太子參參須皂苷的免疫佐劑作用研究

曾 麗，甘思言，杜鎣鎣，喬 石，張炎達，王全溪，黃一帆*，馬玉芳*

1中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學校重點實驗室，福州 350002；2福建農(nóng)林大學獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室，福州 350002；3福建貝迪藥業(yè)有限公司，寧德 355399

皂苷是一種甾體或三萜配糖類物質(zhì)，廣泛存在于一些植物體內(nèi)，且隨著研究深入，它也被作為一種植物來源佐劑應(yīng)用于疫苗中[1]。研究表明，皂苷口服有一定佐劑作用，如口服藜蘆皂苷能增強卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)的免疫效果[2]，灌服人參莖葉皂苷能夠顯著提升被注射口蹄疫疫苗小鼠血清中特異IgG及亞類滴度，且促進脾淋巴細胞增殖，上調(diào)相關(guān)基因的mRNA表達，強化應(yīng)答效果[3]。太子參參須皂苷(Radix Pseudostellariae fibrous roots saponins，RPFRS)是從太子參(Pseudostellariaheterophylla)參須中提取的活性成分，具有增強機體免疫[4]、抗氧化[5]和抗應(yīng)激[6]等作用。現(xiàn)在太子參以主根入藥，根須則棄之不用，造成極大浪費，研究發(fā)現(xiàn)太子參參須中總皂苷平均含量是塊根中的1.14倍[7]。課題組前期實驗表明，以皂苷為成分之一的太子參參須提取物可增強免疫損傷小鼠的機體免疫，具有顯著的調(diào)節(jié)免疫的作用[4]，推測其可能具有增強機體對于抗原的免疫應(yīng)答潛力。但目前關(guān)于太子參參須皂苷協(xié)助抗原免疫機體的效果鮮見報道，而常有研究利用OVA作為一種模式抗原來驗證佐劑效力[8]，被OVA誘導的模型抗原會產(chǎn)生更高的IgG反應(yīng)，且小鼠脾臟細胞增殖能力、細胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ以及轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet的mRNA表達等同樣有所提高[9]。故本實驗通過口服RPFRS對OVA模式抗原免疫小鼠的免疫佐劑效果，檢測其相關(guān)免疫學指標，探討RPFRS對模式抗原OVA的免疫佐劑作用及可能的機理，為進一步尋找高效、無毒、安全的中藥免疫佐劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 太子參參須皂苷

福建貝迪藥業(yè)有限公司惠柘榮縣所產(chǎn)太子參參須，太子參參須皂苷(RPFRS)采取醇提法自行完成提取，經(jīng)香草醛-冰醋酸法檢測可得皂苷濃度為48.9%。

1.1.2 實驗動物

清潔級雌性ICR小鼠，20±2 g，60只，福建醫(yī)科大學實驗動物中心購入。

1.1.3 主要試劑

金標級卵清白蛋白(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：RD20C904)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：AC10238685)；胎牛血清(CellMax公司，批號：HQ202003)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Hyclone公司，批號：PB20041309)；紅細胞裂解液、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)(美國Sigma公司，批號分別為：20191108、512C0310、127M4030V)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，批號分別為：1223G054、20190125)；細胞因子ELISA試劑盒，特異性抗體及其亞類ELISA試劑盒(上海邦奕生物有限公司，批號為：20201108、20201104、20201101)；APC Anti-Mouse CD3e、FITC Anti-Mouse CD4、PE Anti-Mouse CD8a(Tonbo Biosciences公司，批號分別為：85-17-0031-81、FMF004-1000U、CB4286178)。

1.1.4 主要儀器

V-1200可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；PCR儀(美國BIO-RAD Thermal Cycler)；Real-time PCR儀(QuanStudioTM 1 Real-Time PCR System)；ACEA NovoCyteTM流式細胞儀(美國艾森公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組

60只雌性ICR小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后開始正式實驗。隨機分成對照空白組(CK)、OVA免疫對照組(OVA)、OVA+RPFRS低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg，即D、Z、G)。在第1～5天和第16～20天，除CK組和OVA組小鼠灌胃雙蒸水之外，其他組分別灌胃對應(yīng)劑量RPFRS。第6天和第21天，除CK組各只小鼠腹股溝皮下注射無菌PBS 0.2 mL外，其余各組各只小鼠腹股溝皮下注射OVA溶液0.2 mL，即其余各組每只小鼠OVA注射質(zhì)量為100 μg。飼養(yǎng)期間各組采食、飲水自由。第36天檢測各項指標，小鼠摘眼球采血，頸椎脫臼法處死，其中每組各取4只進行脾淋巴細胞增殖測定及脾臟T淋巴細胞亞群分析，剩余的細胞懸液進行脾細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對表達量檢測；4只進行脾臟自然殺傷細胞(NK)活性測定。

