兒茶素與卵黃免疫球蛋白互作的多重光譜分析及抑菌性變化

張孟軍，劉麗莉*，楊協(xié)力，郭凈芳，王浩陽

1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品加工與安全國家級教學(xué)示范中心，食品微生物河南省工程技術(shù)研究中心， 功能食品資源研究與利用河南省教育廳科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，河南 洛陽 471023 2. 河南科技大學(xué)麗正書院，河南 洛陽 471023

引 言

卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)因其安全且具有較高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、 功能食品、 化工等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。 作為一種新生代抗體，在人類保健、 疾病的診斷和防治等方面成效顯著，具有極高的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。 目前有關(guān)于IgY的研究有很多，Karamzadeh[3]等將益生菌與IgY聯(lián)用研究其對犢牛生長性能、 腹瀉發(fā)生率和免疫系統(tǒng)的影響，結(jié)果表明IgY能提高犢牛免疫力并有效預(yù)防其腹瀉； 賀維朝等[4]、 Redwan等[5]對其提取工藝及其在畜禽細(xì)菌性腸道疾病防治中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明IgY在抑制有害菌繁殖防治畜禽疾病方面可作為抗生素的替代品。 IgY對多種病原微生物具有良好的抑菌效果，抑菌性能作為其一大重要功能特性，在制備更加安全高效的抑菌劑，緩解抗生素使用帶來的藥物殘留及耐藥性問題和制備高附加值天然產(chǎn)物功能食品等方面具有重要意義。 然而IgY生產(chǎn)成本高，且其在胃腸消化過程中易被蛋白酶分解而失活，導(dǎo)致抗菌功效的發(fā)揮受到阻礙，一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用； 通過物理化學(xué)改性修飾等方式提高其生物利用率是目前亟待解決的問題。

多酚類物質(zhì)可與蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合形成可逆或不可逆的復(fù)合物，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能特性及生物可利用度[6]。 有報(bào)道將兩者相互作用的機(jī)制對蛋白質(zhì)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了大量研究，并將其廣泛應(yīng)用于功能食品及食品加工過程。 Jia等[7]用多光譜和建模方法比較β-乳球蛋白與三種常見多酚的結(jié)合相互作用機(jī)制，為多酚在乳品加工業(yè)中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。 Jia等[8]分析了EGCG與乳清分離蛋白進(jìn)行共價(jià)相互作用對其功能性質(zhì)的影響，結(jié)果表明其起泡性和乳化性均得到了提高。 周緒霞等[9]研究了茶多酚對蛋清蛋白的影響，得出相互作用后蛋白質(zhì)的凝膠特性及乳化穩(wěn)定性均得到了提升。 大量研究表明多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用可以優(yōu)化大多數(shù)蛋白質(zhì)的特性[7-10]。 然而目前有關(guān)IgY改性以改善其性質(zhì)的研究主要集中在糖基化、 mPEG修飾等對其穩(wěn)定性的影響，將多酚類物質(zhì)與IgY進(jìn)行相互作用制備復(fù)合物并探究其結(jié)構(gòu)及抑菌性能變化的研究鮮有報(bào)道。 牛夢憲[11]等考察了3種天然提取物對卵黃免疫球蛋白抑制胰脂肪酶作用的影響，結(jié)果表明三種物質(zhì)均表現(xiàn)出增效作用，其中茶多酚效果最明顯，但其增效機(jī)制尚不清楚。 明確多酚類物質(zhì)與IgY的互作機(jī)制對研究其結(jié)構(gòu)、 功能的變化及其在各領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用具有重要的意義。

故本研究通過多重光譜分析探究兒茶素與IgY的相互作用機(jī)制，即紫外可見光譜法分析兩者相互作用后蛋白質(zhì)氨基酸微環(huán)境的變化，熒光光譜法對其熒光猝滅機(jī)理、 結(jié)合常數(shù)、 結(jié)合位點(diǎn)、 熱力學(xué)參數(shù)及相互作用力類型進(jìn)行判定，傅里葉變換紅外光譜法分析相互作用后二級結(jié)構(gòu)的變化。 并研究其復(fù)合物的抑菌性能變化。 以期為提高IgY的生物利用度及制備更加安全高效的抑菌劑用以替代抗生素提供新思路，同時(shí)為IgY在功能食品中應(yīng)用及加工過程中的性質(zhì)變化提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋購于洛陽大張超市； 兒茶素(AR)購自合肥博美生物科技有限公司； LB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司； 試驗(yàn)所需菌種均為河南科技大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器

