• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蛋種雞源沙門(mén)菌分離與生物學(xué)特性

    2022-07-07 03:33:16郭家媚趙允清邵明珠吳同壘張志強(qiáng)李蘊(yùn)玉張艷英李佩國(guó)張召興
    中國(guó)獸醫(yī)雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:沙門(mén)種雞血清型

    郭家媚 , 趙允清 , 邵明珠 , 吳同壘 , 張志強(qiáng) , 李蘊(yùn)玉 , 張艷英 , 李佩國(guó) , 張召興,2

    (1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 河北 秦皇島 066004 ; 2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 , 河北 承德 067000)

    禽沙門(mén)菌病 (Avian salmonellosis)是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一,臨床中常見(jiàn)沙門(mén)菌病主要包括雞白痢、禽傷寒和雞副傷寒3種[1-2]。禽沙門(mén)菌病可以引起不同日齡的雞發(fā)病,其中雛雞發(fā)病率和死亡率均較高,成年雞多為慢性和隱性經(jīng)過(guò),常不出現(xiàn)癥狀,但可導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降,引發(fā)其他疾病[3-5]。沙門(mén)菌寄生于人和動(dòng)物的腸道內(nèi),絕大多數(shù)對(duì)人和動(dòng)物具有致病性,且成為禽產(chǎn)品污染的主要來(lái)源之一[6]。相關(guān)研究表明,沙門(mén)菌引起的中毒病例約占細(xì)菌性食物中毒的40%,該菌在自然界中廣泛存在,且對(duì)人類的健康具有很大的威脅,成為公共衛(wèi)生問(wèn)題[7]。

    沙門(mén)菌屬型復(fù)雜,其中菌體表面脂多糖、鞭毛抗原分別攜帶的O、H抗原等,抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜,且不易分型,生化反應(yīng)、血清型分型及傳統(tǒng)的分型方法存在較大的局限性[8]。傳統(tǒng)的分型方法不能滿足區(qū)分不同來(lái)源的沙門(mén)菌菌株之間同源性。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)具有重復(fù)性好、分辨率高、易于標(biāo)化等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌分子分型中[9-10]。本試驗(yàn)從患病蛋種雞體內(nèi)分離到了12株沙門(mén)菌,并對(duì)分離的12株沙門(mén)菌致病性、血清分型、分子分型等生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步分析蛋種雞源沙門(mén)菌及開(kāi)展分子流行病學(xué)溯源提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 病料來(lái)源 秦皇島地區(qū)蛋種雞養(yǎng)殖場(chǎng),采集患病蛋種雞的肝臟、卵黃、心血等病料組織。

    1.2 主要試劑 沙門(mén)菌血清因子,購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;API 20E試劑盒,購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物科技公司;沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基,均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;2×TaqMasterMix、10×M Buffer、0.1%BSA、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、細(xì)胞懸浮緩沖液(CSB)、細(xì)胞裂解緩沖液(CLB)、TE緩沖液、20%十二烷基硫酸鈉,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DL-2 000 DNA Marker,購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司;沙門(mén)菌H9812(Marker)、7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基,均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.3 主要儀器 PCR儀FGEN02TD型,英國(guó)Techne公司產(chǎn)品;CHEF MAPPER脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、Bio-Rad型凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)Rio-Rad公司產(chǎn)品;生物培養(yǎng)箱DHP-9082型,上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

    1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 種蛋由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)基地提供,1日齡白來(lái)航雛雞由本實(shí)驗(yàn)室孵化,飼養(yǎng)至14日齡,經(jīng)檢測(cè)無(wú)沙門(mén)菌感染,再進(jìn)行致病性試驗(yàn)。

    1.5 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 采集的患病蛋種雞的肝臟、卵黃、心血等病料組織無(wú)菌條件接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12~18 h,挑取優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落接種于沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng),挑取沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基單個(gè)菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢。

    1.6 API 20E試劑盒鑒定 取分離純化的疑似沙門(mén)菌的菌株,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將分離菌株懸浮液接種API 20E試條,37 ℃培養(yǎng)18~24 h后,根據(jù)細(xì)菌編碼表判讀結(jié)果。

    1.7 細(xì)菌的PCR鑒定 按細(xì)菌提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA,設(shè)計(jì)16S rRNA基因序列通用引物F:5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/R:5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,進(jìn)行PCR檢測(cè),將分離菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的沙門(mén)菌參考株的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