1.2.2 實驗小鼠脾T、B淋巴細胞體外轉(zhuǎn)化率測定

1.2.2.1 脾淋巴細胞懸液制備

脾淋巴細胞的制備流程參考文獻[10]，無菌取脾，將脾臟置于研缽中研磨，加入3.75 mL PBS緩沖液后混勻，過濾，各組清楚標記。1 500 r/min離心5 min后棄上清，加入2 mL紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，PBS液洗滌，相同速度時間離心后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液2 mL，渦旋均勻，臺盼蘭法計數(shù)活細胞≥95%，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)到所需濃度。

1.2.2.2 實驗小鼠脾淋巴細胞增殖測定

用96孔板，除試劑空白孔(只加培養(yǎng)液，無細胞)外，在每個孔里添加5×106個/mL脾細胞懸液100 μL，空白組孔只加100 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)液，實驗孔分別加入4 μg/mL ConA稀釋液、10 μg/mL LPS稀釋液、10 μg/mL的OVA稀釋液各100 μL，各重復3孔。于37 ℃恒溫、5% CO2培育箱中44 h，各孔再分別添加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心5 min，棄上清，每孔加入150 μL 酸性DMSO，低速遮光震蕩10 min，酶標儀上波長選492 nm，試劑空白孔調(diào)零后測定其余各孔的吸光度。參照文獻[11]公式計算：

刺激指數(shù)SI=實驗孔OD值/空白孔OD值

1.2.3 實驗小鼠脾臟中NK細胞殺傷活性測定

于96孔板中加入100 μL濃度為1×107個/mL的脾細胞懸液作為效應(yīng)細胞，另再取濃度為2×105個/mL YAC-1腫瘤細胞懸液(效靶比50∶1)100 μL加入上述含脾細胞的孔中，作為實驗孔；另做效應(yīng)細胞對照孔、靶細胞對照孔和空白對照孔。加液完畢后，于微量震蕩儀上震蕩片刻，置于5% CO2、37 ℃培育箱中4 h，各孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；2 000 r/min離心5 min，去上清，各孔再加入150 μL酸性DMSO溶液(內(nèi)含4% 1N HCl)，避光，于細胞板振蕩器上振蕩，待甲瓚結(jié)晶完全溶解后，在酶標儀492 nm處測OD值，根據(jù)公式算出NK細胞殺傷活性：

NK細胞活性=[靶細胞對照OD值-(實驗組

OD值-效應(yīng)細胞對照組OD值)]/靶細胞對照OD

值×100%

1.2.4 實驗小鼠血清細胞因子及特異性抗體及其亞類含量檢測

小鼠摘眼球取血后，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，收集血清，-20 ℃保存。用ELISA法檢測血清細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)以及特異性抗體OVA-sIgG及其亞類(IgG1、IgG2a、IgG2b)含量，具體操作方法見試劑盒說明書。

1.2.5 實驗小鼠脾細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達檢測

采用qRT-PCR檢測小鼠脾臟細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)及轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3)mRNA相對表達量，具體操作及引物序列按照參考文獻進行[10,11]。計算公式參照文獻[12]：相對表達量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組管家基因)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組管家基因)。引物序見表1。

表1 基因及引物序列

1.2.6 實驗小鼠脾臟T淋巴細胞亞群分析

采用流式細胞術(shù)檢測第2次免疫后兩周的小鼠脾臟中的CD3+、CD4+和CD8+T細胞的數(shù)量及CD4+/CD8+的比例。將CD3、CD4、CD8三個抗體用滅菌中性PBS稀釋至0.05 μg/μL備用。而后各實驗組細胞中分別加入稀釋后的CD3、CD4和CD8抗體各10μL，混勻；分別設(shè)單克隆抗體單標管各1支(共3支)、1支空白管(不加染料)。4 ℃下孵育15 min(避光)；各管分別加入1 mL紅細胞裂解液(1×)，混勻靜置15 min(避光)，1 500 r/min離心5 min棄上清；分別各用1 mL pH值呈中性的PBS洗滌沉淀兩遍；最后用300 μL的PBS將沉淀重懸后置于冰上，立刻上流式細胞儀機器檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 24.0軟件上應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD法多重比較，顯著差異用P<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPFRS對實驗小鼠淋巴細胞增殖的影響

