吡哆胺與辛伐他汀對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響及內(nèi)分泌調(diào)控意義

呂春鳳 (天津市北辰醫(yī)院,天津 300400)

神經(jīng)病理性疼痛屬于神經(jīng)科常見(jiàn)癥狀之一，是指在沒(méi)有外界刺激的條件下而感到的疼痛，是軀體感覺(jué)系統(tǒng)病變或疾病所直接導(dǎo)致的疼痛[1-2]。通常認(rèn)為該病癥與炎性反應(yīng)、血管病、腫瘤、外傷、糖尿病、頸椎病、卟啉病、真性紅細(xì)胞增多癥、中毒、精神性因素等有關(guān)[3]。臨床數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)糖尿病患者中，有高達(dá)約45%的患者會(huì)發(fā)生糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(DNP)，且發(fā)病率隨著糖尿病患者時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[4-5]。DNP主要是指以肢體遠(yuǎn)端受累為主的對(duì)稱性周?chē)窠?jīng)病理學(xué)疼痛及自主神經(jīng)異常，臨床表現(xiàn)包括麻木、肌肉深部疼痛、平衡障礙、燒灼樣及電擊樣疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏等現(xiàn)象[6]。目前仍然需要進(jìn)一步完善糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的診治手段。臨床治療DNP的藥物主要包括抗痙攣藥物、抗抑郁藥物及阿片類(lèi)藥物，一般是通過(guò)給藥控制患者機(jī)體的血糖水平和針對(duì)性干預(yù)患者病理生理機(jī)制[7-8]。其中吡哆胺是具有維生素B6作用的自然物質(zhì)之一，且臨床效應(yīng)要比維生素B6大數(shù)千倍。在已有研究報(bào)道中吡哆胺可用于改善糖尿病大鼠的腎臟功能和抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制，因此推測(cè)吡哆胺對(duì)于糖尿病并發(fā)癥起到很好的治療效果[9]。辛伐他汀屬于他汀類(lèi)藥物中的一種，除了傳統(tǒng)應(yīng)用于降低膽固醇、抗炎、鈣離子通道調(diào)節(jié)之外，還被應(yīng)用于坐骨神經(jīng)壓傷、慢性壓迫性損傷等動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能夠在一定程度上緩解神經(jīng)病理性疼痛的癥狀[10-11]。因此，本研究選取40只雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠作為研究對(duì)象，將其中30只構(gòu)建為糖尿病大鼠模型，根據(jù)不同給藥方式來(lái)綜合評(píng)價(jià)吡哆胺和辛伐他汀在DNP大鼠給藥治療中的應(yīng)用效果及內(nèi)分泌因子的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究選取培育8～10周的40只健康雄性SD大鼠作為研究對(duì)象，體重180～220 g，飼養(yǎng)于25℃左右的動(dòng)物房中，每天照明12 h，定期喂養(yǎng)食物和水。該研究按照實(shí)驗(yàn)方案開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格規(guī)范操作流程，不違背倫理要求。

1.2糖尿病大鼠模型的構(gòu)建及治療： 根據(jù)給藥方式的不同將大鼠分為D0組(正常對(duì)照)、D1組(給予吡哆胺)、D2組(給予辛伐他汀)、D3組(無(wú)菌水)，然后將D1組、D2組、D3組大鼠禁食12 h，禁水6 h，給各組大鼠腹腔注射一次性的60 mg/kg鏈脲佐菌素，3 d后通過(guò)剪尾法測(cè)定大鼠的血糖水平，當(dāng)血糖>16.8 mmol/L即為建模成功。建模成功后，每天給大鼠予以200 mg/kg的吡哆胺或辛伐他汀進(jìn)行灌胃處理，記錄大鼠第0、1、2、4、6、8天的血糖水平和體重變化。

1.3大鼠疼痛反應(yīng)檢測(cè)：①機(jī)械疼痛檢測(cè)：本研究采用北京友誠(chéng)嘉業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)的電子測(cè)痛儀(Electric VonFrey)檢測(cè)各組大鼠的機(jī)械刺激縮足反射閾值(PWMT)，測(cè)量前先讓大鼠在籠中適應(yīng)30 min，然后將籠子放在金屬網(wǎng)鐵架上，測(cè)量開(kāi)始后用金屬頭向大鼠后足底加壓刺激，大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)后記錄加壓刺激的最大值，記錄3次。②熱閾痛檢測(cè)：本研究采用四川佐誠(chéng)科技有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)熱輻射刺激儀檢測(cè)各組大鼠的熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)，測(cè)量前先讓大鼠在籠中適應(yīng)30 min，然后將籠子放在金屬網(wǎng)鐵架上，測(cè)量開(kāi)始后用激光儀照射大鼠足后底，大鼠突然抬足時(shí)即可停止并記錄照射時(shí)間，記錄3次。

