煙草MRS2/MGT基因家族的鑒定與表達分析

吳 題，魏曉玲，馮常青，黃云俠，徐時長，邱福祥，鄭英潔，李文卿，何華勤

（1福建農(nóng)林大學生命科學學院，福州 350002；2福建省煙草專賣局煙草科學研究所，福州 350003）

0 引言

鎂作為僅次于氮、磷、鉀的植物第四大營養(yǎng)元素，在提高植物抗逆性方面有重要作用。長期以來，南方紅壤地區(qū)由于高溫、多雨等原因，含鎂礦物受到風化、淋洗等作用，造成土壤中的有效性鎂含量降低[1-2]。鎂缺乏已成為限制國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物產(chǎn)量的重要因子，合理施用鎂能有效提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提升抗逆境脅迫能力[3-4]。鎂的運輸與分配離不開鎂轉(zhuǎn)運蛋白，前人發(fā)現(xiàn)細菌中有3種不同類型的鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白，即鈷抗性A基因(CorA)、鎂轉(zhuǎn)運基因(MGT)A/B和MGTE[5-7]。植物中MGT是CorA亞家族中的一類。研究人員已從水稻、甘蔗、玉米、甘藍型油菜、巴西橡膠樹等植物中鑒定出鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因家族[8-12]。在擬南芥中，鑒定出的鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白基因家族有10個成員和1個假基因(AtMRS2-9)，并被命名為AtMGT基因或AtMRS2[13]。對AtMGT基因家族研究較為深入的是AtMGT1基因，該基因蛋白定位于質(zhì)膜并參與根中鎂離子的吸收，且對鎂離子具有高親和性和專一性，能轉(zhuǎn)運土壤中符合生理濃度范圍的鎂離子，也能轉(zhuǎn)運其他的二價陽離子，但對其他二價陽離子的轉(zhuǎn)運要求其濃度高出土壤生理濃度[14]。AtMGT6是一種質(zhì)膜局部轉(zhuǎn)運蛋白，可以介導局部鎂離子吸收和低鎂耐受性，主要與環(huán)狀核苷酸門控通道(CNGC)家族蛋白AtCNGC10協(xié)同吸收并轉(zhuǎn)運擬南芥根中的鎂。在水稻中，研究人員已鑒定出9個鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白基因家族成員。OsMGT1是首個被克隆的水稻MRS2/MGT類基因，其位于質(zhì)膜中，參與Mg2+的吸收且介導根部的鎂運輸[9,15-16]。目前，對植物中MGT家族基因的研究僅有少數(shù)報道，而對煙草中MGT家族成員的鑒定與功能研究尚未見報道。筆者從煙草基因組中鑒定出鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因MGT，分析不同鎂濃度與光強處理下煙株不同組織部位鎂含量與鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因表達量的關系，以期探究MGT對煙株鎂離子運輸?shù)臋C制，為提高煙草的鎂營養(yǎng)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和實驗處理

實驗于2020—2021年在福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學研究所進行。選用煙草‘翠碧一號’為實驗材料。煙草植株培養(yǎng)至七葉一心后移栽至1000 mL的水培罐(12 cm×8 cm×11 cm)中，加不同鎂濃度的Hoagland營養(yǎng)液。營養(yǎng)液中的鎂(Mg2+)濃度梯度設置為0、12.0、48.0、120.0 mg/L。為模擬福建煙區(qū)2—6月的氣溫跳躍式上升的情況，結合往年福建煙區(qū)的氣象資料，在煙苗移栽前期和團棵期（移栽后38天）分別設置了18、33℃（高溫）2個階段的溫度。煙苗移栽前期人工氣候室的溫度設定為18℃，濕度為80%，光照強度為160 μmol/(m2·s)(8:00—24:00)和0 μmol/(m2·s)(0:00—8:00)。待煙苗生長至團棵期時，將溫度設定為33℃，濕度保持不變，設置2種光照處理，一種是高溫正常光照，即光照強度為600μmol/(m2·s)24 h，另一種是高溫強光，即光照強度為1200μmol/(m2·s)24 h。利用照度計（美國Kestrel公司，DRM-FQ）測定到達葉片表面的光照強度，以保證到達煙草葉片的有效光照強度。