由表2可知，與OVA組相比，RPFRS各劑量組對T細胞和OVA的SI均差異顯著(P<0.05)，D組顯著提高B細胞SI(P<0.05)。

表2 RPFRS對實驗小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

2.2 RPFRS對實驗小鼠NK細胞殺傷活性的影響

由表3可知，RPFRS各劑量組與OVA組的NK細胞殺傷活性差異不顯著(P﹥0.05)，但RPFRS各劑量組均對于NK細胞的殺傷力有一定程度的提升，且以D組效果最好。

表3 RPFRS對實驗小鼠NK細胞殺傷活性的影響

2.3 RPFRS對實驗小鼠血清中細胞因子含量的影響

由表4可知，與OVA組相比，D組和G組IL-2、IL-4含量升高(P<0.05)，G組IFN-γ含量升高(P<0.05)。

表4 RPFRS對實驗小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量的影響

2.4 RPFRS對實驗小鼠血清中特異性抗體及其亞類含量的影響

由表5可知，與OVA組相比，各劑量RPFRS組的OVA-IgG和OVA-IgG1含量有顯著提高(P<0.05)，D組和G組OVA-IgG2a含量顯著提高(P<0.05)，D組和Z組的OVA-IgG2b含量顯著提高(P<0.05)。

表5 RPFRS對實驗小鼠血清中特異性抗體IgG及亞類IgG1、IgG2a和IgG2b含量的影響

2.5 RPFRS對實驗小鼠脾臟細胞因子與轉(zhuǎn)錄因子表達情況的影響

RPFRS對實驗小鼠脾淋巴細胞因子mRNA表達的影響如圖1所示：與OVA組相比，RPFRS各劑量組IL-2 mRNA、IL-4 mRNA和IFN-γmRNA相對表達量增高(P<0.05)，G組IL-10 mRNA相對表達量升高(P<0.05)(見圖1A)，RPFRS各劑量組對T-bet、GATA相對表達量和T-bet/GATA-3比值的提升也均不顯著(P>0.05)(見圖1B、1C)。

圖1 RPFRS對實驗小鼠細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達量的影響

2.6 RPFRS對實驗小鼠脾臟T淋巴細胞亞群影響

RPFRS對各實驗組小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響見圖2。與CK組相比，RPFRS組的CD3+、CD4+、CD8+T細胞數(shù)均顯著提升(P<0.05)，OVA組的CD3+、CD4+、CD8+T細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)，D、G組及OVA組CD4+/CD8+比值顯著提高(P<0.05)；與OVA組相比，RPFRS組的CD3+、CD8+T細胞數(shù)和CD4+/CD8+比值顯著提高(P<0.05)，對CD4+T細胞的提升作用以D、Z組最為明顯(P<0.05)。

圖2 RPFRS對實驗小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響

3 討論

T、B細胞能識別抗原，啟動機體免疫，激活細胞增殖[13]，而是否能誘導有效T、B淋巴細胞免疫反應(yīng)的能力則可以通過刺激淋巴細胞增殖反應(yīng)來顯示[14]。人參莖葉皂苷能增強口蹄疫疫苗的效價，在ConA和LPS分別刺激作用下淋巴細胞的增殖[15]；三七根人參皂苷可顯著提升ConA、LPS和OVA各自誘導的被OVA免疫過的小鼠脾細胞增殖效果[16]。本實驗結(jié)果顯示，Z組能夠協(xié)同ConA促進小鼠脾淋巴細胞增殖，而Z、G組能更明顯地協(xié)同LPS以及OVA顯著促進小鼠脾細胞的增殖，說明RPFRS能通過提升脾細胞增殖來升高體液、細胞免疫，對免疫OVA小鼠T、B細胞活力都有提高作用。

NK細胞具有天然的殺傷功能，機體固有免疫的激活能促使NK細胞的分泌，在自身免疫疾病當中起到至關(guān)重要的作用。Li等[17]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能降低由于達沙替尼抑制的NK細胞殺傷作用。本實驗結(jié)果表明，RPFRS組都能一定程度提高NK細胞活性，而其中低劑量RPFRS更為有效，使得YAC-1的被殺傷率更高，證明RPFRS能夠提升免疫OVA小鼠機體的細胞免疫過程，增強小鼠非特異性免疫的功能。