1.4RAGE和p-NF-kB蛋白表達(dá)檢測(cè)：本研究采用免疫熒光染色檢測(cè)大鼠脊髓背角組織星形膠質(zhì)細(xì)胞的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和p-NF-kB蛋白表達(dá)。具體步驟：①將大鼠腰段脊髓組織制備成冰凍切片，室溫下放置20 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次；②將切片放置于1%的Triton X-100溶液培養(yǎng)20 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次；③將切片放在抗原修復(fù)液中20 min，用牛血清白蛋白培養(yǎng)1 h，棄掉封閉液，加入對(duì)應(yīng)的一抗工作液，4℃過(guò)夜；④用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗，室溫環(huán)境培養(yǎng)1 h，完成后棄掉二抗工作液，用防熒光猝滅封片劑封片。用熒光顯微鏡觀察拍照，采用ImageJ version 1.36b計(jì)算RAGE和p-NF-kB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。

1.5FGF-2蛋白檢測(cè)：本研究采用免疫組染檢測(cè)FGF-2水平。具體步驟：①首先將大鼠背根神經(jīng)節(jié)固定、包埋、連續(xù)切片，60℃烘干備用；②利用微波修復(fù)，磷酸鹽緩沖液洗滌3次；③3%的去離子水培育15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入稀釋好的一抗FGF-2，4℃下過(guò)夜；④加入聚合物輔助劑培育20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再加入生物素標(biāo)記的抗兔聚合物37℃培養(yǎng)30 min；⑤加入二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine)顯色30 min，自來(lái)水沖洗，中性樹(shù)膠封片。用武漢億凡光電有限公司生產(chǎn)的Olympus顯微鏡下選取10個(gè)高清視野區(qū)域，觀察并記錄陽(yáng)性細(xì)胞，采用福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算陽(yáng)性單位(PU值)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本研究數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0版本統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，D0、D1、D2、D3組大鼠的血糖、體重、PWMT、PWTL、RAGE、p-NF-kB蛋白表達(dá)、FGF-2S水平比較采用方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.14組大鼠血糖及體重變化:圖1為1周內(nèi)4組大鼠血糖及體重變化，可以看出D1、D2、D3組大鼠在1周內(nèi)的血糖及體重變化并不明顯，始終處于平穩(wěn)狀態(tài)，且3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D0組大鼠在1周內(nèi)的血糖始終D1、D2、D3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為4組大鼠血糖；B為4組大鼠體重；①表示相較于D0組，P<0.05圖1 4組大鼠血糖及體重變化

2.24組大鼠疼痛閾值比較：D0組大鼠的PWMT、PWTL 1周內(nèi)未發(fā)生明顯變化；D3組大鼠的PWMT、PWTL 1周內(nèi)隨時(shí)間推移而明顯下降，且顯著低于D0、D1、D2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D1、D2組大鼠的PWMT、PWTL 1周內(nèi)隨時(shí)間推移而稍有下降，但兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：A為4組大鼠PWMT；B為4組大鼠PWTL；①表示相較于D3組，P<0.05圖2 4組大鼠疼痛閾值比較

2.34組大鼠RAGE蛋白表達(dá)：如圖3所示，D3組大鼠的 RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于D1、D2組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D0組大鼠的 RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于D1、D2組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D1組和D2組大鼠的 RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖4為4組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞RAGE熒光染色結(jié)果，圖4A可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞亮度較低，RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯較少。圖4D可見(jiàn)RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯較多，亮度較大，高于圖4B、C。

注：①表示相較于D3組，P<0.05；②表示相較于D0組，P<0.05圖3 4組大鼠RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

注：A為D0組熒光染色；B為D1組熒光染色；C為D2組熒光染色；D為D3組熒光染色圖4 4組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞RAGE熒光染色結(jié)果(×200)

2.44組大鼠p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)：如圖5所示，D3組大鼠的p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于D1、D2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D0組大鼠的p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于D1、D2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D1組和D2組大鼠的p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖6為4組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞p-NF-κB熒光染色結(jié)果，圖6A可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞亮度較低，p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯較少。圖6D可見(jiàn)p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯較多，亮度較大。圖6B、C的p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量相差不大。

注：①表示相較于D3組，P<0.05；②表示相較于D0組，P<0.05

注：A為D0組熒光染色；B為D1組熒光染色；C為D2組熒光染色；D為D3組熒光染色圖6 4組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞p-NF-κB熒光染色結(jié)果(×200)

2.54組大鼠FGF-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)：D3組大鼠的FGF-2蛋白PU值明顯高于D1、D2、D3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D0組大鼠的FGF-2蛋白PU值表達(dá)率明顯低于D1、D2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D1組和D2組大鼠FGF-2蛋白PU值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。圖8A、8B、8C、8D為4組大鼠FGF-2蛋白免疫組染結(jié)果。圖8D可見(jiàn)大鼠背神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中存在大量的FGF-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性主要分布在胞核中，著色均為大片的黃色、棕黃色。圖8B、C可見(jiàn)部分FGF-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，著色為藍(lán)色或棕黃色，陽(yáng)性主要分布于胞核中。圖8A可見(jiàn)FGF-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞較少，出現(xiàn)不少藍(lán)色細(xì)胞區(qū)域。見(jiàn)圖7。

