法尼酯X受體激動劑GW4064減輕小鼠膿毒癥誘導的炎癥反應(yīng)和急性腎損傷

任 婷，徐素娟，汪小燕，鄒周平，丁小強,2,3，賈 平,2,3*

1.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200032

2.上海市腎病與透析研究所，上海 200032

3.上海市腎臟疾病與血液凈化重點實驗室，上海 200032

急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）是一種由多種因素引起、以腎功能迅速下降為特征的臨床綜合征［1］。膿毒癥是引起AKI的主要原因之一，尤其在重癥監(jiān)護室，超過50%的AKI由膿毒癥引起［2］，且此類患者死亡率高達60%［3］。膿毒癥AKI發(fā)病機制復(fù)雜，主要包括腎血流動力學改變、免疫細胞活化、促炎因子大量生成和內(nèi)分泌失調(diào)等［4］。目前尚缺乏有效的防治措施。

法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）屬于配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族，主要在肝、腸、腎和脂肪組織中表達［5］。近年來，F(xiàn)XR在膽汁代謝［6］、免疫調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝［7］等多方面的作用已被證實，尤其是FXR作為膽汁酸穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)膽固醇、脂質(zhì)和葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用。同時，越來越多的文獻［8-9］表明FXR在調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的作用。FXR作為多種疾病的重要靶點，其在AKI中的作用鮮有報道。合成藥物GW4064作為FXR的高親和力激動劑，表現(xiàn)出較高的受體特異性和有效性［10］。本研究通過構(gòu)建小鼠膿毒癥AKI模型，觀察膿毒癥對腎臟FXR表達的影響，及FXR激活對膿毒癥誘導的炎癥反應(yīng)和AKI的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑采用6～8周齡C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自上海杰斯捷實驗動物有限公司。DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑和實時熒光定量PCR試劑購于TaKaRa公司，Trizol購于美國Sigma-Aldrich公司，膠原酶Ⅳ購于美國Sigma-Aldrich公司，胰蛋白酶抑制劑、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和氫化可的松均購于索萊寶公司，percoll液購于Coolaber公司，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和GW4064購于美國Sigma-Aldrich公司，F(xiàn)XR抗體購于R&D和Biorbyt公司，β-actin抗體購于中杉金橋公司，肌酐檢測試劑盒購于BioAssay Ststems公司。本研究引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 動物模型和實驗分組小鼠隨機分為4組：生理鹽水（normal saline, NS）組、LPS組、LPS＋溶劑對照組（dimethyl sulfoxide，DMSO）和LPS＋FXR激動劑（GW4064）組，每組5～8只。LPS組小鼠腹腔注射LPS，劑量為10 mg/kg，NS組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，后2組分別在LPS注射前5 d始連續(xù)腹腔注射GW4064 30 mg/kg或DMSO。麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，取其腎臟組織進行后續(xù)實驗。本研究通過復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院動物實驗倫理審查委員會批準（2021-406）。

1.3 小鼠原代腎小管上皮細胞（primary tubular epithelial cells，PTECs）分離和提取頸椎脫臼6～8周齡C57野生型雄性小鼠，放至75%的乙醇中浸泡5 min，取出小鼠腎臟，放入4℃預(yù)冷的Hanks液中。在超凈臺中剝離腎包膜，Hanks液晃洗腎臟3～5遍，在5 mL滅菌EP管中將腎臟剪碎成1 mm3大小，將剪碎的腎臟組織放入5 mL細胞消化液（1.5 mg/mL膠原酶Ⅳ＋1.5 mg/mL胰蛋白酶抑制劑）中，37℃，120 rpm消化1 h；加入FBS終止消化；過40 μm篩網(wǎng)，100×g，4℃離心3 min，棄上清液；適量Hanks液重懸后，100×g，4 ℃離心3 min，棄上清；適量DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后，100×g，4℃離心3 min，棄上清；用5 mL DMEM/F12重懸沉淀，加入50% percoll液上方，14 000r/min，4 ℃離心1 h；最上面一層為近端腎小管細胞，緩慢吸取最上層液體，1 000r/min，4 ℃離心5 min，棄上清；用含10%FBS的原代細胞培養(yǎng)液（DMEM/F12培養(yǎng)基＋維生素C＋氫化可的松＋胰島素＋轉(zhuǎn)鐵蛋白）培養(yǎng)24 h后換液［11］。

