葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在野生植物響應(yīng)多環(huán)芳烴(菲)脅迫的應(yīng)用研究

丁俊男，王 慧，于少鵬

哈爾濱學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)濕地環(huán)境與生態(tài)研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150086

引 言

隨著我國城鎮(zhèn)化和經(jīng)濟(jì)建設(shè)的快速發(fā)展，工農(nóng)業(yè)廢棄物及人類生活垃圾所產(chǎn)生的持久性有機(jī)污染物危害生態(tài)環(huán)境狀況愈發(fā)嚴(yán)重，已成為世界各國所面臨的重大環(huán)境與公共健康問題[1]。 其中具有致癌、 致突變和致畸性特性的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)極易被動植物所吸收富集，并可通過食物鏈和環(huán)境接觸等途徑危害人類的健康，是各國優(yōu)先控制的一類有機(jī)污染物[2]。 菲(phenanthrene，Phe)是具有三個苯環(huán)的多環(huán)芳烴類有機(jī)污染物，來源主要由垃圾處理中有機(jī)物的不完全燃燒、 工農(nóng)業(yè)“三廢”和汽車尾氣排放，因其結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定、 難降解而廣泛存在于土壤、 水體的沉積物和空氣中，其中土壤菲的環(huán)境污染問題尤為突出[3]。 植物長期處于土壤菲脅迫下會影響其正常的生長發(fā)育，菲可通過根部吸附積累在植物體中，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物活性氧可參與植物體的氧化還原循環(huán)過程，引起植物體內(nèi)分子水平和膜脂器官的氧化損傷等一系列毒害效應(yīng)[4]。 野生大豆(Glycinesoja)是我國重點二級保護(hù)漸瀕危野生物種，是改良栽培大豆重要的天然種質(zhì)基因庫，亦可作為土壤多環(huán)芳烴污染修復(fù)的理想植物。

植物光合作用是對逆境脅迫比較敏感的過程之一，而葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)作為研究植物逆境下光合機(jī)構(gòu)功能主要研究方法，特別是可以反映逆境下植物葉片對光能的吸收和利用能力以及PSⅡ反應(yīng)中心活性的變化，目前在植物生理生態(tài)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的推廣應(yīng)用[5]。 根據(jù)光合電子傳遞和葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)率理論，捕光色素吸收的光能絕大部分用于光化學(xué)反應(yīng)，其余的能量以熱能和熒光的形式耗散掉。 利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)測量時，通常會在光合作用單次周轉(zhuǎn)期間(初級電子受體QA再氧化周期內(nèi))發(fā)射一束飽和激發(fā)光，使初級電子受體QA完全被氧化，無法再接收來自水裂解產(chǎn)生的電子，導(dǎo)致電子傳遞鏈被完全阻塞，從而使得PSⅡ反應(yīng)中心全關(guān)閉，葉綠素吸收的過量能量只能以熒光、 熱能等形式發(fā)散[6]。 為探明葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在野生植物受環(huán)境中有機(jī)污染物——多環(huán)芳烴(菲)脅迫研究中應(yīng)用的方法，本試驗以野生大豆為試驗材料，應(yīng)用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)，主要研究土壤菲脅迫下野生大豆葉片PSⅡ反應(yīng)中心活性以及光合能量分配參數(shù)的變化特點，探討土壤菲脅迫對野生大豆葉片放氧復(fù)合體活性、 光合電子傳遞能力以及光合能量分配參數(shù)的影響，以期探明環(huán)境中多環(huán)芳烴(菲)脅迫對植物光合作用的影響機(jī)理。

1 實驗部分

1.1 試驗設(shè)計

供試材料野生大豆品種ZYD5由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作與栽培研究所大豆室提供，采自黑龍江省大興安嶺地區(qū)呼瑪縣，生境內(nèi)主要植被有喬木、 雜草、 蒿等植物，該地區(qū)年平均日照時數(shù)2 529 h，年平均降水量500 mm，土壤類型主要為暗棕壤。 供試材料主要形態(tài)特征： 主根細(xì)長，側(cè)根極少。 蔓莖纖細(xì)，纏繞，略帶四棱形，密披淺棕色茸毛。 葉互生，3小葉，葉柄長2.6～3.0 cm，淺棕色茸毛，小葉披針形，長4.5～5.0 cm，寬1.0～1.5 cm，側(cè)生小葉片表面綠色，背面淺綠色，兩面均有淺棕色茸毛，葉脈于兩面稍隆起，全緣，密披棕褐色茸毛。 蝶形花，紫紅色，腋生總狀花序，花萼鐘狀，5裂，旗瓣近圓形，雄蕊10枚，9枚花絲連在一起成管狀，1枚單獨分離，二體。 莢有棕色茸毛，彎鐮形。 籽粒黑色，長橢圓形，有泥膜，臍黑色。