注：①表示相較于D3組，P<0.05；②表示相較于D0組，P<0.05圖7 4組大鼠FGF-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)

注：A為D0組免疫組染；B為D1組免疫組染；C為D2組免疫組染；D為D3組免疫組染圖8 4組大鼠FGF-2蛋白免疫組染圖(×400)

3 討論

疼痛疾病是一種世界性難題，其中糖尿病神經(jīng)病理性疼痛作為常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥狀，是由于多種途徑的綜合作用，包括多元醇途徑、蛋白激酶C途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物代謝途徑等，這些途徑都可能引發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)、基因表達(dá)改變、線粒體功能失衡，最終導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病變[12]。吡哆胺和辛伐他汀都是目前臨床研究中可能對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生治療效果的藥物[13]，所以本研究將8～10周的30只健康雄性SD大鼠構(gòu)建了糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型，并給予吡哆胺和辛伐他汀進(jìn)行藥物治療。結(jié)果與陳波等[14]的研究結(jié)果相類(lèi)似，表明吡哆胺和辛伐他汀兩種藥物對(duì)于糖尿病大鼠的血糖及體重都沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。與正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠建模后表現(xiàn)出多食、多飲、多尿的表現(xiàn)，毛發(fā)變黃，活力下降[15]。D3組大鼠的PWMT、PWTL 1周內(nèi)隨時(shí)間推移而明顯下降，且顯著低于D0、D1、D2組，說(shuō)明吡哆胺和辛伐他汀都能有效改善機(jī)械疼痛閾值，減輕大鼠的機(jī)械痛敏及熱痛閾。D1、D2組大鼠的PWMT、PWTL 1周內(nèi)隨時(shí)間推移而稍有下降，但兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說(shuō)明吡哆胺和辛伐他汀對(duì)于大鼠的機(jī)械痛敏和熱痛閾改善效果相近[16]。

D3組大鼠的 RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于D1、D2組，D1組和D2組大鼠的 RAGE蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與劉星玥等[17]的研究結(jié)果相類(lèi)似，表明糖尿病會(huì)導(dǎo)致大鼠脊髓背角中的RAGE表達(dá)升高，而吡哆胺和辛伐他汀都能夠在一定程度上降低RAGE的過(guò)表達(dá)，且改善效果相近。D3組大鼠的 p-NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于D1、D2、D3組，D1組和D2組大鼠的p-NF-κB的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這同樣表明吡哆胺和辛伐他汀對(duì)于p-NF-κB的激活有著較強(qiáng)的抑制作用，改善大鼠的神經(jīng)病變[18]。D3組大鼠的FGF-2蛋白PU值明顯高于D1、D2、D3組，D1組和D2組大鼠FGF-2蛋白PU值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與于婷等[19]的研究結(jié)果存在差異。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是分泌蛋白家族的一大種類(lèi)，已有研究證實(shí)其可以通過(guò)自分泌、內(nèi)分泌等途徑參與機(jī)體內(nèi)多種不同的生理生化反應(yīng)，而FGF-2作用其中一種內(nèi)分泌因子，也在糖尿病大鼠內(nèi)分泌調(diào)控中起到了相應(yīng)作用[20]。由此，結(jié)果表明正常大鼠的FGF-2蛋白表達(dá)較低，而糖尿病大鼠呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示FGF-2參與了大鼠神經(jīng)病理疼痛的產(chǎn)生和維持，而吡哆胺和辛伐他汀則可以降低FGF-2的表達(dá)。

本研究將8～10周的30只健康雄性SD大鼠構(gòu)建了糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型，并分別給予吡哆胺和辛伐他汀進(jìn)行藥物治療，10只正常大鼠作為對(duì)照。通過(guò)比較各組大鼠的機(jī)械疼痛、熱閾痛、RAGE、FGF-2和p-NF-κB蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌因子FGF-2參與了大鼠神經(jīng)病理疼痛的產(chǎn)生和維持。吡哆胺和辛伐他汀能夠通過(guò)抑制RAGE、p-NF-κB的激活及FGF-2蛋白的表達(dá)，來(lái)有效減輕糖尿病大鼠的機(jī)械痛敏及熱閾痛，且改善效果相近。但是本研究并沒(méi)有更為細(xì)致的劃分吡哆胺和辛伐他汀的用量，來(lái)探討最佳用藥量的選擇，后續(xù)考慮加大大鼠的樣本量，做進(jìn)一步分析?？傊?，本研究結(jié)果為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的治療提供了理論基礎(chǔ)。