    1.8 致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法,分別設(shè)攻毒組和對(duì)照組,每一株菌為1個(gè)攻毒組,將分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù),每一株分離菌株腹腔注射5只試驗(yàn)雛雞,劑量為0.2 mL(108CFU/mL);對(duì)照組給予等量的無(wú)菌PBS。攻毒12 h后開(kāi)始觀察,試驗(yàn)期為7d,試驗(yàn)期間觀察并記錄雛雞發(fā)病和死亡情況,對(duì)死亡的雛雞進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

    1.9 血清分型檢測(cè) 按照沙門(mén)菌血清因子說(shuō)明書(shū),采用玻板凝集試驗(yàn)對(duì)分離的12株沙門(mén)菌進(jìn)行血清型鑒定。

    1.10 PFGE分型檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道的方法,對(duì)分離的12株沙門(mén)菌進(jìn)行PFGE分型,用凝膠成像分析系統(tǒng)在紫外燈下獲取凝膠圖像,將獲得的凝膠圖像送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所腹瀉病室進(jìn)行聚類分析。采用BioNumerics軟件繪制沙門(mén)菌分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分析遺傳變異性。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 疑似沙門(mén)菌分離菌株在7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、淺白色的菌落,不溶血;在沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形光滑、邊緣整齊、大小一致的紫紅色菌落;革蘭染色為陰性的兩端鈍圓桿狀菌,大小(0.5~0.8)μm×(1.0~2.0)μm。

    2.2 API 20E生化鑒定 利用API 20E 試條對(duì)12株分離菌株進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,12株分離菌株均為沙門(mén)菌,并命名為C1、36、C13、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12。

    2.3 細(xì)菌的PCR鑒定 結(jié)果如圖1所示,分離的12株分離菌株用細(xì)菌的16S rRNA基因序列通用引物均擴(kuò)增出1 492 bp左右的目的基因。12株分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的12株沙門(mén)菌參考株的基因序列同源性在97.9%~99.0%。

    圖1 沙門(mén)菌分離菌株的PCR擴(kuò)增

    2.4 致病性試驗(yàn) 攻毒組的白來(lái)航雛雞在攻毒后24~96 h出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、腹瀉,個(gè)別的雛雞出現(xiàn)無(wú)癥狀死亡。無(wú)菌采集死亡雛雞的病料組織,成功分離到沙門(mén)菌。直到7 d試驗(yàn)結(jié)束,對(duì)照組白來(lái)航雛雞未出現(xiàn)明顯臨床癥狀。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,12株分離株對(duì)白來(lái)航雛雞具有一定致病性,均為致病性沙門(mén)菌。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明,分離的12株沙門(mén)菌致病性沒(méi)有差異性。

    2.5 血清分型檢測(cè) 采用玻板凝集試驗(yàn)對(duì)分離的12株沙門(mén)菌進(jìn)行血清型鑒定,結(jié)果顯示,除菌株36未測(cè)出血清型外,其余11株沙門(mén)菌分離菌株屬于4個(gè)血清型,其中菌株C1為O4(B)群無(wú)動(dòng)力沙門(mén)菌;菌株C3、C4為雞沙門(mén)菌;菌株C5、C6、C7、C8、C9為病牛沙門(mén)菌;菌株C10、C11、C12為腸炎沙門(mén)菌。

    2.6 PFGE分型檢測(cè) 用PFGE對(duì)12株沙門(mén)菌分離菌株進(jìn)行分子分型,結(jié)果如圖2所示,12株沙門(mén)菌用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行PFGE電泳,其中菌株36 PFGE帶型不明顯,其余11株沙門(mén)菌株可得出不同的PFGE圖譜,每株約產(chǎn)生10~20條電泳帶。

    圖2 沙門(mén)菌分離株的PFGE圖譜

    沙門(mén)菌聚類分析結(jié)果如圖3所示,其中菌株36 PFGE帶型不明顯未進(jìn)行聚類分析,其余11株分離菌株之間的相似度為56%~100%,11株試驗(yàn)菌可分為5個(gè)不同的型別,其中菌株C13、C4與菌株C5、C6、C7、C8相似度均為100%,菌株C9與菌株C10、C11相似度為100%,其余菌株相似度較低。11株沙門(mén)菌分離株的聚類分析圖中,以75%的相似度為界,可以分為 A、B、C和 D共4個(gè)簇。A 簇包括病牛沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌,B 簇均為病牛沙門(mén)菌,而C 簇也只有1種血清型,即雞沙門(mén)菌,D簇只有1株沙門(mén)菌,血清型為O4群無(wú)動(dòng)力沙門(mén)菌。相同的血清型可能具有聚為 1 簇的趨勢(shì)。不同血清型間的相似度高。菌株C9(病牛沙門(mén)菌)和菌株C10(腸炎沙門(mén)菌)的相似度為100%,而菌株C8和菌株C9(同為病牛沙門(mén)菌)的相似度只有70%。