經(jīng)過不同鎂濃度與光強處理6天后，煙株間出現(xiàn)明顯差異，各處理下分別取3株長勢相同的煙株，并將它們的第2、3葉位的葉片剔除主脈后剪碎混合均勻，同時把相同處理下的3株長勢相同的煙株的根系剪下混勻，分別打包速凍后于-80℃冰箱中冷凍保存，用于MGT基因表達量分析。

1.2 煙株不同部位鎂含量的測定

鎂的測定采用ICP-AES法。ICP儀的高頻功率為1150 W、等離子氣流量10 L/min、輔助氣流量0.5 L/min、載氣流量0.5 L/min、泵轉(zhuǎn)速45 r/min，工作氣體為純度大于99.99%的氬氣，觀測方式為垂直觀測。標準儲備液均為100μg/mL。分析波長為280.270 nm。

1.3 煙株基因組中鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因篩選

從NCBI網(wǎng)站上下載擬南芥和水稻的MRS2/MGT基因家族成員蛋白序列作為query序列，以白肋煙‘TN90’的Ntab-TN90參考注釋版本(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?)與 Sol Genomics Network網(wǎng)站的烤煙‘K326’數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/tools/blast/?db_id=236)為目標數(shù)據(jù)庫進行BLAST，整合2個數(shù)據(jù)庫的比對結果。使用DNAMAN[17]軟件進行氨基酸序列分析，利用ORF Finder軟件(http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/gorf.html)對開放閱讀框進行預測，利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)對得到的序列進行Motif基序預測，用在線預測網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對序列存在的結構域進行分析，利用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進行蛋白跨膜結構域(TM)的預測。MGT蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量等理化性質(zhì)的分析利用在線預測軟件(https://web.expasy.org/protparam/)。利用亞細胞定位預測在線網(wǎng)址(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)對蛋白質(zhì)進行亞細胞定位分析。用MEGA 7.0[18]根據(jù)Neighbor-joining法，重復1000次構建煙草、擬南芥和水稻MRS2/MGT基因序列的系統(tǒng)進化樹。

1.4 煙株MRS2/MGT基因家族的表達量分析

使用Takara公司的RNA提取試劑盒對經(jīng)過不同鎂濃度與光強處理的煙株葉片與根部樣品進行RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并保存于-20℃冰箱中，用于MRS2/MGT基因家族的表達量分析。引物的設計利用Primer 5軟件[19]進行，以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列信息如表1所示，而后進行實時熒光定量PCR(QPCR)分析。

表1 NtMRS2/MGT基因QPCR驗證所用的引物

2 結果與分析

2.1 煙草MRS2/MGT基因家族的鑒定及其進化分析

由于煙草基因組數(shù)據(jù)尚不完整，因此利用Sol Genomics Network網(wǎng)站的烤煙‘K326’數(shù)據(jù)庫與NCBI網(wǎng)站的白肋煙‘TN90’的數(shù)據(jù)庫同時進行比較分析。以擬南芥與水稻的MRS2/MGT基因家族成員的蛋白序列作為參考序列，在以上2個數(shù)據(jù)庫中分別進行搜索比對，將在2個數(shù)據(jù)庫中得到的序列進行整合，并進行跨膜結構域、MRS2結構域與基序(Motif)的預測，同時含有MRS2結構域、2個跨膜結構域(TM)，并且在靠近C端的第一個跨膜結構域的末端附近共享一個保守的Gly-Met-Asn(GMN)三肽基序，被認為是MRS2/MGT基因家族的成員，預測結果顯示同時滿足以上3個條件的序列有7個，分別命名為NtMGT1～NtMGT7（表2）。其中NtMGT5基因有2種可變剪接形式的蛋白質(zhì)，本研究僅對第一種形式的蛋白質(zhì)序列加以分析。

表2 NtMRS2/MGT基因信息表

對上述鑒定獲得的煙草MGT蛋白的理化性質(zhì)進行預測，結果如表3所示。煙草MRS2/MGT基因家族成員編碼的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目為372～499，相對分子質(zhì)量為41.71～54.95 kDa，理論等電點值處于4.83～6.09之間。對煙草MGT蛋白進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)4個MGT成員定位于質(zhì)膜，3個MGT成員定位于葉綠體。說明煙草MGT蛋白的功能主要是維持質(zhì)膜與葉綠體中鎂離子的平衡。相似性結果分析表明，NtMRS2/MGT蛋白家族的序列相似性處于15.23%～88.60%，其中NtMGT2與NtMGT3相似度最高（表4）。

