血清外泌體中甲胎蛋白、高爾基體跨膜糖蛋白73、超氧化物歧化酶表達水平在肝癌診斷中的意義

李卓嫻,徐麗靜,溫小雨,孫玉浩,夏 猛 (廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200)

肝癌屬世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]，為全球范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的主要死亡原因，位居癌癥死亡原因的第四位[2]。中國是肝癌的高發(fā)地區(qū)，據(jù)全球腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2012年我國肝癌發(fā)病率占全球50%[3-4]?，F(xiàn)今對肝癌的治療主要賴于化療、介入治療、手術(shù)以及綜合治療等，雖手術(shù)切除或肝臟移植可根治肝癌，但由于肝癌發(fā)病隱匿，常無特異性癥狀，也無明顯陽性體征，而血清學(xué)檢測甲胎蛋白易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，準確率還有待提高[5]，且大部分肝癌患者一經(jīng)診斷，多為中晚期，錯過手術(shù)根治的機會。為此尋求更加有效的肝癌早期診斷方法極其必要。外泌體(exosome)是一種從細胞內(nèi)向胞外分泌的擁有典型脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的囊泡類小體[6]，攜帶著母細胞中多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA、RNA等重要信息并進行傳遞，存在于血漿、血清、羊水等多種生物體液中[7]。部分研究者發(fā)現(xiàn)，外泌體可參與、推動肝癌的發(fā)生發(fā)展，基于這些觀察，近年來多有研究者探索外泌體功能，并試圖以外泌體作為新型生物標志物，作為診斷或預(yù)后標志，尤以腫瘤領(lǐng)域較多[8]。甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，為現(xiàn)今診斷原發(fā)性肝癌特異性臨床指標[9]。高爾基體跨膜糖蛋白73(GP73)是肝癌早期診斷、術(shù)后評估復(fù)發(fā)病情的理想血清標志物[10]。而超氧化物歧化酶(SOD)又名肝蛋白，是一類可催化自由基如超氧陰離子進而發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶，通常SOD水平下降意味著衰老及死亡[11-12]。有學(xué)者研究表明，對肝癌血清標本進行生化檢測，以AFP、GP73、SOD三指標共同聯(lián)用有助于提高肝癌的診斷率[13]，但外泌體中相關(guān)指標是否與血液中的表達同步仍不明確，有待進一步研究。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2018年9月～2019年9月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院以及廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院住院治療的60例原發(fā)性肝癌患者為肝癌組，60名同期健康體檢者為對照組。肝癌組男38例，女22例，平均(55±6.1)歲；血清中AFP水平(671.1±87.8)ng/ml。對照組男39例，女21例；平均(52.5±8.3)歲；血清中AFP水平(8.4±0.9)ng/ml。對照組應(yīng)排除其他疾病，肝癌患者均以穿刺活檢或病理組織檢查確診。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1主要儀器及試劑：HT7800透射電鏡(日本電子公司)；50135643超速離心機(Thermo Fisher公司)；Exo Quick-TC外泌體提取試劑盒購自美國System Biosciences Inc公司；蛋白免疫印跡法(Western印跡)測定蛋白標志物CD63、Alix，Pierce山羊抗兔IgG、Pierce山羊抗鼠IgG均購自美國Santa cruz 公司；1×PBS購自中國索萊寶公司；Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、QuickBlock Western一抗稀釋液、QuickBlock Western二抗稀釋液購自中國碧云天公司。

1.2.2外周血中外泌體的分離以及鑒定：使用美國SBI公司提供的外泌體提取試劑盒，分別收集了肝癌組、對照組的血漿樣品，用以分離外周血外泌體，遵循試劑盒使用說明嚴格操作。以進一步通過Western印跡法檢測外泌體表面蛋白標志物Alix、CD63的表達，分析外泌體的分泌水平，以透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。