TDZ5-BP高速冷凍離心機(jī)，長沙湘銳有限公司； LGJ-10D真空冷凍干燥機(jī)，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司； UV-2600紫外-分光光度計(jì)，日本日立公司； Cary eclpise熒光分光光度計(jì)，美國Aglient Cary elipse公司； VERTEX70傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 IgY、 混合物及復(fù)合物的制備

IgY的分離與純化按照張曼等[12]的方法并加以改進(jìn)，將硫酸銨沉淀法制得的IgY溶液在4 ℃條件下透析(截留分子量為8 000～14 000 Da)48 h除鹽。 經(jīng)真空冷凍干燥制得IgY凍干粉。 將IgY與兒茶素按照質(zhì)量濃度為1∶1混合，一份不做任何處理，另一份室溫下于磁力攪拌器中攪拌6 h，經(jīng)真空冷凍干燥制得混合物及復(fù)合物微粒。

1.3.2 紫外可見光譜法測定兒茶素與IgY的相互作用

參考文獻(xiàn)[13]的方法并加以改進(jìn)，將IgY配制成0.5 mg·mL-1的溶液，分別移取4 mL于編號1—5的離心管中，加入50 μL不同質(zhì)量濃度的兒茶素溶液，使其終濃度分別為0，6.25，12.5，18.75和25 μg·mL-1。 充分混勻后靜置20 min，掃描波長： 250～350 nm。

1.3.3 熒光光譜法測定兒茶素與IgY的相互作用

按照1.3.2方法制備3組樣品溶液，分別在291，298和310 K條件下恒溫水浴5 min。 測定條件為： 激發(fā)波長(280 nm)，激發(fā)和發(fā)射狹縫(10 nm)，掃描范圍(300～500 nm)。

1.3.4 傅里葉紅外光譜法測定兒茶素與IgY的相互作用

將IgY與復(fù)合物分別與干燥后的溴化鉀粉末按照1∶100(m/m)混勻研細(xì)后壓片，分辨率為4 cm-1，掃描范圍： 4 000～400 cm-1。 用Peak Fit v4. 12軟件分析IgY與復(fù)合物酰胺Ⅰ帶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量變化。

1.3.5 菌懸液制備及抑菌活性的測定

參考文獻(xiàn)[14]的方法制備菌懸液并調(diào)整菌液濃度至106～108CFU·mL-1，將菌懸液與滅菌后的固體培養(yǎng)基按照1∶100的比例混勻后鋪于平板。 采用打孔法測定抑菌活性。 每孔加入200 μL的5 mg·mL-1的樣品，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.6 IgY、 混合物、 復(fù)合物的抑菌率測定

參照文獻(xiàn)[15]方法并加以改進(jìn)，取7只試管分別加入4 mL液體培養(yǎng)基滅菌后備用，向滅菌后的1—5號試管中加入100 μL菌液及1 mL一定濃度的樣品溶液使其終濃度分別為0.025，0.05，0.1，0.15和0.2 mg·mL-1，6號試管加入1 mL滅菌后的蒸餾水及100 μL菌液作為陽性對照，7號試管只加培養(yǎng)基作為陰性對照，置于恒溫?fù)u床中37℃培養(yǎng)12 h后600 nm下測定光密度(optical density,OD)值。

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均做3次平行，利用Origin 9.0軟件對紫外光譜、 熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑預(yù)處理及作圖，利用DPS 7.05軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見光譜分析兒茶素與IgY的相互作用