試驗采用盆栽種植方式，以草炭土為土壤基質(zhì)。 土壤中分別添加培養(yǎng)基質(zhì)采用草炭土，試驗基質(zhì)中菲的含量分別設(shè)為0(CK為對照組)，50，100和200 mg·kg-1共4個濃度梯度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以風(fēng)干土壤計算，各處理中的菲以10 mL的丙酮作助溶劑，將丙酮和菲混勻后加入土壤中充分?jǐn)嚢瑁糜陉帥鐾L(fēng)處風(fēng)干12 h，使丙酮充分揮發(fā)。 將精選成熟飽滿、 大小相對一致的野生大豆品種ZYD5的種子均勻播種到含有不同濃度菲土壤的培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)缽直徑12 cm、 高15 cm，每缽種植20粒種子，每個處理5缽重復(fù)，共計20缽。 將培養(yǎng)缽放在光照強(qiáng)度200～300 μmol·m-2·s-1、 光周期12/12 h(光/暗)的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，定期澆水和苗期管理，待幼苗出土長至株高約10 cm時，間苗處理，每缽保留健壯、 生長相對一致的幼苗8株，待播種60 d后開始進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定： 將不同處理野生大豆植株葉片進(jìn)行0.5 h暗適應(yīng)后，利用便攜式脈沖調(diào)制熒光儀FMS-2(Hansatch公司，英國)測定PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和電子傳遞速率(ETR)、 光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)猝滅(NPQ)等。 各葉綠素?zé)晒鈪?shù)值的計算方法分別為 PSⅡ電子量子產(chǎn)率

(1)

電子傳遞速率

ETR=0.5×0.85×ФPSⅡ×PFD

(2)

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈩恿?shù)的測定

利用Mini調(diào)制式掌上葉綠素?zé)晒鈨x(FluorPen FP 100 max，捷克)測定各處理葉片的OJIP參數(shù)，其中O，J，I和P點分別為0，2，30和1000 ms對應(yīng)的時刻，OJIP參數(shù)由3 000 μmol·m-2·s-1的脈沖紅光誘導(dǎo)，熒光信號記錄從10 μs開始至1 s結(jié)束，每秒105個數(shù)據(jù)。 利用5次OJIP參數(shù)平均值繪制OJIP柱形圖，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行O-P點和O-J點標(biāo)準(zhǔn)化，參數(shù)橫坐標(biāo)以對數(shù)形式表示。

O-P點標(biāo)準(zhǔn)化時

VO-P=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)

(3)

O-J點標(biāo)準(zhǔn)化時

VO-J=(Ft-Fo)/(FJ-Fo)

(4)

式(3)和式(4)中，F(xiàn)t為各時間點的熒光強(qiáng)度。 分別計算菲濃度為50，100和200 mg·kg-1處理(TR)和CK標(biāo)準(zhǔn)化后的OJIP參數(shù)差值，即ΔVO-P=VO-P(TR)-VO-P(CK)，ΔVO-J=VO-J(TR)-VO-J(CK)。