1.2.3乙酰膽堿酯酶(AchE)實驗測定外泌體濃度：采用AchE法可對純化的外泌體進行定量[14-15]，以100 mM雙硫代硝基苯甲酸(DTNB)作顏色指示劑，其于4℃條件可保存兩周；1 ml 1×PBS中制備28.9 mg碘代硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine iodide)作底物，于-20℃條件可保存1個月。將10 ml 1×PBS、200 μl底物、500 μl DTNB混合制備顯色劑。將50 μl的外泌體樣品添至96孔板中，使用AchE濃度從0.98～2 000 mU/ml制成標準曲線。將50 μl標準溶液添至單獨的孔中，再將200 μl顯色劑添入所有的孔中。等待20 min孵育，使用酶標儀在A450 nm波長測量AchE的吸光度值，依據(jù)標準曲線、樣品體積計算濃度。

1.3分析評估AFP、GP73、SOD的表達水平:使用電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法等方法測定血漿、外泌體中AFP、GP73、SOD的表達水平。通過檢測外周血和外周血外泌體中AFP、GP73、SOD表達水平，分析外泌體中相關(guān)指標是否與血液中相關(guān)指標的表達同步。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)選取SPSS23.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料組間比較使用獨立樣本的t檢驗驗證；計數(shù)資料組間比較使用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1外周血中外泌體的分離、鑒定:Western印跡法檢測外泌體標志蛋白Alix、CD63的表達水平見圖1；使用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，電鏡下可見提取的外泌體呈現(xiàn)圓形或橢圓形，大小不均，具備著明顯的膜性結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖1 外泌體標志蛋白Alix、CD63表達

2.2外泌體含量在肝癌患者外周血中增加：使用AchE法檢測外泌體濃度，并已通過Western Blot確認了外泌體的身份。經(jīng)AchE測定肝癌組及對照組的血漿樣本中的外泌體濃度發(fā)現(xiàn)，肝癌組的外泌體濃度為(376.02±55.0)mU/ml，高于對照組的(184.4±17.1)mU/ml，外泌體的釋放量高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖2A。Western Blot分析表明兩組外泌體樣本中的外泌體標志蛋白Alix、CD63的表達存在差異，肝癌組外泌體中Alix、CD63的表達高于對照組。見圖3。

圖2 電鏡下外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖3 兩組外泌體標志蛋白表達差異

2.3AFP、GP73、SOD在血漿、外泌體中的表達

2.3.1AFP在血漿、外泌體中的表達水平差異:對照組中AFP在血漿、外泌體中的表達水平均低于肝癌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；肝癌組中，AFP在血漿中的表達水平高于其在外泌體中的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 AFP 在血漿、外泌體中的表達水平差異

2.3.2GP73在血漿、外泌體中的表達水平差異:對照組中GP73的表達水平均低于肝癌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；肝癌組中，GP73在血漿中的表達水平高于其在外泌體中的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

表2 GP73在血漿、外泌體中的表達水平差異

2.3.3SOD在血漿、外泌體中的表達水平差異:對照組中SOD的表達水平均高于肝癌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；肝癌組中，SOD在血漿中的表達水平高于其在外泌體中的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表3。

表3 SOD在血漿、外泌體中的表達水平差異

3 討論

原發(fā)性肝癌(HCC)是一類多病因相關(guān)且廣泛流行的癌癥，為全球癌癥死亡的第四大原因[16]。肝癌的發(fā)病隱匿，早期常無特異性癥狀、陽性體征，通常在診斷時，約70%的患者已為晚期肝癌[17]，能夠根治肝癌治療方法是手術(shù)切除，但因大部分患者診斷肝癌時已為晚期，錯過了手術(shù)機會，尋求輔助肝癌早期診斷的手段及方法仍是當前亟待解決的關(guān)鍵問題。

目前臨床上多采用血清AFP作為診斷方法[18]，但其敏感性及特異性不高，容易被漏診誤診[19]，相關(guān)研究提示，AFP、GP73、SOD三者聯(lián)用的方法具有提高肝癌的診斷率的作用[19]。

AFP是一種糖蛋白，正常成年人血清中含量尚不到20 μg/L，當肝細胞發(fā)生癌變、病情惡化時，AFP在血清中的含量會急劇增加，因此AFP就成了診斷原發(fā)性肝癌的一個特異性臨床指標，可見在大約80%的肝癌患者血清中升高。但AFP對早期肝癌患者的陽性率僅為50%～60%[20]，且不易與肝炎、肝硬化等進行區(qū)分，大程度限制了肝癌的早期診斷。檢索現(xiàn)有文獻發(fā)現(xiàn)，雖血清AFP可作肝癌診斷指標之一，但從外泌體中AFP含量變化探討外泌體中AFP在肝癌診斷和治療作用的研究尚未見報道，因此有必要進一步探討外泌體中AFP含量，以進一步明確外泌體在肝癌診斷和治療評價中的作用和意義。

