春秋冬三季東弗里升奶綿羊體內(nèi)胚胎生產(chǎn)及移植效果

馬文奎，李繼成，譚鑫星，張金龍，張效生，吳 昊，姬鵬云，李廣棟，宋玉坤，楊 海，呂東穎，楊明輝，富俊才，阿布力孜·吾斯曼，朱士恩，劉國世*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.北京奧鑫牧業(yè)有限公司，北京 101300；4.內(nèi)蒙古草原宏寶食品股份有限公司，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；5.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300380）

東弗里升奶綿羊（East Friensian milk sheep）以產(chǎn)奶能力強(qiáng)而著稱，原產(chǎn)于德國東北部。該品種體格較大、體型結(jié)構(gòu)良好；公、母羊均無角，被毛白色，體軀寬而長，腰部結(jié)實，肋骨拱圓，臀部略有傾斜，尾瘦長、無毛；乳房、乳頭發(fā)育良好，優(yōu)秀母羊年泌乳量達(dá)1 200 kg以上。早年我國東北、西北地區(qū)引進(jìn)過東弗里升奶綿羊，但存欄量較少。胚胎移植（embro transfer，ET）技術(shù)是普遍使用的良種快速擴(kuò)繁手段，可充分發(fā)揮優(yōu)良種畜在品種改良和種群擴(kuò)繁中的潛力。胚胎移植效率的高低不僅受供受體年齡、環(huán)境條件、激素劑量的影響，還與季節(jié)的變化具有一定的相關(guān)性。前期研究表明，不同季節(jié)對無角道賽特、特克塞爾和德國美利奴供體羊的胚胎數(shù)、黃體數(shù)和可用胚胎數(shù)沒有影響，但是胚胎的可用率秋季顯著高于春季。夏季較為炎熱，手術(shù)容易造成感染。因此，本試驗在春、秋、冬三季對東弗里升奶綿羊進(jìn)行同期發(fā)情—超數(shù)排卵—手術(shù)沖胚—胚胎移植，對收集的胚胎進(jìn)行鑒定、統(tǒng)計和分析，并統(tǒng)計妊娠率和產(chǎn)羔率，旨在探究春、秋、冬三季進(jìn)行東弗里升奶綿羊體內(nèi)胚胎生產(chǎn)和移植的效果是否有差異，以揭示季節(jié)變化對東弗里升奶綿羊胚胎移植效果的影響。

1 材料

1.1 試驗動物

2018年4月份（春季）選用內(nèi)蒙古草原宏寶食品股份有限公司的12只進(jìn)口東弗里升奶綿羊為供體，85只本地烏珠穆沁羊為受體；2018年9月份（秋季）選用45只東弗里升奶綿羊為供體，373只烏珠穆沁羊為受體；2018年12月份（冬季）選用42只東弗里升奶綿羊為供體，476只烏珠穆沁羊為受體。供體母羊平均體重在53～88 kg之間，供受體母羊年齡均為2～3歲，胎次均為3～5胎，體況良好，無繁殖疾病。采精公羊性欲旺盛，精液品質(zhì)優(yōu)良，精子活力大于0.6。

1.2 藥品與試劑

促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）、孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），購自寧波三生生物科技有限公司；EAZI-BREED-CIDR（20個/袋）、Holding培養(yǎng)液（50 mL/袋），購自北京綠欣康農(nóng)牧科技有限公司；75%乙醇、碘伏、高濃度新潔爾滅、磺胺、維生素A-D、林可霉素、生理鹽水等，均為市購。

1.3 設(shè)備和器械

采精設(shè)備（假陰道）、精液品質(zhì)檢測顯微鏡、內(nèi)窺鏡輸精設(shè)備、手術(shù)架、沖卵管、恒溫板、體視鏡（型號為SZ61，購自O(shè)LYMPUS公司）、B超儀（型號為RKU10，購自徐州市凱信電子設(shè)備有限公司）、手術(shù)刀柄、直剪、止血鉗、子宮鉗、創(chuàng)巾鉗等。以上儀器、設(shè)備、用品均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實驗室提供。

