前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9作為評價食管病變內(nèi)鏡下黏膜下剝離術(shù)后患者感染狀況的新標(biāo)志物

鄒燕婷，寧柳心，馬麗黎，蔡 瑜，張順財，徐蓓莉*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科，上海 200032

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心，上海 200032

內(nèi)鏡下黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosal dissection，ESD）是一種微創(chuàng)手術(shù)，住院時間短，廣泛應(yīng)用于胃腸道淺表腫瘤性病變。然而，由于手術(shù)過程中缺損的黏膜暴露于胃腸道菌群中，可能會出現(xiàn)菌血癥和（或）內(nèi)毒素血癥。發(fā)熱可能是手術(shù)感染的第1個臨床癥狀。美國胃腸內(nèi)鏡協(xié)會（ASGE）建議ESD手術(shù)期間不需常規(guī)使用抗生素預(yù)防感染，因為菌血癥發(fā)生較少且一般持續(xù)時間較短［1］。盡管菌血癥的發(fā)生率較低，但這種情況可能會引發(fā)感染性心內(nèi)膜炎等嚴(yán)重感染，導(dǎo)致嚴(yán)重后果。因此，依靠血清標(biāo)志物及早發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染并評估其嚴(yán)重程度是極其重要的。

在目前的研究［2-4］中，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）被證明是感染期間先天性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，PCSK9在感染性休克中被證實快速上調(diào)。在腸源性內(nèi)毒素血癥肝硬化大鼠中，肝臟PCSK9表達(dá)明顯增加［5］。在盲腸結(jié)扎穿刺誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中，PCSK9過表達(dá)也會加劇IL-6的產(chǎn)生［3］。因食管具有壁薄、易出血、靠近重要器官和動脈的特征，食管ESD比胃和結(jié)直腸病變更困難，風(fēng)險更大，術(shù)后感染狀態(tài)的監(jiān)測非常重要。本研究旨在評估PCSK9對食管ESD后早期感染和感染嚴(yán)重程度的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年3月1日至2017年10月30日在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院被診斷為食管淺表病變并接受ESD治療的65例患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）在過去7 d內(nèi)以任何理由使用抗生素；（2）在ESD手術(shù)期間出現(xiàn)任何其他感染跡象；（3）患有慢性非傳染性炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、炎癥性腸??；（4）在ESD前1 d體溫高于37℃；（5）出現(xiàn)內(nèi)鏡下治療引起的并發(fā)癥，如穿孔或大出血等；（6）患有高脂血癥。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（Y2016-156）。

ESD的手術(shù)指征：食管的高級別上皮內(nèi)瘤變或超聲內(nèi)鏡證實侵入深度僅限于食管黏膜層的腫瘤，且由CT證實無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 ESD手術(shù)過程在病灶外緣5 mm處進(jìn)行電凝標(biāo)記（APC300, ERBE），向黏膜下組織注射少量生理鹽水、腎上腺素、靛胭脂（10∶1∶5）配制的液體，以抬起病變。使用鉤刀（KD-620LR，奧林巴斯）或絕緣頭刀（KD-611L，IT2，奧林巴斯）進(jìn)行黏膜切開及黏膜下剝離，同時使用凝固器（FD-410LR，奧林巴斯）止血。

1.3 圍手術(shù)期管理住院期間監(jiān)測感染性和出血性并發(fā)癥。在圍手術(shù)期，如果沒有觀察到感染的臨床跡象，則不使用預(yù)防性抗生素。ESD后評估手術(shù)時間、傷口大小和體溫。計算從電凝標(biāo)記到創(chuàng)面凝固完成的時間。將切除的標(biāo)本放置于軟木板上平整拉開，用大頭針固定，取標(biāo)本最大的長度和寬度計算傷口區(qū)域。如果同時切除≥2個病灶，則將其總數(shù)作為一個區(qū)域處理。

所有患者ESD后每日監(jiān)測體溫，達(dá)到37.5℃及以上為發(fā)熱標(biāo)準(zhǔn)，體溫≥38℃時進(jìn)行血培養(yǎng)。術(shù)前及術(shù)后第1天上午檢測外周血白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、中性粒細(xì)胞計數(shù)、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子及血清脂多糖、PCSK9水平，評估炎癥反應(yīng)，并同時檢測肝腎功能等。如果患者術(shù)后第2天沒有胸痛、呼吸困難等癥狀，則開始流質(zhì)飲食。

1.4 血培養(yǎng)當(dāng)體溫達(dá)到38℃時，抽取2套靜脈血行需氧菌、厭氧菌及真菌培養(yǎng)以評估感染情況。血液樣本在35℃下培養(yǎng)3 d，如果有細(xì)菌生長，則行微生物鑒定及抗生素敏感試驗。