Th細胞包括Th1細胞(產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等)和Th2細胞(產(chǎn)生IL-4、IL-6、IL-10等)，Th1可激活促炎反應(yīng)，促進巨噬細胞活化、CTL細胞增殖；Th2促進B細胞的活化、增殖以及抗體的產(chǎn)生，Th1和Th2的平衡調(diào)節(jié)著機體的免疫反應(yīng)[17]。本實驗結(jié)果表明，RPFRS組IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ細胞因子含量升高，顯示RPFRS能促進Th2型且也能促進Th1型免疫，提高細胞因子分泌程度，進而促進機體免疫。由此可知，口服RPFRS對于上述兩種類型免疫都有促進作用，這可使其在臨床應(yīng)用方面有更廣的發(fā)展空間。

機體抗體亞類的產(chǎn)生受不同細胞因子的影響，Th1型細胞因子促進B細胞產(chǎn)生IgG2a，而Th2促進機體產(chǎn)生IgG1[18]。Sun等[19]通過對原人參二醇和三醇皂苷聯(lián)合OVA免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，二者都能提高免疫小鼠的OVA特異性抗體IgG。合歡皮總皂苷AJS75組分也被探究發(fā)現(xiàn)，它顯著提高OVA的免疫效價，激活小鼠Th1/Th2應(yīng)答[20]。本實驗結(jié)果表明，各劑量RPFRS組比OVA組更能提升OVA特異性IgG抗體及其亞類含量，說明RPFRS能夠促進Th1及Th2型免疫，刺激機體分泌特異性抗體，這與上述文獻中的結(jié)果保持一致。

T-bet和GATA-3與Th1/Th2的分化密切相關(guān)，二者可通過調(diào)節(jié)細胞因子的分泌及mRNA的表達等進而影響Th1/Th2之間的動態(tài)平衡[21]。Su[22]的研究表明，人參皂苷Rg1和Re能通過提升IFN-γ等相關(guān)細胞因子的mRNA表達，來提高由OVA引起的小鼠免疫力。Wang等[23]在小鼠身上進行的實驗表明，人參莖葉總皂苷與硒聯(lián)合可通過上調(diào)T-bet/GATA-3 mRNA的表達，從而對偽狂犬病減毒疫苗的免疫應(yīng)答呈佐劑作用。本實驗結(jié)果表明，中劑量RPFRS能顯著提高IL-4 mRNA的表達、高劑量RPFRS顯著促進IL-10 mRNA的表達，且RPFRS各組均能一定程度提升T-bet、GATA-3表達及T-bet/GATA-3之比，說明RPFRS既能夠通過促進有關(guān)細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達來促進Th1/Th2反應(yīng)的產(chǎn)生，從而提升機體的細胞免疫作用，加強機體對OVA的應(yīng)答。

T淋巴細胞亞群情況展示了機體整體的細胞免疫狀態(tài)，CD3+、CD4+、CD8+T細胞的數(shù)量以及CD4+/CD8+的比例平衡可顯示機體免疫狀態(tài)[24,25]，其中CD4+和CD8+T細胞主要由細胞免疫介導[26]。Qi等[27]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2及其主要代謝產(chǎn)物R-PHQ和S-PHQ可提高環(huán)磷酰胺誘導的免疫功能低下小鼠的免疫應(yīng)答：通過阻止免疫器官萎縮，促進脾細胞增殖，恢復CD4+/CD8+比例。本實驗結(jié)果表明，相對OVA組，RPFRS各組均能顯著提升CD3+、CD8+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+比值，D、Z組能明顯提高CD4+T細胞數(shù)，說明RPFRS具有平衡機體，提升T細胞免疫，加大免疫應(yīng)答的作用。

通過以上指標測定的結(jié)果顯示，RPFRS能提升OVA免疫后的小鼠的體液、細胞免疫應(yīng)答，比OVA免疫對照的小鼠更能夠持久地讓機體產(chǎn)生應(yīng)答和提升小鼠免疫功能，證明RPFRS具有作為免疫佐劑的良好潛力，實驗中不同劑量太子參參須皂苷作用時，三種劑量在某些指標上各有優(yōu)勢，因此需對最優(yōu)濃度做進一步篩選，同時，太子參參須皂苷具體有效成分及作用機制尚未完全闡明，有待進一步研究。