2 方法

2.1 供體羊超數(shù)排卵

采用CIDR+FSH+PMSG法進(jìn)行超數(shù)排卵。第0天對供體羊埋置CIDR栓，同時肌肉注射3～5 mL維生素A-D。埋栓后第10天晚上18：00給供體羊注射FSH，采用7針注射法依次遞減，分別在06：00和18：00進(jìn)行注射，根據(jù)體重和手術(shù)次數(shù)調(diào)控劑量，總劑量區(qū)間為300～500 IU/只，第13天18：00注射最后一針FSH，同時取出CIDR栓，取栓12 h后立即注射PMSG 330～450 IU/只。

2.2 精子的采集與供體羊配種

供體羊在取栓后48～54 h進(jìn)行腹腔鏡人工輸精。將無傳染性疾病、性欲旺盛的公羊生殖器部位用紗布擦拭干凈，采精前找一只發(fā)情母羊，利用假陰道采集精液。提前組裝好內(nèi)窺鏡設(shè)備、輸精槍、手術(shù)器械及創(chuàng)巾等。首先，做好消毒工作，將內(nèi)窺鏡用新潔爾滅清洗干凈，輸精槍用生理鹽水清洗干凈；其次，在備好表皮的前提下進(jìn)行開口，位置在距離供體羊乳房下側(cè)8 cm左右，一般兩側(cè)對稱開口；最后，左手持內(nèi)窺鏡探入羊腹腔找到子宮角，右手利用準(zhǔn)備好的輸精槍將公羊精液輸入兩側(cè)各2孔，每孔輸精0.2 mL。

2.3 受體羊的處理和腹腔鏡胚胎移植

受體羊采用CIDR+PMSG法與供體羊同步埋栓，且同時取栓，第13天取栓時肌肉注射PMSG，劑量為330 IU/只。取栓后24～36 h試情，記錄受體羊發(fā)情情況。5～6 d后進(jìn)行胚胎移植，采用腹腔鏡觀察受體羊子宮兩側(cè)，單側(cè)發(fā)現(xiàn)1～3個黃體則可進(jìn)行移植，移植后肌肉注射土霉素3～5 mL消炎。

2.4 供受體羊術(shù)后管理

供受體羊術(shù)后分欄飼養(yǎng)，均衡營養(yǎng)，供給足量的清潔飲水，圈舍內(nèi)保持干燥整潔，防止術(shù)后感染。觀察1～2 d。

2.5 測定項目

腹腔鏡輸精5～6 d后，采用手術(shù)法從供體羊子宮角沖胚，沖胚時記錄左右側(cè)黃體數(shù)，在40倍體視顯微鏡下?lián)斐雠咛?，剔除未受精卵，計?shù)胚胎數(shù)，觀察胚胎狀態(tài)、色澤、大小、數(shù)量、飽滿度、桑椹胚及囊胚數(shù)。在受體羊胚胎移植45 d后進(jìn)行B超妊娠檢查，按照沖胚記錄統(tǒng)計單胚移植和雙胚移植妊娠數(shù)，統(tǒng)計妊娠率。145 d后分娩，記錄產(chǎn)羔數(shù)，產(chǎn)羔率。

2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel歸類匯總，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同季節(jié)對東弗里升奶綿羊超數(shù)排卵黃體數(shù)的影響

在東弗里升奶綿羊供體羊腹腔鏡輸精后5～6 d進(jìn)行手術(shù)沖胚，結(jié)果表明：供體羊左側(cè)黃體數(shù)為春季10.08枚，秋季8.18枚，冬季9.07枚，季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）；右側(cè)黃體數(shù)為春季7.50枚，秋季7.36枚，冬季8.14枚，季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）；總黃體數(shù)為春季17.58枚，秋季15.53枚，冬季17.21枚，季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）；春、秋、冬三季東弗里升奶綿羊左側(cè)黃體數(shù)、右側(cè)黃體數(shù)和總的黃體數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。具體見表1。

表1 東弗里升奶綿羊超數(shù)排卵黃體數(shù)測定結(jié)果Table 1 Superovulation corpus luteum number in East Friensian sheep

