不同干燥方法對栽培川貝母外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量的影響

李 巧，種葉敏，陳穎馨，蔡曉洋，李 敏*，黃 勇

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 省部共建西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實驗室，成都 611137；2四川綠林川貝母種植有限公司，涼山彝族自治州 615000

川貝母FritillariacirrhosaD.Don，又稱卷葉貝母，為川貝母藥材的來源之一，具有清熱潤肺，化痰止咳，散結(jié)消癰的功效[1]，主要含有生物堿類、核苷類成分[2]，同時淀粉占整個貝母總生物量70%～80%[3]。喜生長于海拔3 200～4 600 m的高山灌叢草甸地帶，土壤比較濕潤的向陽草坡，主要分布于四川、西藏、云南等地[4,5]，商品藥材主要以野生資源為主。但由于川貝母對生長環(huán)境要求苛刻、生物學(xué)產(chǎn)量低，加之過度采挖，川貝母基原植物的野生資源量急劇下降，國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(2021年公布)已將其納入二級保護(hù)野生植物。目前川貝母產(chǎn)業(yè)化栽培快速發(fā)展，其相關(guān)栽培技術(shù)已有較多研究且日益成熟[6,7]，將逐步實現(xiàn)川貝母藥材生產(chǎn)以及藥用，減緩野生資源減少帶來藥材供不應(yīng)求的市場壓力。產(chǎn)地加工是川貝母藥材生產(chǎn)及質(zhì)量形成的源頭，是川貝母藥材生產(chǎn)與品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)。目前川貝母的產(chǎn)地初加工方法普遍采用曬干和烘干等傳統(tǒng)方法[8-10]，具有規(guī)模小散、技術(shù)裝備落后、干燥周期長、干燥過程難控等問題。隨著川貝母栽培規(guī)模的擴(kuò)大，栽培品將逐漸走向市場，傳統(tǒng)加工方法已無法滿足栽培品的生產(chǎn)，因此研究栽培川貝母新的加工工藝成為行業(yè)迫切需要解決的問題。

近年來，中藥生產(chǎn)過程工業(yè)化程度不斷提升，現(xiàn)代干燥技術(shù)逐漸被引入中藥產(chǎn)地加工并進(jìn)行推廣，如三七[11]、人參[12]、當(dāng)歸[13]等，使其產(chǎn)地加工干燥速率提升的同時，品質(zhì)也得到保障[14]。而貝母類藥材中，僅浙貝母有相關(guān)的研究報道[15,16]，在川貝母中尚無研究及應(yīng)用。因此，基于上述問題，本實驗通過比較傳統(tǒng)曬干、熱風(fēng)干燥、真空干燥、真空冷凍干燥對川貝母藥材的外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量的綜合影響，通過多指標(biāo)對不同干燥方法川貝母的質(zhì)量進(jìn)行評價，同時以聚類分析、主成分分析等方法進(jìn)行綜合質(zhì)量評價，以期為栽培川貝母產(chǎn)地干燥加工新技術(shù)的引進(jìn)與推廣提供理論參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DHG-9070B電熱鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實驗設(shè)備有限公司)；DAF-6050真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；FDU-2110真空冷凍干燥器(東京理化器械株式會社)；Nikon SMZ745體視顯微鏡(日本尼康公司)；CR-400色彩色差計(日本美能達(dá)公司)；A580紫外可見光光度計(上海翱藝儀器有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；DFD-700電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

對照品：西貝母堿(批號：wkq19051302，四川省維克奇生物科技有限公司，純度≥98%)；BC0705淀粉含量檢測試劑盒(批號：20220107，北京索萊寶科技有限公司)。

乙醇、三氯甲烷、溴甲酚綠、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉為分析純；乙腈、甲醇、冰醋酸為色譜純；水為超純水。

供試栽培川貝母為4～5年生植株，采挖自四川綠林川貝母種植有限公司生產(chǎn)基地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為百合科川貝母FritillariacirrhosaD.Don的鱗莖。挑選無腐爛、無損傷、直徑1.0～1.5 cm的鮮鱗莖作為試驗樣品。