1.4 細胞培養(yǎng)和處理取小鼠PTECs先于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待細胞擴增至60%～70%，隨機分為4組：NS組、LPS組、LPS＋溶劑對照組和LPS＋GW4064組。LPS組細胞加入1 000 ng/mL LPS，培養(yǎng)24 h；NS組加入等量生理鹽 水；LPS＋GW4064 組 以 5 μmol/L GW4064［12］預(yù)處理細胞24 h，LPS＋溶劑對照組給予等量DMSO后，加入1 μg/mL LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 免疫組化染色小鼠腎組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，抗原修復(fù)，3%BSA室溫封閉30 min，加入抗FXR抗體（1∶200，orb156973，Biorbyt公司）4℃孵育過夜，帶有生物標記的二抗37℃孵育1 h，DAB顯色，光鏡下觀察腎組織切片染色。

1.6 Western免疫印跡法提取小鼠PTECs蛋白后，經(jīng)8%SDS-PAGE電泳，300 mA濕轉(zhuǎn)90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗FXR抗體（1∶1 000，PP-A9033-00，R&D公司）4℃孵育過夜；β-actin抗體為內(nèi)參（1∶1 000，TA-09，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。采用TBST洗膜3遍，每遍10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3遍，每遍5 min，最后利用ECL顯影。

1.7 RT-PCR檢測小鼠腎組織或細胞內(nèi)加入TRIzol，然后采用氯仿、異丙醇分離RNA， DEPC水配置的75%乙醇洗滌后，溶于DEPC水中，檢測RNA濃度，以500 ng體系按照PrimeScript RT Master Mix試劑盒（TaKaRa公司，日本）說明進行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Premix ExTaq（TaKaRa公司，日本）進行PCR反應(yīng)。采用β-actin作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 基因引物序列表

1.8 血清肌酐水平檢測采用肌酐測定試劑盒（BioAssay Systems）配置標準液，吸取標準品和血清樣本30 μL至96孔板中；A液和B液按1∶1配置肌酐測定工作液，每孔200 μL，510 nm測定0 min時的吸光度；37℃避光孵育 5 min，再次測定5 min時的吸光度，根據(jù)標準品的濃度計算每個樣品的濃度。

1.9 統(tǒng)計學處理采用GraphPad軟件，正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，2組之間比較采用t檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 LPS誘導小鼠腎臟炎癥反應(yīng)和AKI結(jié)果（圖1A）顯示：與NS組相比，LPS組小鼠在LPS注射6 h后腎組織出現(xiàn)水腫，炎性細胞浸潤；12 h后出現(xiàn)散在空泡變性；24 h后表現(xiàn)為廣泛的空泡變性，并伴有散在腎小管上皮細胞壞死脫落。血清肌酐檢測結(jié)果（圖1B）顯示：LPS注射后12 h、24 h，LPS組小鼠血肌酐濃度明顯高于NS組（P＜0.01）。通過RT-PCR檢測腎組織勻漿中炎癥因子和趨化因子表達水平（圖1C、1D）發(fā)現(xiàn)，LPS處理后6 h、12 h和24 h腎臟促炎細胞因子白細胞介素6（interleukin 6, IL-6）和趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）均明顯上調(diào)（P＜0.01）。

圖1 LPS誘導小鼠腎臟炎癥反應(yīng)和AKI

2.2 GW4064對小鼠膿毒癥AKI和炎癥反應(yīng)的減輕作用LPS組和LPS＋溶劑對照組小鼠腎臟病理H-E染色（圖2A）顯示，2組小鼠均有腎間質(zhì)水腫、明顯的炎細胞浸潤和腎小管上皮細胞變性，并有散在的細胞壞死，而LPS＋GW4064組小鼠腎組織損傷明顯減輕，僅表現(xiàn)為腎臟間質(zhì)水腫和少量炎性細胞浸潤。腎臟組織切片F(xiàn)4/80免疫組化染色（圖2B、2C）顯示，與NS組比較，LPS組和LPS＋溶劑對照組小鼠腎臟均有明顯的巨噬細胞浸潤；而與LPS組和LPS＋溶劑對照組比較，LPS＋GW4064組小鼠腎臟巨噬細胞浸潤明顯減少，血肌酐水平（圖2D）也顯著下降（P＜0.05），腎組織勻漿中促炎因子IL-6（圖2E）和趨化因子CCL2（圖2F）表達明顯下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 GW4064對小鼠膿毒癥AKI和炎癥反應(yīng)的減輕作用

2.3 LPS對小鼠腎臟和PTECs的FXR表達的抑制作用腎組織切片免疫組化染色結(jié)果（圖3A）顯示，F(xiàn)XR主要表達于正常腎小管上皮細胞胞核內(nèi)，經(jīng)LPS處理后FXR表達明顯下調(diào)。檢測LPS處理不同時間點小鼠腎臟FXR mRNA水平（圖3B）顯示，LPS處理12 h后FXR表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。進一步分離PTECs，在體外檢測LPS對上皮細胞FXR表達的影響，Western免疫印跡法和RT-PCR結(jié)果（圖3C、3D）均顯示，與NS組相比，LPS 500 ng/mL和1 000 ng/mL 處理PTECs后FXR蛋白和mRNA水平明顯下調(diào)。