2 結(jié)果與討論

2.1 多環(huán)芳烴(菲)對野生大豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可表征植物葉綠體PSⅡ系統(tǒng)反應(yīng)中心的能量吸收利用、 傳遞和耗散過程，采用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)能夠靈敏、 無損地測定植物PSⅡ系統(tǒng)反應(yīng)中心活性，快速了解逆境條件下光合器官的損傷狀況，被廣泛稱為研究植物光合作用反應(yīng)機(jī)制與環(huán)境因子脅迫響應(yīng)的無損探針[9]。Fv/Fm表示植物光系統(tǒng)中光能的轉(zhuǎn)化效率(如圖1所示)，本研究中不同土壤菲濃度下Fv/Fm均保持在0.8左右，土壤菲濃度低于100 mg·kg-1時野生大豆葉片的Fv/Fm與CK無顯著差異，土壤菲濃度達(dá)200和Fv/Fm分別較CK降低了2.74%(p<0.05)，能夠基本保持穩(wěn)定，與前人的研究結(jié)果相一致[10]； 同時，土壤菲脅迫導(dǎo)致光合電子傳遞速率(ETR)能力減弱，降低了光合電子傳遞鏈上的電子傳遞能力[圖1(a)]； 光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)參數(shù)的下降表明土壤菲脅迫降低了野生大豆葉片PSⅡ反應(yīng)中心的活性及開放程度，減少了參與光合CO2固定和光呼吸的能量； 土壤菲脅迫濃度的增大使得野生大豆葉片非光化學(xué)猝滅參數(shù)(NPQ)的上調(diào)，確保以更多的熱耗散形式來有效降低由天線色素吸收的光能過剩而引起對PSⅡ反應(yīng)中心造成的生理損害[圖1(b)][11]。

圖1 土壤菲對野生大豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響(a): Fv/Fm和ETR熒光參數(shù)變化趨勢； (b): qP和NPQ熒光參數(shù)變化趨勢Fig.1 Effects of chlorophyll fluorescence characters in leaves of Glycine soja to soils phenanthrene stress(a): Variation trend of Fv/Fm and ETR fluorescence parameters; (b): Variation trend of qP and NPQ fluorescence parameters

2.2 土壤菲脅迫對野生大豆葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線的影響

OJIP曲線中蘊(yùn)含著豐富的PSⅡ原初光化學(xué)反應(yīng)信息，通過短時間光照后熒光信號的瞬時變化以較高的分辨率研究Fo到Fm變化的熒光信息，即可以研究包括PSⅡ電子供應(yīng)、 傳遞以及PSⅡ反應(yīng)中心活性的變化等。 土壤菲脅迫下野生大豆葉片的OJIP曲線發(fā)生了改變[圖2(a,b)所示]，土壤菲濃度為50和100 mg·kg-1時OJIP曲線上O點熒光強(qiáng)度無明顯變化，而菲濃度達(dá)200 mg·kg-1時O點熒光強(qiáng)度明顯增加(p<0.05)，隨著菲濃度的增加，OJIP柱形圖上J點熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，P點熒光強(qiáng)度下降[圖2(a,b)]。

圖2 不同濃度土壤菲脅迫下野生大豆幼苗葉片的OJIP曲線(a): OJIP曲線變化趨勢； (b): O, J, I, P各點差異分析Fig.2 Chlorophyll a fluorescence transient (OJIP) in leaves of Glycine soja to phenanthrene polluted(a): Change trend of OJIP curve； (b): Difference analysis of each point on O, J, I, P

2.3 土壤菲脅迫對野生大豆葉片PSII電子受體側(cè)和電子供體側(cè)傳遞能力的影響

如圖3(a—e)所示由于原始OJIP數(shù)據(jù)變異性受外界因素的影響較大，因此常通過數(shù)學(xué)方法把熒光信號數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，即使所有的OJIP數(shù)據(jù)具有相同的起點和終點，將OJIP數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后可以發(fā)現(xiàn)，隨著土壤中菲濃度的增加，OJIP數(shù)據(jù)變化上J點和I點的相對可變熒光明顯上升，并且隨著土壤中菲濃度的增加，增加趨勢更為明顯[圖3(a,b)所示]。 將不同濃度菲處理與CK之間的標(biāo)準(zhǔn)化OJIP曲線做差值也可以看出，隨著土壤中菲濃度的增加，J點和I點的相對可變熒光強(qiáng)度變化較明顯，并且表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)，即菲脅迫明顯抑制了大豆幼苗葉片PSII受體側(cè)的電子傳遞，如圖3(c,d)所示。 研究發(fā)現(xiàn)，PAHs會抑制植物蛋白質(zhì)的合成，或加速蛋白質(zhì)的降解，如D1蛋白等，而D1蛋白的第190位His殘基與原初電子供體中的Mn原子相結(jié)合，D1蛋白的含量會直接影響到放氧復(fù)合體的功能，土壤菲脅迫下野生大豆幼苗葉片OJIP曲線上0.3 ms時K點熒光強(qiáng)度增加，K點的熒光強(qiáng)度的增加與PSⅡ電子供體側(cè)OEC的損傷有關(guān)，當(dāng)OEC活性受到抑制時會使水裂解過程中產(chǎn)生大量的H2O2，而葉綠體內(nèi)還不含有清除H2O2的CAT，H2O2氧化細(xì)胞中的DNA和蛋白質(zhì)等，還會通過破壞OEC的構(gòu)成亞基而反饋抑制OEC的活性，因此，菲脅迫會通過抑制野生大豆幼苗葉片OEC的活性而降低光合電子的產(chǎn)生； 另外OEC活性的抑制導(dǎo)致活性氧的代謝紊亂也可能是導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生光抑制的重要原因之一。

