèi)，主要存在于溶酶體部分，可以根據(jù)所作用的代表性底物發(fā)揮肽鏈內(nèi)切酶功能，降解不同膠原細(xì)胞外基質(zhì)[12]。CTSD具有獨(dú)特的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)方式，表面由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，通過多種蛋白質(zhì)水解途徑最終抵達(dá)細(xì)胞內(nèi)的小泡結(jié)構(gòu)(溶酶體、核內(nèi)體、吞噬體)，從而發(fā)揮蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生理和病理功能[13-14]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織惡化發(fā)展過程中合并大量CTSD，高效促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程。

劉愛東等[15]在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中侵襲基因MMP-11和CTSD陽性表達(dá)呈顯著正相關(guān)，二者存在聯(lián)動作用，共同促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。MMPs蛋白家族需要Ca2+、Zn2+等輔助激活，主要由疏水信號肽序列、保持酶原穩(wěn)定性的前肽區(qū)、金屬離子結(jié)合點(diǎn)的催化活性區(qū)、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)以及酶底物特異性的羧基末端區(qū)5個功能區(qū)組成[16-17]。不同MMPs成員在不同功能區(qū)各有特點(diǎn)，但酶催化活性區(qū)和前肽區(qū)均具有高度保守性，可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成份(ECM)中的各種蛋白成分，由此影響腫瘤細(xì)胞侵襲組織學(xué)屏障。MMPs家族已分離鑒別出26個成員，其中MMP-3又稱為基質(zhì)溶解酶1(stromelysin 1)，在惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他MMP成員[18]。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致。究其原因，胃癌組織細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中CTSD大量合成，發(fā)揮肽鏈內(nèi)切酶功能活化膠原酶，激活侵襲基因MMPs，經(jīng)MMP激活后降解細(xì)胞外基質(zhì)，打開惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移通路，進(jìn)一步加快腫瘤的浸潤和侵襲[19-20]。

此外，MMP-3主要作用于非變性膠原蛋白(PG)、層粘連蛋白(LN)、纖連蛋白(FN)、Ⅲ型和Ⅳ型膠原及明膠，且能夠激活陽性率較低的MMP-1和其他家族成員，而MMP-1在各種刺激下可呈高表達(dá)狀態(tài)，與惡性腫瘤與預(yù)后質(zhì)量存在密切聯(lián)系[21]，這說明CTSD陽性可能也與胃癌患者預(yù)后質(zhì)量有關(guān)。本研究結(jié)果說明CTSD陽性表達(dá)不僅會影響侵襲基因的表達(dá)狀態(tài)，還會加快胃癌腫瘤疾病的惡化進(jìn)程，縮短患者生存時(shí)間[22]。

綜上所述，胃癌組織中CTSD呈高度表達(dá)狀態(tài)，且與胃癌侵襲基因存在密切聯(lián)系，可用以初步判斷患者的預(yù)后質(zhì)量。