表3 NtMRS2/MGT蛋白特征

表4 NtMRS2/MGT各成員之間相似度 %

將煙草7個MRS2/MGT基因的蛋白序列進行比對，并分析其氨基酸保守位點，結果如圖1所示。7個煙草MGT蛋白都含有鎂轉(zhuǎn)運蛋白保守的Gly-Met-Asn(GMN)三肽基序（圖1中用紅框標記），這與其他植物中MRS2/MGT基因的序列特征相符。利用TMpred的跨膜域分析結果，表明NtMGT1、NtMGT2、NtMGT3、NtMGT6與NtMGT7有2個跨膜結構域，NtMGT4與NtMGT5有3個跨膜結構域，所有NtMRS2/MGT近C端都有2個疏水跨膜域（圖2）。

圖1 NtMRS2/MGT蛋白序列比對

圖2 NtMGTs的跨膜結構域

水稻、擬南芥和煙草MRS2/MGT的系統(tǒng)進化樹分析結果見圖3。MRS2/MGT基因家族可分為5個亞族，除在D亞族中無煙草MRS2/MGT基因外，在其他亞族內(nèi)均有煙草MRS2/MGT家族成員。在A和C亞族中各有2個煙草MRS2/MGT旁系同源基因，在擬南芥、煙草與水稻分離之后，在煙草內(nèi)發(fā)生了重復事件。B和E亞族中各有1個煙草直系同源基因。

圖3 煙草、擬南芥與水稻基因組中MGTs蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化樹

2.2 不同處理下煙株不同部位鎂含量分析

鎂是多種酶的活化劑，其含量變化會影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)。在本研究中，煙株鎂含量的變化趨勢如表5所示。無論是高溫強光還是高溫正常光處理，隨著鎂離子供應濃度的增加，煙株地上部和地下部的鎂含量均顯著提高。在相同鎂離子濃度供應下，強光處理煙株地上部的鎂含量顯著低于正常光處理，其中L1200Mg0比L600Mg0處理的降低了58.74%，L1200Mg12比L600Mg12處理的降低了37.84%，L1200Mg48比L600Mg48處理的降低了23.18%，L1200Mg120比L600Mg120的處理降低了31.29%。在Mg2+48.0 mg/L時，高溫強光與高溫正常光處理下煙株地上部鎂含量的差異減小。另一方面，鎂供應濃度的增加使得高溫強光或高溫正常光處理下煙株地下部鎂含量顯著增加。在相同鎂離子濃度下，光照對處理下煙株地下部鎂含量的影響基本與地上部相似，除了在Mg2+48.0 mg/L時強光處理煙株地下部鎂含量顯著高于正常光處理的。以上結果表明，提高鎂離子供應能增大煙株地上部和地下部鎂含量。而強光會抑制煙株對鎂的吸收，但適宜的鎂離子供應能促進強光下煙株對鎂的吸收。

煙株鎂含量與鎂濃度、光強以及鎂濃度和光強交互作用的方差分析如表5。鎂離子供應濃度、光強及鎂供應和光強交互對煙株地上部鎂含量的影響均達顯著性水平；不同鎂離子供應濃度對煙株地下部鎂含量影響不顯著，但光強及光強與鎂供應濃度的交互對煙株地下部鎂含量的影響均達到顯著性水平。說明改變鎂離子供應濃度、光強均能影響煙株地上部和地下部的鎂含量，兩者的互作也顯著影響鎂含量。

表5 不同鎂濃度與光強處理下煙株的地上部和地下部鎂含量 g/kg

2.3 煙草不同部位MRS2/MGT基因的表達量分析

應用熒光定量PCR技術分析不同處理下煙株地上部和地下部MRS2/MGT基因的表達情況，結果如圖4所示。隨著鎂供應濃度的升高，正常光處理下煙株根中NtMGT1的表達量表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，而強光處理下卻呈緩慢上升趨勢；當鎂(Mg2+)供應濃度為48.0 mg/L時，強光處理下煙株NtMGT1基因的表達量顯著高于正常光處理；而且不同處理下煙株根中NtMGT1的表達量與其地下部鎂含量的變化趨勢基本一致（圖4A）。由圖4B～D可見，煙株葉片中NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5的表達量隨著鎂供應濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在鎂(Mg2+)供應濃度為48.0 mg/L時達到最大值。同時，強光處理下這3個基因的表達量高于正常光處理。