小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合后會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，紫外-可見光譜可通過峰強(qiáng)度及峰位的變化反映其如何進(jìn)行相互作用。 峰強(qiáng)度及峰位的變化分別反映兩者相互作用的強(qiáng)弱及蛋白質(zhì)大分子疏水氨基酸殘基所處的微環(huán)境是否發(fā)生了改變[16]。 蛋白質(zhì)中的色氨酸及酪氨酸殘基在紫外-可見光譜中吸收峰出現(xiàn)在280 nm附近[13]。 設(shè)定IgY濃度為0.5 mg·mL-1，向其中加入不同濃度的兒茶素后觀察兩者結(jié)合的紫外吸收光譜，其光譜變化如圖1所示。 兒茶素濃度越大，紫外吸收峰值越高，且隨其濃度增強(qiáng)依次增大。 最大吸收峰波長從279 nm藍(lán)移至276 nm，說明IgY的構(gòu)象發(fā)生了改變。 原因可能是兒茶素的加入能夠使IgY中肽鏈發(fā)生改變，使其更加舒展，有助于蛋白質(zhì)釋放出分子內(nèi)部的發(fā)色基團(tuán)殘基中的芳香雜環(huán)，進(jìn)而使其紫外吸收強(qiáng)度增加。

圖1 不同質(zhì)量濃度的兒茶素與IgY結(jié)合的紫外光譜圖

2.2 熒光光譜分析兒茶素與IgY的相互作用

2.2.1 兒茶素與IgY結(jié)合的熒光光譜分析

蛋白質(zhì)分子中的生色基團(tuán)可以在特定波長下產(chǎn)生特征峰，除去生色基團(tuán)中自身發(fā)射熒光較弱且很容易被猝滅劑猝滅的氨基酸殘基，主要研究色氨酸(348 nm)的熒光光譜變化[17]。 以280 nm為激發(fā)波長，研究不同質(zhì)量濃度的兒茶素在18，25和37 ℃與IgY結(jié)合的熒光光譜，結(jié)果如圖2(a,b,c)所示。

兒茶素作為一種小分子物質(zhì)與IgY結(jié)合，降低了蛋白質(zhì)分子中發(fā)射熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率，使得其熒光強(qiáng)度降低，產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象。 圖2顯示了不同溫度處理下不同質(zhì)量濃度的兒茶素與IgY結(jié)合的熒光光譜圖。 由圖2可知，在同一溫度下，隨著兒茶素濃度的增加，IgY的熒光猝滅效果均呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，并發(fā)生紅移現(xiàn)象。 進(jìn)一步表明兩者之間產(chǎn)生了相互作用，且在這種相互作用的促進(jìn)下形成了熒光強(qiáng)度較低的復(fù)合物。 原因可能是兒茶素的加入導(dǎo)致IgY中色氨酸周圍微環(huán)境發(fā)生變化，促進(jìn)兩者之間疏水相互作用及氫鍵的形成。 文鵬程等[18]研究了茶多酚對牛奶蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果與本文相似。 熱處理對IgY的熒光強(qiáng)度也有影響，在291～310 K溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，IgY熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，兒茶素存在時(shí)熒光猝滅效果也有類似的變化。

圖2 不同溫度和質(zhì)量濃度的兒茶素與IgY結(jié)合的熒光光譜圖(a): 18 ℃; (b): 25 ℃; (c): 37 ℃Fig.2 Fluorescence spectra of different concentrations of catechins and different temperature binding to IgY(a): 18 ℃; (b): 25 ℃; (c): 37 ℃

2.2.2 熒光猝滅機(jī)理的判定

猝滅劑對蛋白質(zhì)分子的熒光猝滅類型分為兩種。 一種是由于離子擴(kuò)散導(dǎo)致猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大的動態(tài)猝滅； 另一種為形成了復(fù)合物而導(dǎo)致猝滅常數(shù)變化趨勢與其相反的靜態(tài)猝滅。 在多酚與蛋白質(zhì)相互作用的研究中，常用Stern-Volmer方程判斷其猝滅類型。

(2)

式(2)中：F0和F分別為未添加兒茶素和兒茶素濃度為Q時(shí)IgY的熒光強(qiáng)度，[Q]為兒茶素的濃度(mol·L-1)，式(3)同；Kq為猝滅速率常數(shù)，Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的平均壽命，約為10-8s。