圖3 LPS對小鼠腎臟和PTECs的FXR表達的抑制作用

2.4 FXR對LPS誘導的腎小管上皮細胞促炎因子的抑制作用利用RT-PCR檢測PTECs促炎因子表達水平結(jié)果（圖4A）顯示，與NS組相比，不同濃度的LPS處理PTECs后，炎癥因子IL-6表達均顯著上調(diào)（P＜0.01）。相較于NS組，1 000 ng/mL LPS處理PTECs趨化因子CCL2的mRNA水平也顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖4B。與LPS組和LPS＋溶劑對照組相比，LPS＋GW4064組炎癥因子IL-6表達（圖4C）明顯下調(diào)（P＜0.05）；趨化因子CCL2的生成（圖4D）也明顯減少（P＜0.01）。

圖4 FXR對LPS誘導的腎小管上皮細胞促炎因子的抑制作用

3 討 論

膿毒癥AKI仍是危急重癥領(lǐng)域的常見疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。臨床研究［13］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者合并AKI死亡率明顯高于單純膿毒癥患者。炎癥反應(yīng)在膿毒癥AKI發(fā)生中發(fā)揮重要作用，促炎因子IL-6作為機體免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，在膿毒癥小鼠腎臟中顯著上調(diào)［14］。膿毒癥一方面誘導腎小管上皮細胞生成多種促炎因子［15］，另一方面，腎臟產(chǎn)生的趨化因子如CCL2可調(diào)節(jié)中性粒細胞和單核/巨噬細胞募集到腎組織［16］，引起炎細胞浸潤并分泌促炎細胞因子，進一步加重炎癥反應(yīng)，促進AKI發(fā)生。而抑制促炎因子和趨化因子的生成，可減輕膿毒癥引起的AKI。已有研究［17］證實，巨噬細胞在膿毒癥誘導AKI發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在小鼠膿毒癥模型中，LPS引起巨噬細胞浸潤腎臟組織，活化的巨噬細胞產(chǎn)生如TNF-α等多種炎癥細胞因子，促進AKI發(fā)生。Gong等［18］研究證實，F(xiàn)ractalkine（CX3CL1）敲除可通過抑制Wnt/β-catenin通路抑制巨噬細胞活化，減少多種炎癥細胞因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導小鼠腎臟巨噬細胞浸潤和炎癥反應(yīng)，而FXR激動劑GW4064可明顯抑制腎臟巨噬細胞浸潤。膿毒癥AKI腎臟病理損傷除了炎癥反應(yīng)外，還可表現(xiàn)為細胞凋亡與非特異性改變，如腎小管上皮細胞空泡樣變性、細胞腫脹和刷狀緣消失等［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS促進腎臟和腎小管上皮細胞炎癥因子IL-6和趨化因子CCL2表達增加，腎間質(zhì)水腫、炎細胞浸潤，細胞空泡樣變性，腎小管壞死脫落，進而引起腎功能損傷。

FXR是核受體超家族成員，在腸肝循環(huán)調(diào)節(jié)和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。既往FXR的研究主要集中在肝臟，在肝臟中參與調(diào)節(jié)代謝［20］，具有抗炎特性［21］。另外，F(xiàn)XR激活可減少肝臟促纖維化相關(guān)基因表達［22］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中，F(xiàn)XR通過激活抗炎巨噬細胞，抑制T細胞介導的自身免疫，以IL-10依賴的方式抑制神經(jīng)組織的炎癥損傷［23］。在腎臟方面，Wang等［22,24］研究證實FXR/TGR5雙激動劑可抑制糖尿病腎病和肥胖相關(guān)腎病的進展；FXR與YAP之間交互作用可以抑制腎臟纖維化［25］。Kim等［26］研究表明，F(xiàn)XR通過調(diào)控細胞自噬和凋亡抑制AKI向慢性腎臟病的進展。本研究通過構(gòu)建小鼠膿毒癥體內(nèi)外模型發(fā)現(xiàn)，LPS抑制腎臟和腎小管上皮細胞FXR表達；采用FXR激動劑（GW4064）可顯著降低膿毒癥小鼠血清肌酐濃度；FXR激活可顯著抑制腎臟和PTECs炎癥因子IL-6和趨化因子CCL2生成，減輕LPS誘導的腎臟炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究利用小鼠體內(nèi)外模型證實FXR對LPS誘導AKI的保護作用，表明FXR激活可減少LPS誘導的腎小管上皮細胞促炎因子生成，減輕腎臟炎癥反應(yīng)和AKI，為臨床防治膿毒癥急性腎損傷提供新的思路和手段。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。