1.5 ELISA檢測血清LPS和PCSK9采集血液樣本置于含有促凝劑的采血管中，30 min內(nèi)1 000 r/min離心15 min，收取上層血清保存于－80℃。根據(jù)說明書，使用ELISA分別測定血清LPS（武漢華美）和PCSK9（R&D systems DPC900）水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 23.0或GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s或M（P25,P75）進(jìn)行匯總。組間差異根據(jù)數(shù)據(jù)分布情況通過Student’st檢驗、配對樣本t檢驗、單因素方差分析、秩和檢驗確定。采用Pearson相關(guān)系數(shù)評估血清PCSK9與LPS水平的關(guān)系。檢驗水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析結(jié)果（表1）顯示：共納入患者65例，中位年齡為57歲，53.85%為男性。圍手術(shù)期患者肝腎功能無明顯改變。所有靶病灶均進(jìn)行完整切除，側(cè)切緣和基底緣均未發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤。病理診斷為高級別上皮內(nèi)瘤變、鱗狀細(xì)胞癌或腺癌，局限于SM1（＜200 μm）。中位手術(shù)時間為47.0（36.0，59.5）min，平均切除病灶面積為（9.23±4.65） cm2。

表1 所有患者的一般資料分析

ESD后第1天出現(xiàn)發(fā)熱者37例，體溫達(dá)38℃者12例，其中1例最高體溫達(dá)39℃，血培養(yǎng)脆弱擬桿菌陽性，對常用抗生素敏感，且該患者術(shù)后PCSK9水平最高。WBC最高24.15×109/L、中性粒細(xì)胞計數(shù)最高21×109/L、血清PCSK9最高水平461.67 ng/mL、IL-6最高水平為86.3 pg/mL。體溫37.5～37.9℃的患者根據(jù)癥狀、化驗結(jié)果等確定是否給予抗生素治療，12例體溫達(dá)到38℃的患者均給予抗生素治療，所有發(fā)熱患者體溫均在2 d內(nèi)恢復(fù)正常。

2.2 ESD前后炎癥相關(guān)指標(biāo)的比較結(jié)果（表2）顯示：術(shù)后WBC、中性粒細(xì)胞計數(shù)、CRP、IL-6均較ESD前明顯升高。而ESR、TNF-α無明顯差異。

表2 ESD前后炎癥相關(guān)指標(biāo)的比較

2.3 ESD后血清LPS和PCSK9水平升高進(jìn)一步檢測ESD前后第1天的血清LPS和PCSK9水平（圖1）發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患者血清LPS水平明顯升高［（233.69±43.79）pg/mLvs（269.29±52.11）pg/mL，P＜0.001］。同時PCSK9水平也明顯升高［（230.97±37.14） ng/mLvs（301.24±60.92）ng/mL，P＜0.001］。

圖1 ESD前后患者血清LPS和PCSK9水平的變化

2.4 與體溫相關(guān)的炎癥標(biāo)志物的分層分析為明確炎癥標(biāo)志物與體溫升高的相關(guān)性，將患者按術(shù)后體溫高低分組后進(jìn)行比較，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)：與體溫＜37.5℃組相比，體溫≥37.5℃組術(shù)后的WBC、中性粒細(xì)胞計數(shù)、CRP、IL-6、LPS、PCSK9水平明顯更高。

表3 不同體溫組炎癥標(biāo)記水平的比較

結(jié)果（表4、圖2）顯示：12例體溫≥38℃的患者均進(jìn)行血培養(yǎng)，最終只有1例陽性（PCSK9 461.67 ng/mL、IL-6 6.0 pg/mL、LPS 340.00 pg/mL）。為明確感染情況，將發(fā)熱隊列分為37.5℃≤體溫＜38℃ 組 和 體 溫≥38℃ 組。 體 溫≥38℃ 組WBC、中性粒細(xì)胞計數(shù)均高于37.5℃≤體溫＜38℃組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而血清PCSK9和IL-6升 高（P＜0.05）。 體 溫≥38℃ 組PCSK9、IL-6的均值和中位數(shù)分別為（355.29±56.17）ng/mL、31.8（13.3, 45.6）pg/mL，37.5℃≤體溫＜38℃組為（304.19±60.91） ng/mL、10.2（5.0, 16.4）pg/mL（P＝0.020，P＝0.017）。

圖2 37.5℃≤體溫＜38℃組與體溫≥38℃組患者術(shù)后血清PCSK9和IL-6水平

表4 發(fā)熱組炎癥標(biāo)記物的分層分析

2.5 體溫≥38℃患者血清PCSK9與LPS正相關(guān)結(jié)果（圖3）顯示：對于體溫≥38℃患者，ESD術(shù)后血清PCSK9與LPS水平的相關(guān)系數(shù)為0.720（P＝0.011）。