2 方法

2.1 處理方法

試驗設(shè)置4種干燥方法，即自然曬干、熱風(fēng)干燥、真空干燥、冷凍干燥，重復(fù)3次。除T3處理不清洗外，其余干燥前處理需去掉泥土及須根，清水洗凈后，瀝干水分。不同干燥處理的流程與參數(shù)見表1。

表1 干燥處理方法及參數(shù)

2.2 評價方法

2.2.1 外觀形態(tài)觀測

按照生藥學(xué)常規(guī)性狀鑒定方法，觀察干燥后藥材的形狀、顏色、質(zhì)地、氣味等性狀。然后通過體視顯微鏡進(jìn)行藥材表皮及斷面觀察并局部放大拍照。同時參照2020年版《中國藥典》川貝母項下對表面及斷面特征進(jìn)行客觀量化評分，表面“類白色”得9～10分，“類白色或淺黃色”得6～8分，“淺黃色或黃色”得3～5分，“黃色或棕黃色”得0～2分；斷面“白色，富粉性”得9～10分，“白色，具粉性”得6～8分，“淺黃色，粉性差”得3～5分，“淺黃色，呈角質(zhì)”得0～2分。

2.2.2 色度測量方法

參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行測定[17]，采用色度計對樣品粉末進(jìn)行客觀、量化分析，為不同干燥方法川貝母藥材的色差提供客觀數(shù)據(jù)，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

2.2.3 水分和浸出物測定

水分參照2020年版《中國藥典》第一部川貝母項下方法測定；浸出物參照2020年版《中國藥典》第一部川貝母項下方法測定，用稀乙醇做溶劑。

2.2.4 總生物堿含量測定

參照2020年版《中國藥典》第一部川貝母項下紫外-可見分光光度法測定。

2.2.4.1 供試品制備

精密稱取樣品粉末(過3號篩)2 g，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液3 mL，浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL，置80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.4.2 線性關(guān)系考察

精密稱取西貝母堿對照品2.0 mg，加三氯甲烷溶解并定容至10 mL，配制成0.2 mg/mL 的對照品溶液。再分別精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL，置25 mL具塞試管中，分別補(bǔ)加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL、再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在415 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y= 2.774X-0.024 1，r2= 0.999 5，線性范圍為0.022～0.221 mg/mL。

吸取供試品溶液2～5 mL，按相同方法進(jìn)行顯色，并測定吸光值，將樣品吸光值代入回歸方程計算，即得樣品中總生物堿含量。

2.2.5 淀粉含量測定(微量法)

2.2.5.1 測定原理

利用80%乙醇將川貝母中可溶性糖與淀粉分開，采用酸水分解法分解淀粉為葡萄糖，采用蒽酮比色法測定葡萄糖含量，計算淀粉含量。

2.2.5.2 供試品制備

精密稱定川貝母藥材粉末5 mg，加入1 mL淀粉含量檢測試劑盒(BC0705)中的試劑一，80 ℃水浴提取30 min，常溫離心5 min(3 000 g)，棄上清液，留沉淀，再加入0.5 mL雙蒸水，沸水浴糊化15 min，取出冷卻，加入上述試劑盒中的試劑二1 mL，沸水浴提取15 min，振蕩3～5次，冷卻后，常溫離心15 min(8 000 g)，取上清液，稀釋50倍，待測。

2.2.5.3 線性關(guān)系考察

稀釋葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液得到0.4、0.2、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，各吸取50 μL，以蒸餾水做空白，加入250 μL試劑盒中的工作液至EP管，95 ℃水浴10 min。自然冷卻至室溫，在620 nm波長下測定吸光度，計算ΔA=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，ΔA為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y= 3.094 4X-0.010 6，r2= 0.999 1，線性范圍為0.008～0.7 mg/mL。