3.2 不同季節(jié)對東弗里升奶綿羊超數(shù)排卵回收卵數(shù)和可用胚胎數(shù)的影響

在東弗里升奶綿羊供體羊腹腔鏡輸精后5～6 d進(jìn)行手術(shù)沖胚，結(jié)果表明：供體羊左側(cè)子宮回收胚胎數(shù)為春季5.92枚，秋季7.76枚，冬季6.33枚，季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）；右側(cè)子宮回收胚胎數(shù)秋季（8.53枚）顯著高于春季（5.08枚）和冬季（5.69枚，P＜0.05）；回收胚胎數(shù)秋季（16.33枚）顯著高于春季（10.42枚）和冬季（12.19枚，P＜0.05）；可用胚胎數(shù)為春季9.08枚，秋季11.56枚，冬季9.36枚，季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）。說明秋季進(jìn)行東弗里升奶綿羊體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效果最佳。具體見表2。

表2 東弗里升奶綿羊超數(shù)排卵回收卵數(shù)和可用胚胎數(shù)測定結(jié)果Table 2 The number of eggs recovered from superovulation and the number of available embryos in East Friensian sheep

3.3 不同季節(jié)對東弗里升奶綿羊超數(shù)排卵胚胎質(zhì)量的影響

在東弗里升奶綿羊供體羊腹腔鏡輸精后5～6 d進(jìn)行手術(shù)沖胚，體視鏡下觀察胚胎質(zhì)量，結(jié)果表明：桑椹胚數(shù)為春季4.50枚，秋季6.98枚，冬季5.48枚，季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）；囊胚數(shù)為春季4.08枚，秋季4.33枚，冬季3.60枚，季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）。說明春、秋、冬三季東弗里升奶綿羊超數(shù)排卵所獲得的胚胎質(zhì)量沒有差異。具體見表3。

表3 東弗里升奶綿羊超數(shù)排卵胚胎質(zhì)量測定結(jié)果Table 3 The quality of superovulated embryos in East Friensian sheep

3.4 不同季節(jié)東弗里升奶綿羊受體移植不同數(shù)量胚胎對妊娠率的影響

在東弗里升奶綿羊供體羊腹腔鏡輸精后5～6 d后對供體母羊進(jìn)行胚胎回收，用腹腔鏡給受體羊進(jìn)行胚胎移植，在移植45 d后進(jìn)行妊娠檢查。結(jié)果表明，單胚移植妊娠率秋季（63.34%）和冬季（58.99%）顯著高于春季（32.79%，P＜0.05），雙胚移植妊娠率秋季（86.21%）顯著高于冬季（50.00%，P＜0.05）。具體見表4。

表4 東弗里升奶綿羊胚胎移植妊娠率測定結(jié)果Table 4 The pregnancy rate of East Friensian sheep by embryo transfer

3.5 受體移植對妊娠率和產(chǎn)羔率測定結(jié)果

在給東弗里升奶綿羊進(jìn)行胚胎移植45 d后進(jìn)行妊娠檢查，結(jié)果表明：妊娠率為秋季（66.21%）高于春季（51.76%）和冬季（60.71%），季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）；產(chǎn)羔率為春季（68.18%）高于秋季（67.83%）和冬季（65.13%），季節(jié)間均差異不顯著（P＞0.05）。說明春、秋、冬三季東弗里升奶綿羊產(chǎn)羔率沒有差異，但秋季東弗里升奶綿羊胚胎移植妊娠率最高。具體見表5。

表5 東弗里升奶綿羊胚胎移植妊娠率和產(chǎn)羔率測定結(jié)果Table 5 The pregnancy rate and lambing rate of East Friensian sheep by embryo transfer