圖3 體溫≥38℃患者ESD術(shù)后血清PCSK9與LPS水平的相關(guān)性

3 討 論

本研究率先探討血清PCSK9水平在檢測ESD后早期感染的價值。根據(jù)ASGE指南［6］，在食管擴張、靜脈曲張硬化治療、內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影術(shù)和超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢中，提倡適當(dāng)預(yù)防性使用抗生素，其他內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)或ESD不需要常規(guī)的圍手術(shù)期抗生素預(yù)防。術(shù)后菌血癥的發(fā)生率很低，食管近1%［7］、胃2%～4%［8-9］、結(jié)直腸0～2.5%［10-11］，而術(shù)后內(nèi)毒素血癥可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)［9］。ESD手術(shù)后出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，臨床醫(yī)生很難確定是否由感染引起。由于血培養(yǎng)所需時間較長且陽性率較低，炎癥標(biāo)志物如CRP、ESR和降鈣素原被廣泛應(yīng)用。然而，其局限性在一定程度上仍然存在。CRP在許多非感染性疾病中也有升高［12］；而ESR半衰期長，在評估慢性炎癥方便作用較大［13］；降鈣素原廣泛用于評估全身性感染，特別是敗血癥，但其在局部感染的評估方面可能作用較為有限［14］。因此，需要一種新的生物標(biāo)志物來幫助識別是否存在ESD術(shù)后感染及其嚴(yán)重程度。

PCSK9是一種絲氨酸蛋白酶，可通過低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）抑制循環(huán)中內(nèi)源性脂質(zhì)清除以調(diào)節(jié)高膽固醇血癥［15］。LDLR可結(jié)合病原菌脂質(zhì)，如革蘭陰性細(xì)菌的脂多糖［16］和真菌的磷脂甘露聚糖［17］，將其從血液中清除。PCSK9在分泌進(jìn)入循環(huán)之前主要在肝細(xì)胞中產(chǎn)生［18］，在小腸、腎臟和大腦中也有少量產(chǎn)生［19］。PCSK9在冠心病等動脈粥樣硬化疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［20］，此外，PCSK9在感染中也發(fā)揮一定作用。感染特別是內(nèi)毒素引起的感染，可上調(diào)PCSK9的產(chǎn)生。PCSK9過表達(dá)可導(dǎo)致肝細(xì)胞LDLR降低，從而降低肝臟對病原體脂質(zhì)（包括LPS）的清除率［21］。肝臟解毒功能的喪失加速了全身細(xì)菌傳播，導(dǎo)致多器官衰竭和組織炎癥，因此，PCSK9可能成為一種新的識別體內(nèi)感染狀態(tài)的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)ESD前后WBC、中性粒細(xì)胞計數(shù)、CRP、IL-6、LPS和PCSK9水平存在顯著差異，均在術(shù)后明顯升高。這可能與ESD引起多種不同程度的炎癥反應(yīng)相關(guān)。同時，術(shù)后ESR和TNF-α并沒有明顯的升高，這可能是由于這些標(biāo)志物不能反映較早期的炎癥水平。

為了確定PCSK9與ESD術(shù)后感染的關(guān)系，本研究按體溫區(qū)間分層分析了血清PCSK9和LPS濃度發(fā)現(xiàn)，65例患者中發(fā)熱37例，體溫≥38℃者12例。與體溫＜37.5℃組相比，發(fā)熱組血清LPS、PCSK9和IL-6水平顯著升高。因此內(nèi)毒素血癥可能是發(fā)熱的主要原因。而在體溫≥38℃和37.5℃≤體溫＜38℃ 2組中，LPS濃度無顯著差異，這可能與本研究樣本量不夠充足有關(guān)。與LPS不同的是，血清PCSK9的水平與體溫的升高保持同步。

本研究中血培養(yǎng)陽性患者PCSK9水平最高，提示PCSK9的快速變化可能是菌血癥的可靠指標(biāo)。IL-6是一種主要由巨噬細(xì)胞在識別病原體相關(guān)分子模式后迅速產(chǎn)生的細(xì)胞因子，表現(xiàn)出的變化趨勢與血清PCSK9相同。在盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中，血清IL-6在膿毒癥早期增加，并隨著穿孔修復(fù)而下降，并與PCSK9的過表達(dá)相關(guān)［22］。雖然本研究中沒有發(fā)現(xiàn)PCSK9和IL-6之間的顯著相關(guān)性，但PCSK9在早期感染中升高似乎仍然具有一定的意義。

此外，鑒于體溫≥38℃組中LPS和PCSK9的平均濃度較高，進(jìn)一步檢測這2個指標(biāo)是否存在相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)系數(shù)為0.720（P＝0.011）。因此，體溫≥38℃時，PCSK9與LPS水平密切相關(guān)，這可能與細(xì)菌感染的刺激和PCSK9的增加抑制其降解有關(guān)。由于本研究樣本中體溫≥38℃的患者數(shù)量有限，后續(xù)需要擴樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究，以驗證目前的研究結(jié)果，從而明確不同感染的嚴(yán)重程度的PCSK9水平的閾值。

綜上所述，本研究擴展了PCSK9對ESD后早期感染的預(yù)測作用。循環(huán)PCSK9水平在嚴(yán)重感染（如敗血癥）時顯著升高。食管ESD相關(guān)內(nèi)毒素血癥可能與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)；PCSK9有潛力成為檢測ESD圍手術(shù)期感染狀態(tài)的敏感和早期診斷標(biāo)志物。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。