圖3 土壤菲脅迫下野生大豆葉片標(biāo)準(zhǔn)化的O-P和O-J曲線及相對可變熒光差異顯著分析(a): O-P點數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化熒光曲線變化趨勢； (b): O-J點數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化熒光曲線變化趨勢；(c): O-P點與CK數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化差值熒光曲線變化趨勢； (d): O-J點與CK數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化差值熒光曲線變化趨勢；(e): I, K, J各點相對可變熒光差異分析Fig.3 Chlorophyll a fluorescence transients (O-P and O-J) were normalized and significant differenceanalysis of relative variable fluorescence in leaves of Glycine soja to phenanthrene polluted soils(a): Variation trend of fluorescence curve of O-P point data standardization;(b): Variation trend of fluorescence curve of O-J point data standardization;(c): Variation trend of fluorescence curve of standardized different between O-P and CK date;(d): Variation trend of fluorescence curve of standardized different between O-J and CK date;(e): Analysis of relative variable fluorescence difference of I, K, J points

2.4 土壤菲脅迫對野生大豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖4 土壤菲脅迫下野生大豆幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)雷達(dá)圖Fig.4 Radar plot of fluorescence data in leaves ofGlycine soja to phenanthrene polluted soils

3 結(jié) 論

應(yīng)用快速葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)測定野生大豆響應(yīng)多環(huán)芳烴(菲)脅迫的生理機(jī)制，研究表明： 低濃度土壤菲脅迫(50 mg·kg-1)對野生大豆生長及葉片PSⅡ反應(yīng)中心的影響較小，野生大豆對土壤菲脅迫具有一定的耐受性，但隨著土壤菲含量的繼續(xù)增加，野生大豆葉片中電子傳遞能力的降低，但野生大豆可以通過啟動依賴于葉黃素循環(huán)的非輻射能量耗散機(jī)制和反應(yīng)中心的活性降低的方式來降低土壤菲脅迫下的葉片PSⅡ的光抑制程度，防止PSⅡ反應(yīng)中心的大量失活。 同時，土壤菲脅迫會抑制PSⅡ電子供體側(cè)放氧復(fù)合體OEC的活性，還會降低PSⅡ電子受體側(cè)電子的接受能力而影響電子由QA向QB的傳遞。 另外，土壤菲脅迫還導(dǎo)致了野生大豆葉片光能吸收和分配不平衡，光能分配到電子傳遞的能量比例降低，而用于熱耗散的比例增加，PSⅡ反應(yīng)中心的活性降低。 因此，土壤菲脅迫引起野生大豆葉片電子傳遞速率的降低和光能利用紊亂是引起其光抑制的主要原因。 土壤菲脅迫會抑制PSⅡ電子供體側(cè)放氧復(fù)合體OEC的活性，還會降低PSⅡ電子受體側(cè)的電子的接受能力而影響電子由QA向QB的傳遞。 另外，土壤菲脅迫還導(dǎo)致了野生大豆葉片光能吸收和分配不平衡，光能分配到電子傳遞的能量比例降低，而用于熱耗散的比例增加，PSⅡ反應(yīng)中心的活性降低。 因此，土壤菲脅迫引起野生大豆葉片電子傳遞速率的降低和光能利用紊亂是引起其光抑制的主要原因。 研究證實，快速葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)為廣泛研究于植物響應(yīng)多環(huán)芳烴脅迫的生理機(jī)制提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。