GP73是新興出現(xiàn)的對肝癌早期診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)病情評估的理想血清標記物[21-22]。GP73通常在肝細胞中幾乎不表達，但發(fā)生病變時若受病毒感染，其表達可顯著高于正常肝組織3～5倍。趙運勝等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者血清GP73水平顯著高于肝硬化和正常對照組，且其敏感性和特異性高于AFP。另有肝癌土撥鼠模型研究[25]發(fā)現(xiàn)，模型組GP73水平顯著高于正常對照組，說明GP73表達異常與肝癌有密切關(guān)系。更有相關(guān)研究[26]表明，GP73的敏感性、特異性遠高于40年前問世的AFP，可高達95%及74%，若聯(lián)合檢測將大幅提升肝癌診治水平。

SOD又名肝蛋白，是人體內(nèi)重要的抗氧化活性物質(zhì)，通常SOD水平下降意味著衰老及死亡。肝癌患者機體內(nèi)存在大量具有超氧化作用的活性氧[26]?；钚匝跤直环Q為機體垃圾，一旦過剩存在便會引起多種氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而損傷細胞，甚至造成細胞死亡。在肝細胞中SOD的活性最高，SOD可以與氧自由基造成的損害相對抗，并將過剩的氧自由基及其衍生物消除使細胞免受傷害，進而發(fā)揮抑制腫瘤生成的作用。研究表明[13]肝癌組SOD水平顯著低于肝硬化組和對照組，且在原發(fā)性肝癌的診斷中，AUC為0.791，可見SOD水平檢測用于原發(fā)性肝癌診斷具有一定的可行性。

近年來，外泌體作為包括癌癥在內(nèi)的不同疾病的新型生物標志物受到了越來越多的關(guān)注[27]。外泌體是一種由細胞向胞外分泌的囊泡類小體，可存在于多種生物體液中，可攜帶著多種蛋白質(zhì)、DNA及RNA等重要信息在細胞-細胞間進行物質(zhì)、信息的傳遞，同時外泌體存在于血液、汗液、尿液等體液中，取材相對簡單方便，使得外泌體可成為液體活檢的理想工具[28]。此外，外泌體在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用，而血清診斷指標AFP、GP73和SOD均有可作為外泌體診斷和治療評價的潛在指標，本研究在此基礎(chǔ)上進一步探討外泌體及其內(nèi)涵的AFP、GP73和SOD等聯(lián)合檢測在肝癌診斷中的作用，對于開發(fā)肝癌新的診斷工作和方法具有重要意義。

本次研究通過對臨床病例采用觀察發(fā)現(xiàn)，提取的外泌體Alix、CD63表達顯著，且在電鏡下觀察到了外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，確定該方法提取的外泌體可靠，且分析結(jié)果顯示肝癌組外泌體中AchE、Alix、CD63含量高于對照組，因此判定肝癌患者中外泌體釋放量高于對照組。經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法等檢驗發(fā)現(xiàn)，AFP、GP73在肝癌中的表達俱呈現(xiàn)上升趨勢，且在血漿中的表達均高于其在外泌體中的表達。SOD則在肝癌中呈現(xiàn)下降趨勢，其在血漿中的表達水平高于外泌體中的表達水平，AFP、GP73、SOD等三指標在血漿及外泌體中的趨勢均呈同步狀態(tài)。

外泌體作為新型的一種分子實體，能輔助肝癌的早期診斷，具有微創(chuàng)、敏感度高、特異性強等優(yōu)勢，且具有更高的穩(wěn)定性，隨著外泌體提取、檢測技術(shù)的發(fā)展，外泌體檢測將會具備更加良好的發(fā)展前景。此次研究表明，血清診斷指標AFP、GP73、SOD有望成為外泌體診斷肝癌及治療評價的潛在指標，外泌體診斷肝癌具備準確、快速、微創(chuàng)、高穩(wěn)定性等優(yōu)勢。