圖4 不同鎂供應濃度與光強處理下煙株根和葉中NtMGT基因的表達量

3 結論與討論

植物鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白具有吸收、轉(zhuǎn)運、維持鎂離子穩(wěn)態(tài)等的作用，因此對植物生長發(fā)育有重要的影響[20]。筆者首先應用同源序列比對策略，從煙草基因組中鑒定出7個NtMGTs家族成員，且各成員在近C末端均有典型的GMN基序。系統(tǒng)進化分析顯示該基因家族與擬南芥、水稻的分離后，在煙草基因組內(nèi)可能發(fā)生了重復事件[21-22]。

本研究發(fā)現(xiàn)煙株MRS2/MGT基因的表達具有組織特異性。在不同鎂供應濃度與光強處理下，煙株葉片中NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因，根中NtMGT1基因的表達均出現(xiàn)顯著性差異。前人研究也獲得相同結論。AtMGT10主要在成熟的擬南芥維管組織或者幼嫩的葉片中表達，介導葉綠體中鎂的轉(zhuǎn)運以提高葉綠體中的鎂含量[23]。研究人員在擬南芥角果中發(fā)現(xiàn)AtMGT2、AtMGT4、AtMGT6、AtMGT9的表達，而在種子中僅發(fā)現(xiàn)AtMGT2有表達。水稻MGTs基因的表達主要在芽和愈傷組織中[24]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在強光處理下，NtMGT1基因在根中的表達量逐漸上升，且與在根系中鎂含量的變化趨勢一致，說明強光處理下煙株可能通過提高NtMGT1基因的表達量來提高煙株根系對鎂離子的吸收能力，以增加根系中的鎂含量。前人也發(fā)現(xiàn)擬南芥根對鎂的吸收主要由AtMGT1等介導完成[25]。以上結果表明，煙株NtMGT1基因主要在根系表達，且強光下其表達量上調(diào)，促進煙株吸收更多的鎂離子。隨著鎂供應濃度的升高，煙株葉片中NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因的表達量呈先升高后降低的趨勢，可能是因為這3個基因?qū)儆跓煵莸母哂H和鎂離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，在外界鎂濃度較低時，基因表達量提高，對鎂離子的轉(zhuǎn)運能力加強，而在鎂離子濃度較高時(Mg2+120.0 mg/L)，表達量降低，可能在此時主要由低親和鎂離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)起作用。在強光下，當鎂離子濃度等于或者高于48.0 mg/L時，NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因的表達量顯著高于正常光處理，說明煙草鎂轉(zhuǎn)運蛋白的表達受光誘導。前人在對橡膠樹與擬南芥的MGTs基因的研究發(fā)現(xiàn)，在成熟橡膠樹葉片中，中午光照最強時，HbMGT10的表達量是夜晚的3倍，在擬南芥中AtMGT10受到光誘導后表達量也提高2倍[26]。強光誘導NtMGT2、NtMGT4與NtMGT5基因表達量增加，使得對Mg2+的轉(zhuǎn)運能力增強。而且NtMGT2的亞細胞定位分析顯示其定位于葉綠體，暗示NtMGT2可能在強光下介導葉綠體鎂離子的轉(zhuǎn)運。

總之，本研究鑒定到煙草基因組中7個MRS2/MGT家族成員，其中NtMGT1在煙株根系中特異性表達，而NtMGT2、NtMGT4、NtMGT5在葉片中特異表達，而且其表達受到光誘導。研究結果可為在煙株高溫強光時期合理施用鎂肥的生產(chǎn)實踐提供理論指導。但目前對于煙草MGT基因家族的研究僅僅是管中窺豹，關于煙草鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白的特性、表達規(guī)律等都尚待探究，而在高溫強光下鎂離子是如何被烤煙根部吸收，通過何種途徑在木質(zhì)部運輸以及如何在烤煙內(nèi)部進行分配等分子機制都不得而知。因此，對NtMGT基因家族的研究還需要大量細致的工作，以解釋在高溫強光下烤煙內(nèi)部的鎂離子是如何被吸收轉(zhuǎn)運以及分配的，為在生產(chǎn)上如何合理施用鎂肥以緩解高溫強光對烤煙的傷害，提高煙草的產(chǎn)量與品質(zhì)提供理論指導。