吸取供試品50 μL，按相同方法進(jìn)行顯色，并測定吸光值，將樣品吸光值代入回歸方程計算，即得樣品中總淀粉含量。

2.2.5.4 淀粉含量的計算

淀粉含量計算公式為：淀粉含量=X×V÷W÷1.11×F÷1 000×100%。

其中X為線性回歸方程計算所得濃度；V為提取后體積，1.5 mL；W為稱樣量(g)；F為稀釋倍數(shù)；1.11是此法測得葡萄糖含量換算為淀粉含量的常數(shù)，即111 μg葡萄糖用蒽酮試劑顯色相當(dāng)于100 μg淀粉用蒽酮試劑顯色的顏色。

2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2019進(jìn)行整理計算，采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析(SNK)，采用Origin 2022軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類及相關(guān)性分析并作圖，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)主成分分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同干燥方法對栽培川貝母藥材外觀性狀的影響

不同干燥方法對栽培川貝母藥材的外觀性狀的影響，見表2及圖1。真空冷凍干燥藥材保持了川貝母鮮鱗莖的原有色澤性狀，表面顏色類白色，表皮易脫落，斷面質(zhì)地松泡多孔，富粉性，氣微，苦味明顯。熱風(fēng)干燥、真空干燥2種處理下的藥材外觀性狀差異較小，其表面呈淺黃色或棕黃色，且隨著溫度的增加其顏色加深，同時斷面特征明顯可見部分淀粉已變性，轉(zhuǎn)化為角質(zhì)團(tuán)塊；相同溫度下，經(jīng)105 ℃殺青處理后，其表面顏色為棕黃色，斷面呈角質(zhì)狀，改變了粉性的特征，與傳統(tǒng)記載川貝母藥材差異明顯，同時未水洗處理相較于水洗后干燥組，表面呈泥土色，體視顯微鏡下表皮可見明顯的泥土。曬干為傳統(tǒng)的干燥方法，加工后性狀藥材表面顏色為類白色，斷面粉性足，但由于栽培品含水量相較于野生品高，其干燥耗時長，部分表面氧化呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)。

表2 不同干燥方法處理后川貝母藥材的性狀特征

圖1 不同干燥方法栽培川貝母藥材外觀性狀

同時，色差儀測定粉末色差值結(jié)果見表3，測定結(jié)果中明亮度(L)值越大，顏色越白[18]。與肉眼觀察結(jié)果基本一致，除冷凍干燥外，其余組粉末顏色的L值普遍低于傳統(tǒng)曬干組，但以T4處理與傳統(tǒng)曬干ΔE最小，粉末顏色值與傳統(tǒng)曬干組最接近。

表3 不同干燥方法川貝母藥材粉末顏色測定值

3.2 不同干燥方法對栽培川貝母折干率及各成分的影響

由結(jié)果可見，不同干燥方法處理后川貝母藥材折干率及各成分含量具有一定差異(見表4)。曬干處理耗時長、干燥速率慢，藥材折干率顯著提高(P< 0.05)；熱風(fēng)干燥、真空干燥、冷凍干燥可不同程度減少干燥耗時，提高干燥速率，但折干率稍有下降。不同處理組浸出物在22.18%～24.67%之間，符合《中國藥典》2020年版川貝母項下規(guī)定最低限量(9.0%),其中T2浸出物顯著增加(P< 0.05)，因殺青時高溫促使藥材中淀粉溶脹、分裂，經(jīng)糊化后其淀粉分子間氫鍵斷裂，更易溶解于水中，同理其淀粉含量最低。與其他處理相比，冷凍干燥總生物堿、總淀粉含量均有不同程度的提高，其中相較于傳統(tǒng)曬干T1分別提高了38.40%、12.38%(P< 0.05)。不同溫度處理下，各成分含量呈現(xiàn)出隨著溫度的升高而逐漸降低的趨勢，以T4處理下最高(P< 0.05)，說明高溫下其總生物堿會進(jìn)行分解，同時加劇了鮮藥材干燥過程中的呼吸作用，加劇了內(nèi)部淀粉與糖分的分解，使得總淀粉含量降低。此外，比較T3、T4可知，栽培川貝母經(jīng)水洗后，其浸出物、總生物堿顯著增加(P< 0.05)，總淀粉含量無顯著性變化(P> 0.05)。