以F0/F為因變量，對[Q]進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖3所示，進(jìn)而通過式(2)得出Kq及Ksv，結(jié)果如表1所示。 由圖3及表1可知，兒茶素與IgY的Stern-Volmer曲線具有良好的線性關(guān)系。Ksv隨著溫度的升高呈現(xiàn)降低趨勢，這表明兒茶素與IgY相互作用的猝滅機(jī)制可能是靜態(tài)猝滅。 經(jīng)研究表明，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010mol·(L·s)-1。 由表1可知，291，298和310 K條件下Kq均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2.0×1010mol·(L·s)-1，進(jìn)一步表明兩者相互作用的猝滅機(jī)制主要為兒茶素與IgY結(jié)合形成了基態(tài)穩(wěn)定復(fù)合物而導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅。 王晨等[19]在花青素與小麥蛋白相互作用研究中發(fā)現(xiàn)花青素與麥谷蛋白相互作用的熒光猝滅方式為靜態(tài)猝滅。 與本研究結(jié)果相似。

圖3 不同溫度條件下兒茶素猝滅IgY的Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer plots of IgY quenchedby catechinat different temperatures

表1 兒茶素-IgY復(fù)合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Quenching rate constants and correlationcoefficients of catechin and IgY

2.2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算

對于猝滅類型為靜態(tài)猝滅的小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，可采用式(3)計(jì)算其結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)n。

(3)

根據(jù)式(3)將數(shù)據(jù)經(jīng)擬合后繪制雙對數(shù)圖，并計(jì)算出KA和n，結(jié)果如圖4和表2所示。 由表2可知，3個(gè)溫度下，兒茶素與IgY均存在著強(qiáng)烈的相互作用。 均形成了結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近于1的靜態(tài)復(fù)合物，即二者結(jié)合比例接近1∶1。

圖4 不同溫度條件下IgY-兒茶素復(fù)合物的雙對數(shù)圖Fig.4 Logarithmic diagram of IgY-catechincomplexes at different temperatures

表2 兒茶素-IgY復(fù)合物的表觀結(jié)合常數(shù)、 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)

2.2.4 熱力學(xué)參數(shù)及相互作用力類型判定

熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔH、 吉布斯自由能變化ΔG、 熵變ΔS根據(jù)劉建壘[20]等的方法進(jìn)行計(jì)算并進(jìn)行作用力類型判斷，結(jié)果如表3所示。 由表3可知，兒茶素與IgY互作結(jié)合可自發(fā)進(jìn)行，且該過程為放熱反應(yīng)，這與2.2.3中KA隨溫度變化的趨勢結(jié)果一致。 由ΔH及ΔS均小于0可以得出，范德華力及氫鍵作用力是兒茶素與IgY互作結(jié)合形成復(fù)合物的主要作用力類型。

表3 兒茶素-IgY復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of catechin-IgY complex

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析兒茶素與IgY的相互作用

通過傅里葉變換紅外光譜進(jìn)一步研究IgY與復(fù)合物蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 IgY和IgY-兒茶素復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 Fourier transform infrared spectraof IgY and IgY-catechins complex

由圖5可知，相較于IgY，復(fù)合物酰胺Ⅰ帶的峰位從1 646.90 cm-1藍(lán)移至1 631.14 cm-1。 酰胺Ⅱ帶從1 529.49 cm-1藍(lán)移至1 520.94 cm-1，說明兒茶素的引入使IgY的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。 劉勤勤等[21]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚與大豆分離蛋白相互作用也引起其酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶發(fā)生藍(lán)移，與本研究結(jié)果一致。 3 500～3 200 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為O—H的特征峰，由圖5可以看出，復(fù)合物此范圍內(nèi)的峰形較IgY變寬，說明復(fù)合物形成了新的氫鍵，相比于IgY，其締合程度增大。 對酰胺I帶進(jìn)行去卷積處理，通過Gaussian擬合計(jì)算峰面積進(jìn)而得出各類二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量，結(jié)果如表4所示。 由表4可知，相較于IgY，復(fù)合物β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角含量變化不明顯，α-螺旋含量升高，無規(guī)卷曲含量降低。 α-螺旋是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的主要有序結(jié)構(gòu)，與β-折疊相同，二者皆通過分子內(nèi)氫鍵維持。 α-螺旋含量的升高表明兒茶素的引入促進(jìn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)新的氫鍵的形成，推測新的氫鍵可能為兒茶素的酚羥基與IgY中的羰基結(jié)合導(dǎo)致氫鍵的重排所致。 與上述結(jié)果一致。