    圖3 11株沙門(mén)菌分子分型聚類圖

    3 討論

    沙門(mén)菌是一類廣泛分布于自然界人獸共患的病原菌之一,該菌可以通過(guò)多種途徑污染食品、水源及畜產(chǎn)品等,引起人類的食物中毒、急性腸胃炎和動(dòng)物腹瀉等疾病,對(duì)人類及動(dòng)物健康構(gòu)成極大危害[5-6]。禽沙門(mén)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,經(jīng)過(guò)一定途徑進(jìn)入宿主體內(nèi),在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)定殖,并隨著吞噬細(xì)胞擴(kuò)散至其他組織器官,該菌可以通過(guò)水平傳播,也可以通過(guò)垂直傳播,帶菌和隱形感染的種雞是沙門(mén)菌主要宿主的傳染源,可以長(zhǎng)期帶毒和排毒,導(dǎo)致沙門(mén)菌病在種雞、雛雞中廣泛流行[12-13]。因此,在蛋種雞養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)該注意沙門(mén)菌病的凈化與控制,減少該病的發(fā)生與流行。

    在養(yǎng)殖過(guò)程中,種雞群雞白痢凈化主要通過(guò)全血玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè),此方法簡(jiǎn)單便于操作,但只能檢出含有 O抗原的沙門(mén)菌,會(huì)造成其他類型沙門(mén)菌感染的漏檢,而細(xì)菌分離鑒定可以解決其他類型的沙門(mén)菌感染的漏檢情況[4-6]。本試驗(yàn)采用API20E、PCR和人工感染致病性試驗(yàn)從患病的蛋種雞病料組織分離得到12株致病性沙門(mén)菌,為了更好地控制該病,對(duì)其血清分型、分子分型等生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,除菌株36未測(cè)出血清型外,其余11株沙門(mén)菌分離株屬于4種血清型,其中 C1為O4(B)群無(wú)動(dòng)力沙門(mén)菌,菌株C13、C4為雞沙門(mén)菌,菌株C5、C6、C7、C8、C9為病牛沙門(mén)菌,菌株C10、C11、C12為腸炎沙門(mén)菌。本試驗(yàn)在患病的蛋種雞體內(nèi)分離到病牛沙門(mén)菌,國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果與費(fèi)中杰[2]、吳曉君[3]、徐耀輝等[4]的報(bào)道存在一定差異性,可能與地區(qū)分布、雞的種源、場(chǎng)環(huán)境、飼料、鼠類及其他媒介生物攜帶沙門(mén)菌等有關(guān)。本試驗(yàn)分離的5株病牛沙門(mén)菌可能對(duì)種雞群具有潛在威脅,需引起注意。

    為了更好地了解養(yǎng)殖場(chǎng)中沙門(mén)菌的流行情況,建立起常態(tài)監(jiān)測(cè)具有重要意義。本試驗(yàn)利用PFGE方法對(duì)分離的12株致病性沙門(mén)菌分子分型進(jìn)行溯源分析,結(jié)果顯示,除菌株36因PFGE帶型不明顯未進(jìn)行聚類分析外,其余11株沙門(mén)菌分離株包含4種血清型,可分成4種PFGE指紋圖譜,各帶型間親緣關(guān)系較遠(yuǎn),不同血清型的菌株之間的相似度在56%~100%,相同的血清型可能具有聚為 1 簇的趨勢(shì),不同血清型菌株之間具有較高的相似度,11株沙門(mén)菌具有相同血清型的菌株中具有不同的PFGE圖譜,不同血清型的沙門(mén)菌菌株可同屬一種PFGE指紋圖譜,如5株病牛沙門(mén)菌可分為2個(gè)型別,C9株病牛沙門(mén)菌與C10株腸炎沙門(mén)菌圖譜更為相似。因而說(shuō)明了PFGE指紋圖譜與血清學(xué)型別無(wú)相關(guān)性,相同血清型的沙門(mén)菌分離菌株其PFGE圖譜不一定相同,PFGE可進(jìn)一步區(qū)分各菌株間的微小差別,因而在沙門(mén)菌病流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用。沙門(mén)菌的PFGE分型結(jié)果能夠?yàn)椴煌瑏?lái)源的沙門(mén)菌數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供更詳細(xì)的資料,本試驗(yàn)為蛋種雞源沙門(mén)菌疾病的進(jìn)一步凈化與防控提供了科學(xué)依據(jù)。