表4 栽培川貝母折干率、水分、浸出物、總生物堿、總淀粉的含量

3.3 聚類分析(HCA)

聚類分析(HCA)使用Origin 2022軟件，以上述各指標(biāo)為變量，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離平方(SED)為測度，采用系統(tǒng)聚類分析法對8批栽培川貝母藥材進(jìn)行模式識別分析，結(jié)果見圖2所示。8批不同干燥方法川貝母被分為4類，T1、T3、T4、T5為一類、T2、T6為一類，T7、T8分別單獨(dú)為一類。因此可知，采用聚類分析可將凍干處理組、真空干燥組與傳統(tǒng)曬干很明顯區(qū)分，而熱風(fēng)干燥組中50～55 ℃與傳統(tǒng)干燥外觀性狀與內(nèi)在質(zhì)量相似，被聚為一類，但是熱風(fēng)干燥組中T2、T6由于均經(jīng)高溫處理，其淀粉易糊化，導(dǎo)致質(zhì)地偏角質(zhì)化，與傳統(tǒng)質(zhì)地粉性不符，因此被單獨(dú)歸為一類?？梢?，聚類分析法既能反應(yīng)8種干燥方法的相似性，又能反映差異。

圖2 系統(tǒng)聚類熱圖

3.4 主成分分析(PCA)

為進(jìn)一步評價不同干燥方法對川貝母質(zhì)量的影響，對已測定的浸出物、總生物堿含量、總淀粉含量、顏色值L*、a*、b*以及表面、斷面得分為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，采用無監(jiān)督模式識別法PCA進(jìn)行分析，前3個主成分的特征值均>1，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)90.5%(見表5)。因此提取前3個主成分分析較為合適。因子載荷矩陣結(jié)果見表6，主成分1主要反映淀粉、L*、b*、表面得分、斷面得分的信息(載荷因子絕對值>0.5)，同理，主成分2主要反映a*、b*、斷面得分的信息，主成分3主要反映浸出物、總生物堿的信息。同時生成8批栽培川貝母的PCA得分圖(見圖3)。結(jié)果顯示，8批藥材基本可分為4組，冷凍干燥(T8)聚為一組，而熱風(fēng)干燥中殺青處理組(T2)與60 ℃干燥組(T6)聚為一組，真空干燥(T7)聚為一組，曬干、與剩余熱風(fēng)干燥處理組聚為一組，與聚類分析結(jié)果趨勢基本一致。

圖3 不同干燥方法川貝母PCA得分圖

表5 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表6 主成分因子載荷矩陣

3.5 藥材粉末顏色與有效成分含量之間相關(guān)性分析

將測定浸出物、總生物堿、總淀粉含量與顏色指標(biāo)值L*、a*、b*相關(guān)聯(lián)，用Origin 2022軟件作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示浸出物與顏色值L*、a*、b*無顯著性相關(guān)，總生物堿與顏色值b*、表面得分的相關(guān)系數(shù)分別為-0.50、0.43，雙尾檢驗的概率為P<0.05，說明總生物堿與顏色值指標(biāo)b*有顯著性負(fù)相關(guān)，與表面得分呈顯著性正相關(guān)，說明b*越大，總生物堿含量越低，表面得分越高，總生物堿含量越高。同理，淀粉含量與顏色值L*、b*、表面及斷面得分的相關(guān)系數(shù)為0.79、-0.42、0.97、0.92，雙尾檢驗的概率分別為P< 0.001、P< 0.05、P<0.001、P<0.001，說明總淀粉含量與顏色值L*、表面斷面得分成極顯著的正相關(guān)，與顏色值b*呈負(fù)相關(guān)，說明L*、表面得分、斷面得分越大，總淀粉含量越高；b*越大，總淀粉含量越低(見圖4)。