4 討論

4.1 影響超數(shù)排卵因素分析

供體羊超數(shù)排卵效果與品種、年齡、飼養(yǎng)方式、季節(jié)、超排程序、激素、劑量等息息相關(guān)。高立芳等發(fā)現(xiàn)，采用CIDR+PG+FSH法進(jìn)行酉州烏羊超數(shù)排卵，5月份獲得的可用胚胎（11.76枚）顯著高于12月份（8.52枚，P＞0.05）。袁玉國等報道，對徐淮白山羊進(jìn)行超數(shù)排卵，供體可用胚胎數(shù)4—6月份（15.55枚）顯著高于10—12月份（13.15枚，P＞0.05）。本試驗結(jié)果表明，東弗里升奶綿羊供體羊可用胚胎數(shù)春季（9.08枚）、秋季（11.56枚）、冬季（9.36枚）之間差異不顯著（P＞0.05），與高立芳和袁玉國等的研究結(jié)果有所不同，可能是由于品種、環(huán)境、激素狀況不同等原因造成。代相鵬等對波爾山羊進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果表明，4月份可用胚胎數(shù)（12.40枚）與11月份（12.80枚）差異不顯著（P＞0.05），4月份黃體數(shù)（22.80枚）與11月份（17.60枚）差異不顯著（P＞0.05）。本試驗結(jié)果表明，可用胚胎數(shù)春季（9.08枚）、秋季（11.56枚）、冬季（9.36枚）之間差異不顯著（P＞0.05），黃體數(shù)春季（17.58枚）、秋季（15.53枚）、冬季（17.21枚）之間差異不顯著（P＞0.05）。這與代相鵬等的研究結(jié)果一致。易金云對黑薩?？撕投挪垂w母羊使用CIDR孕酮栓進(jìn)行同期發(fā)情，采用FSH+PMSG 7針遞減法進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果顯示，春季平均黃體數(shù)（16.80枚）高于秋季（10.20枚）。本試驗結(jié)果表明，東弗里升奶綿羊供體羊平均黃體數(shù)春季（17.58枚）高于秋季（15.53枚），本試驗所用超排程序和季節(jié)處理與易金云等的試驗一致，獲得的黃體數(shù)結(jié)果也一致。

4.2 單胚移植和雙胚移植對妊娠率的影響

在羊同期發(fā)情、超數(shù)排卵及胚胎移植過程中，卵泡成熟后如若受精則形成妊娠黃體，黃體通過分泌孕酮來維持母畜妊娠。因此，如果胚胎移植受體卵巢上形成的黃體數(shù)量較多妊娠率則高。胚胎質(zhì)量的優(yōu)劣及胚胎移植數(shù)量都是影響胚胎移植效率的重要因素。張紅等研究表明，移植胚胎的數(shù)量是決定妊娠率和胚胎存活率的關(guān)鍵因素。陳建泉等研究表明：移植2枚胚胎效果最佳，受體移植雙胚的妊娠率和胚胎存活率比移植單胚的高10%～15%；且2枚胚胎同時移植到黃體側(cè)，要比分別移植于兩側(cè)子宮角的妊娠率高。韓紅葉等研究發(fā)現(xiàn)，桑葚單胚移植妊娠率（71.80%）顯著低于雙胚移植妊娠率（82.4%，P＜0.05），囊胚單胚移植妊娠率（48.20%）顯著低于雙胚移植妊娠率（58.30%，P＜0.05）。本試驗結(jié)果表明，雙胚移植妊娠率為春季（75.00%）、秋季（86.21%）高于冬季（50.00%），與高志敏等及李俊杰等的研究結(jié)果一致。此外，本試驗中的供體母羊在腹腔鏡輸精后5～6 d時進(jìn)行手術(shù)沖胚，此時胚胎發(fā)育為桑葚胚和囊胚，更易附植，更適于受體子宮內(nèi)環(huán)境。該結(jié)果與洪瓊花等和K.F.Breuel等的報道一致。張金龍等的試驗結(jié)果表明，不論是囊胚還是桑葚胚，均是移植2枚胚胎的妊娠率顯著高于移植1枚胚胎。本試驗結(jié)果表明，春秋兩季雙胚移植優(yōu)于單胚移植，冬季則沒有表現(xiàn)出這種優(yōu)勢。

5 結(jié)論

選擇在春、秋、冬季節(jié)進(jìn)行胚胎移植都可獲得理想的效果，在秋季進(jìn)行超排和胚胎移植效果最佳，回收卵數(shù)和妊娠率最高，且雙胚移植效果最好。