表4 IgY與IgY-兒茶素復(fù)合物酰胺Ⅰ帶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量

2.4 IgY、 混合物及復(fù)合物抑菌性能對比分析

有研究表明，雞卵黃免疫球蛋白IgY能夠使細(xì)胞聚集，通過降低細(xì)菌細(xì)胞膜表面疏水性及粘附性進(jìn)而抑制多種病原微生物的生長和繁殖[22]。 其抑菌活性具有重要的生理意義，尤其當(dāng)這種抑制作用發(fā)生在腸道消化過程時(shí)，IgY有利于抑制有害菌的生長并將其排除體外，這也使得其有望成為抗生素的理想替代品之一。 本研究將兒茶素與IgY進(jìn)行相互作用制備其復(fù)合物并以IgY與兒茶素的混合物為對照組，對其抑菌性能進(jìn)行了研究。 結(jié)果如圖6及表5所示。

圖6 IgY、 混合物與IgY-兒茶素復(fù)合物的抑菌效果圖Fig.6 Antibacterial effect of IgY, mixtureand IgY-catechin complex

表5 IgY、 混合物與IgY-兒茶素復(fù)合物的抑菌率Table 5 Bacteriostatic rate of IgY, mixture and IgY-catechin complex

由表5結(jié)果可知，IgY、 混合物及復(fù)合物濃度與其對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的抑菌率呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)濃度小于0.05 mg·mL-1時(shí)，對大腸桿菌的抑制率從大到小表現(xiàn)為混合物>復(fù)合物>IgY； 而當(dāng)濃度大于0.05 mg·mL-1時(shí)，復(fù)合物表現(xiàn)出最好的抑制作用，對大腸桿菌的抑菌率較IgY和混合物分別平均提高了15.74%和13.27%。 對于金黃色葡萄球菌，抑菌率表現(xiàn)為復(fù)合物>混合物>IgY，復(fù)合物較IgY和混合物抑菌率分別平均提高了135.8%和9.95%。 圖6為三種樣品濃度為5 mg·mL-1時(shí)的抑菌圈結(jié)果，在培養(yǎng)24 h的情況下，IgY抑菌圈較小，原因可能是培養(yǎng)時(shí)間較長，菌濃度較大，IgY部分成為了氮源導(dǎo)致的。 結(jié)合圖6可以看出，復(fù)合物的抑菌效果最好。 以混合物為對照進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)合物的形成，且表明抑菌效果的提升來源于復(fù)合物。

3 結(jié) 論

(1)兒茶素與IgY相互作用的多重光譜分析結(jié)果表明： 蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了改變，兒茶素與IgY兩者相互作用結(jié)合形成了結(jié)合位點(diǎn)接近于1的基態(tài)穩(wěn)定復(fù)合物，其熒光猝滅機(jī)制主要為靜態(tài)猝滅，范德華力及氫鍵為二者互作結(jié)合的主要作用力。 與IgY相比，復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生改變，其中β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角含量無明顯變化，α-螺旋含量升高、 無規(guī)卷曲含量降低。

(2)對比分析IgY、 混合物、 復(fù)合物的抑菌效果。 得出相比于IgY和混合物，復(fù)合物對金黃色葡萄球菌的抑菌率分別平均提高了135.8%和9.95%，在濃度大于0.05 mg·mL-1時(shí)對大腸桿菌的抑菌率分別平均提高了15.74%和13.27%。 復(fù)合物表現(xiàn)出最好的抑菌效果。

(3)結(jié)合多重光譜分析與抑菌效果分析，得出兒茶素與IgY可相互作用結(jié)合形成復(fù)合物，其抑菌效果優(yōu)于IgY，可為抗生素替代品的制備提供理論指導(dǎo)及為IgY在食品加工中的應(yīng)用提供理論支持。