圖4 相關(guān)性分析圖

4 討論和結(jié)論

產(chǎn)地初加工是影響川貝母藥材生產(chǎn)及品質(zhì)的重要過程，川貝母本身性質(zhì)特殊，干燥難度大，難控制，在干燥過程中易產(chǎn)生油子、黃子等[19]，加之栽培品鱗莖個頭較大且外觀形狀、質(zhì)地有一定的變化，藥材性狀更難掌控，容易出現(xiàn)表面顏色偏黃、粗糙，粉性不足等問題。而目前川貝母藥材干燥方法仍主要是比較傳統(tǒng)的曬干法，對于栽培川貝母產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展具有一定局限性，如何在盡可能保持藥材性狀佳、成分含量高的同時，簡便高效地進(jìn)行干燥是亟待解決的問題。本次試驗比較了川貝母產(chǎn)區(qū)較為普遍的傳統(tǒng)曬干方法和現(xiàn)代新引進(jìn)的熱風(fēng)干燥技術(shù)、真空干燥技術(shù)、真空冷凍干燥技術(shù)對其外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示傳統(tǒng)干燥方法雖在性狀上具有一定優(yōu)勢，但其易受環(huán)境影響同時耗時長，生物堿類成分易損失，而冷凍干燥法能較好地保持藥材的外觀性狀，淀粉含量、總生物堿含量均最高，原因可能是由于冷凍干燥避免了高溫常壓蒸發(fā)對干燥物質(zhì)產(chǎn)生的氧化、分解現(xiàn)象，能較大程度地保持藥材原有的營養(yǎng)成分和較高的有效成分[20,21]；熱風(fēng)干燥(50～55 ℃)在提高干燥速率、縮短干燥時間，同時可較好地保持外觀性狀以及減少有效成分損失，但高溫105 ℃殺青或60 ℃較高溫度干燥的藥材，其淀粉顆粒發(fā)生糊化，質(zhì)地易由粉性變化為角質(zhì)，同時使生物堿類物質(zhì)損失加快，淀粉加速分解為糖類物質(zhì)，此種干燥方法雖快，但對其外觀形狀及有效成分影響顯著，故不適合栽培川貝母的干燥，可見溫度是引起藥材理化性質(zhì)和生物活性改變的關(guān)鍵[22]。

中藥材經(jīng)驗鑒別為“辨狀論質(zhì)”，現(xiàn)代研究均表明中藥材性狀是判斷其品質(zhì)評價的重要指標(biāo)[23]，如安息香表面黃白色至黃棕色、斷面象牙白時其有效成分苯甲酸等含有量較高[24]。而傳統(tǒng)認(rèn)知，貝母“以鱗莖完整、均勻、色白，有粉性者為佳”[25]，但缺乏定量檢測的方法，故本研究引入色度分析原理以及淀粉含量對川貝母藥材的顏色、粉性進(jìn)行了客觀量化，結(jié)果表明川貝母藥材偏白，其總生堿含量及淀粉含量相對較高。但由于本次實驗干燥樣品數(shù)量有限以及分析化學(xué)成分種類不夠全面，因此在預(yù)測色差值與有效成分相關(guān)性仍需建立更全面的多指標(biāo)綜合評價方法以及收集大量樣品進(jìn)行驗證。

綜上所述，干燥方法是影響藥材外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量的重要因素。傳統(tǒng)曬干在栽培川貝母的產(chǎn)地加工中具有一定局限性，僅適用于較小的鱗莖且保證陽光充足的情況。熱風(fēng)干燥方法所得藥材在外觀或質(zhì)量上與傳統(tǒng)曬干最為類似，在一定程度上保證藥材外觀性狀的基礎(chǔ)上，不僅能減少有效成分分的損失，并且能提高干燥效率，減少干燥時間，為規(guī)?；a(chǎn)節(jié)約時間成本，建議在生產(chǎn)上采用50～55 ℃熱風(fēng)干燥作為產(chǎn)地干燥方法。同時冷凍干燥因能較大程度地保留有效成分，因此以提取貝母有效成分為目的時，可采用此方法進(jìn)行干燥，但冷凍干燥藥材質(zhì)地松泡，斷面空隙大且多，在后期包裝與貯藏中應(yīng)該注意特殊管理，避免受潮。