    猜你喜歡
    沙門(mén)種雞血清型
    肉用種雞育成階段的養(yǎng)殖管理技術(shù)
    種雞轉(zhuǎn)群注意這七點(diǎn)
    一株雞白痢沙門(mén)菌噬菌體的發(fā)酵及后處理工藝研究
    種雞休產(chǎn)期該咋管理
    沙門(mén)菌噬菌體溶菌酶LysSHWT1的制備及抑菌活性分析
    2013-2017年北京市順義區(qū)腹瀉病例中沙門(mén)菌流行特征
    通遼地區(qū)牛肉與牛肉制品沙門(mén)氏菌血清型調(diào)查
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:44
    廣東地區(qū)水禽大腸桿菌血清型鑒定
    肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學(xué)檢測(cè)方法
    種雞防疫措施分析
    亚洲精品久久国产高清桃花| 成年免费大片在线观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久9热在线精品视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 黄色 视频免费看| 午夜免费鲁丝| 精品无人区乱码1区二区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线视频色国产色| 欧美成人午夜精品| 国产1区2区3区精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 18美女黄网站色大片免费观看| 波多野结衣高清作品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 人人妻人人看人人澡| 国产97色在线日韩免费| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品二区激情视频| 亚洲国产精品999在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产亚洲精品av在线| 最新美女视频免费是黄的| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产av一区二区精品久久| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲专区字幕在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 男女床上黄色一级片免费看| 国产又爽黄色视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 婷婷精品国产亚洲av| √禁漫天堂资源中文www| 99久久国产精品久久久| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产一卡二卡三卡精品| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲精品在线美女| 成人国产综合亚洲| 免费一级毛片在线播放高清视频| www.熟女人妻精品国产| 在线观看日韩欧美| 这个男人来自地球电影免费观看| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 免费高清视频大片| 在线视频色国产色| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 欧美精品亚洲一区二区| 精品久久久久久久久久免费视频| svipshipincom国产片| 无人区码免费观看不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久精品影院6| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一区二区三区激情视频| 色综合婷婷激情| 精品久久久久久久久久久久久 | 精品久久久久久成人av| 国产av又大| 69av精品久久久久久| 嫩草影院精品99| 午夜福利一区二区在线看| 精品电影一区二区在线| 久久香蕉精品热| 天天一区二区日本电影三级| 日日夜夜操网爽| 精品第一国产精品| 国产片内射在线| 国产v大片淫在线免费观看| bbb黄色大片| 男人操女人黄网站| 成人手机av| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久久国内视频| 两个人免费观看高清视频| 免费在线观看影片大全网站| 757午夜福利合集在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品永久免费网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产男靠女视频免费网站| 757午夜福利合集在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩成人在线观看一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲最大成人中文| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 黄色丝袜av网址大全| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产日本99.免费观看| av福利片在线| 久久亚洲真实| 人成视频在线观看免费观看| av在线天堂中文字幕| 亚洲九九香蕉| 91成年电影在线观看| 免费在线观看完整版高清| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美精品亚洲一区二区| 白带黄色成豆腐渣| 男男h啪啪无遮挡| 午夜免费鲁丝| 九色国产91popny在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 午夜激情福利司机影院| 亚洲精品久久国产高清桃花| 性色av乱码一区二区三区2| 天堂动漫精品| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| av中文乱码字幕在线| 成人av一区二区三区在线看| 国产视频一区二区在线看| 白带黄色成豆腐渣| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久久久免费高清国产稀缺| 妹子高潮喷水视频| 精品国产亚洲在线| 午夜福利高清视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久精品人妻少妇| 国产男靠女视频免费网站| 久久久国产欧美日韩av| 久久中文看片网| 在线免费观看的www视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费高清视频大片| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久久久午夜电影| 一夜夜www| 夜夜爽天天搞| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 一区二区三区精品91| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| av片东京热男人的天堂| 国产单亲对白刺激| 国产av一区在线观看免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲av成人一区二区三| 99久久99久久久精品蜜桃| 天天一区二区日本电影三级| 婷婷精品国产亚洲av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 少妇粗大呻吟视频| 国产在线观看jvid| 香蕉av资源在线| 女性生殖器流出的白浆| 久久精品国产亚洲av高清一级| 在线观看午夜福利视频| 在线观看免费午夜福利视频| aaaaa片日本免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美大码av| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲三区欧美一区| 国产亚洲av高清不卡| 久久久久久人人人人人| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品永久免费网站| 免费在线观看亚洲国产| 女人被狂操c到高潮| 国产精品 欧美亚洲| xxx96com| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久国产精品影院| 波多野结衣高清无吗| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩三级视频一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 久久性视频一级片| 在线看三级毛片| 久久伊人香网站| 可以在线观看毛片的网站| 女性被躁到高潮视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久亚洲精品不卡| 国产黄a三级三级三级人| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品久久久久久,| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 搞女人的毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲美女黄片视频| 亚洲,欧美精品.| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 大型黄色视频在线免费观看| 午夜福利在线在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲九九香蕉| 国产欧美日韩一区二区精品| 十分钟在线观看高清视频www| www.熟女人妻精品国产| 国产激情欧美一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久香蕉精品热| av天堂在线播放| 国产欧美日韩一区二区三| 午夜福利免费观看在线| 丝袜人妻中文字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 黄色丝袜av网址大全| 91在线观看av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 男女午夜视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久九九热精品免费| 最新在线观看一区二区三区| 欧美大码av| 韩国av一区二区三区四区| 国产一区二区三区视频了| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99热只有精品国产| 满18在线观看网站| 免费在线观看黄色视频的| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 两个人看的免费小视频| 中文字幕av电影在线播放| 男人舔奶头视频| 亚洲第一青青草原| 欧美激情高清一区二区三区| tocl精华| 天堂影院成人在线观看| 国产精品野战在线观看| 曰老女人黄片| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产av在哪里看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国产成+人综合+亚洲专区| 女同久久另类99精品国产91| 男人舔女人的私密视频| 国产一区在线观看成人免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲七黄色美女视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精品久久国产高清桃花| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品久久视频播放| 久久久国产成人免费| 一级作爱视频免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 人成视频在线观看免费观看| 一夜夜www| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品欧美一区二区三区在线| 伦理电影免费视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本熟妇午夜| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品人妻少妇| 成人三级黄色视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 男女视频在线观看网站免费 | 人成视频在线观看免费观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 淫秽高清视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 中出人妻视频一区二区| 亚洲在线自拍视频| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 18禁观看日本| 99热只有精品国产| 欧美zozozo另类| 亚洲人成伊人成综合网2020| 黄片播放在线免费| www日本在线高清视频| 老司机靠b影院| 香蕉av资源在线| 欧美日韩乱码在线| 麻豆国产av国片精品| 日韩欧美在线二视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜免费成人在线视频| 1024香蕉在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 久9热在线精品视频| 伦理电影免费视频| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲真实伦在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 久久精品国产亚洲av高清一级| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲色图av天堂| 国产在线观看jvid| 90打野战视频偷拍视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩欧美在线二视频| 无限看片的www在线观看| 97碰自拍视频| 日韩三级视频一区二区三区| 香蕉国产在线看| 亚洲第一电影网av| 757午夜福利合集在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 久久天堂一区二区三区四区| 两个人视频免费观看高清| 精品久久久久久成人av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成人亚洲精品一区在线观看| 久9热在线精品视频| 国内精品久久久久精免费| 亚洲精品在线美女| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久九九精品影院| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产三级在线视频| 日本免费a在线| 在线观看日韩欧美| 中文字幕高清在线视频| 亚洲 国产 在线| 美女高潮到喷水免费观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲国产欧洲综合997久久, | 岛国在线观看网站| 美女免费视频网站| 黄频高清免费视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 无限看片的www在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产v大片淫在线免费观看| 日本熟妇午夜| 国产真人三级小视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产av一区在线观看免费| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品久久久久久精品电影 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 中文字幕久久专区| 999久久久国产精品视频| 成人亚洲精品一区在线观看| x7x7x7水蜜桃| 91在线观看av| 国产在线观看jvid| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成人一区二区视频在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲avbb在线观看| 熟女电影av网| 久久久水蜜桃国产精品网| 黄色片一级片一级黄色片| 99久久99久久久精品蜜桃| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 在线观看午夜福利视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩免费av在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 成年免费大片在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 久久久久久久久久黄片| 三级毛片av免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产免费av片在线观看野外av| 成年人黄色毛片网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 成人av一区二区三区在线看| 成在线人永久免费视频| √禁漫天堂资源中文www| 国产一区二区三区视频了| 久久久国产精品麻豆| 十分钟在线观看高清视频www| 少妇 在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久水蜜桃国产精品网| 女人被狂操c到高潮| 国产免费男女视频| 久久精品国产清高在天天线| 中文字幕人妻熟女乱码| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲全国av大片| 一本久久中文字幕| 国产精品98久久久久久宅男小说| 成在线人永久免费视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩成人在线观看一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费 | 色尼玛亚洲综合影院| 丝袜在线中文字幕| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 黄色丝袜av网址大全| 男人舔女人的私密视频| 69av精品久久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 男女午夜视频在线观看| www.www免费av| 一级毛片高清免费大全| 精品国产一区二区三区四区第35| cao死你这个sao货| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 国产一区二区三区视频了| 亚洲avbb在线观看| www.www免费av| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美三级亚洲精品| 久久久久久大精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜视频精品福利| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 国产一区二区在线av高清观看| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美成人性av电影在线观看| 怎么达到女性高潮| 国产真人三级小视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 一夜夜www| 怎么达到女性高潮| 欧美在线黄色| 1024手机看黄色片| 日本熟妇午夜| 变态另类丝袜制服| 日韩欧美在线二视频| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国内精品久久久久精免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩欧美三级三区| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲黑人精品在线| 国产1区2区3区精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜亚洲福利在线播放| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产高清激情床上av| 国产成人av教育| 久久香蕉精品热| 一夜夜www| 丁香六月欧美| 在线永久观看黄色视频| 欧美黄色淫秽网站| 黄色 视频免费看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 99精品欧美一区二区三区四区| 老司机午夜福利在线观看视频| 91成人精品电影| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日本免费a在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品久久久久久精品电影 | 一区二区三区高清视频在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品二区激情视频| 国产成人欧美在线观看| 亚洲 国产 在线| 久久性视频一级片| 亚洲一区中文字幕在线| 天天添夜夜摸| 我的亚洲天堂| 在线永久观看黄色视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 丝袜在线中文字幕| 俺也久久电影网| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 91成年电影在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美中文日本在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 大香蕉久久成人网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日日爽夜夜爽网站| 免费在线观看完整版高清| 精品日产1卡2卡| 久久人人精品亚洲av| 国产国语露脸激情在线看| 动漫黄色视频在线观看| 久久亚洲真实| 日日夜夜操网爽| 国产男靠女视频免费网站| 后天国语完整版免费观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 老司机靠b影院| 夜夜爽天天搞| 亚洲国产欧美网| 国产真人三级小视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 狠狠狠狠99中文字幕| 黑人操中国人逼视频| 久久精品影院6| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久草成人影院| 无遮挡黄片免费观看| 国产97色在线日韩免费| av中文乱码字幕在线| 女警被强在线播放| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲五月婷婷丁香| 女同久久另类99精品国产91| 老鸭窝网址在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜福利免费观看在线| 看黄色毛片网站| 欧美性猛交黑人性爽| 国产1区2区3区精品| 美女高潮到喷水免费观看| 成人欧美大片| 国产精品日韩av在线免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品影院6| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产成年人精品一区二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 伦理电影免费视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 最好的美女福利视频网| xxxwww97欧美| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 97碰自拍视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲人成电影免费在线| 免费在线观看影片大全网站| 后天国语完整版免费观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲成av人片免费观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美乱妇无乱码| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产熟女午夜一区二区三区| 老司机靠b影院| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本一区二区免费在线视频| 自线自在国产av| 在线看三级毛片| 91成人精品电影| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 特大巨黑吊av在线直播 | 午夜激情福利司机影院| 精品人妻1区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 美女大奶头视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久热这里只有精品99| 天堂影院成人在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产一区二区在线av高清观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 久久精品91无色码中文字幕| 成人特级黄色片久久久久久久| 久9热在线精品视频| 欧美日韩精品网址| 成人午夜高清在线视频 | 国产精品精品国产色婷婷| 一区二区三区国产精品乱码| 听说在线观看完整版免费高清| av电影中文网址|