大鼠腹膜源肥大細胞外泌體的分離、培養(yǎng)與鑒定*

王楷， 侯雨君， 廖晨希， 譚玉， 王路， 陳穎， 周思遠

· 實驗技術(shù) ·

大鼠腹膜源肥大細胞外泌體的分離、培養(yǎng)與鑒定*

王楷， 侯雨君， 廖晨希， 譚玉， 王路， 陳穎， 周思遠△

（成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院/第三附屬醫(yī)院，四川 成都 610075）

分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠腹膜源肥大細胞外泌體。提取8～10周齡SPF級雌性SD大鼠腹腔灌洗液，使用Percoll密度梯度分離法分離灌洗液中的肥大細胞，通過甲苯胺藍染色鑒定肥大細胞，在細胞培養(yǎng)板中加入白細胞介素3和干細胞生長因子誘導(dǎo)肥大細胞成熟，收集細胞上清液，采用超速離心法分離上清液中的外泌體，通過透射電鏡，納米流式細胞儀從外泌體形態(tài)、粒徑和表面標志蛋白三個方面鑒定外泌體。分離得到的肥大細胞被甲苯胺藍染成藍紫色，分離的肥大細胞外泌體呈典型盤狀，粒徑分布范圍為30～150 nm，平均粒徑為75.33 nm，外泌體表面標志蛋白CD9和CD81呈陽性表達。Percoll密度梯度分離法聯(lián)合超速離心法分離大鼠腹腔灌洗液中肥大細胞外泌體的方法是可行的。

肥大細胞；外泌體；超速離心

肥大細胞（mast cells， MCs）由骨髓中的CD34+/CD117+前體細胞分化而來，隨血液循環(huán)遷移至外周組織中。MCs主要分布在皮膚、胃腸道和呼吸道等與外界環(huán)境直接接觸的部位。MCs屬于先天免疫細胞，同時參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫，其表型和功能受周圍環(huán)境和生長因子的影響［1］，受到外界刺激時能分泌預(yù)先合成的組胺、蛋白酶及從頭合成的細胞因子和趨化因子等，介導(dǎo)炎癥、免疫和傷害性感覺等生理病理反應(yīng)，同時也能分泌外泌體（exosomes）等微小囊泡。

外泌體是由細胞分泌的磷脂雙分子膜包繞的胞外囊泡，直徑約30～150 nm［2］。幾乎所有細胞在生理及病理狀態(tài)下均可釋放和攝取外泌體。外泌體囊狀結(jié)構(gòu)內(nèi)攜帶的微小RNAs（microRNAs， miRNAs）、信使RNAs（messenger RNAs， mRNAs）、蛋白質(zhì)以及其降解片段，是細胞間以及細胞與鄰近微環(huán)境之間傳遞信息的載體［3］。穩(wěn)定的生物學(xué)特性以及可以攜帶生物信息的特點，使其既具有作為早期診斷依據(jù)的潛力，又有望成為治療的靶點。

肥大細胞也能分泌外泌體，已有研究對骨髓源肥大細胞外泌體［4］和腹腔肥大細胞［5］的提取方法進行報道，這為相關(guān)疾病生理病理的深入研究提供了重要基礎(chǔ)。腹腔灌洗液的細胞學(xué)檢查已經(jīng)在臨床中廣泛應(yīng)用，是研究腹腔相關(guān)臟器病變機制的重要手段。目前尚無研究報道腹膜源肥大細胞外泌體的提取方法，本課題綜合現(xiàn)有肥大細胞和外泌體的提取方法，通過多次實驗，摸索出一種高效可行的大鼠腹膜源肥大細胞外泌體提取方法，以期為相關(guān)研究者提供參考。

材料和方法

1　實驗動物

SPF級雌性SD大鼠［8～10周齡，（220±20） g，10只］，購自成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號為SCXK（川）2020-030，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物房，使用許可證編號SYXK（川）2019-049，自由飲食，溫度（22±2） ℃，濕度50%，晝夜12 h/12 h，所有操作均獲得成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查委員會批準，倫理備案號為2021-15。

2　主要試劑與儀器

D-Hanks溶液購自Solarbio；Percoll細胞分離液購自Biosharp；NaCl購自天津市致遠化工有限公司；無外泌體血清購自TransGen Biotech；超純水（優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：型號UPH-II-10T）；異氟烷購自RWD；紅細胞裂解液購自天根生化科技（北京）有限公司；甲苯胺藍染液購自Sigma；RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone；干細胞生長因子（stem cell growth factor， SCF）重組蛋白購自Genscript；白細胞介素3（interleukin-3， IL-3）重組蛋白購自武漢云克隆科技股份有限公司；PBS購自Sangon Biotech； FITC Mouse IgG購自BioLegend；FITC Mouse Anti-Human CD9和FITC Mouse Anti-Human CD81購自BD；青、鏈霉素混合液購自Gibco。

0.45 μm過濾膜購自Millipore；HT-7700型透射電鏡和CP100MX型超速離心機購自Hitachi；納米流式細胞儀購自NanoFCM（型號N30E）。

3　方法

3.1大鼠腹腔灌洗液收集使用異氟烷與氧氣的混合氣體麻醉大鼠，將大鼠固定于無菌泡沫板上，并且將麻醉機調(diào)至維持劑量面罩維持麻醉，使用紗布蘸取75%乙醇對大鼠的腹部進行消毒，使用無菌手術(shù)剪剪開腹壁劍突至肚臍的上皮，充分暴露腹部肌肉層，用無菌齒鑷提起腹中部暴露的肌肉層，注射器抽取10 mL D-Hanks溶液注射入腹腔內(nèi)。如圖1所示，雙手輕輕振蕩按摩腹部兩側(cè)，持續(xù)1 min，再用齒鑷提起腹部肌肉層，用手術(shù)剪剪開一個小口，使用10 mL無菌注射器從腹腔內(nèi)吸取6 mL以上的灌洗液，注入無菌帶蓋的15 mL離心管內(nèi)，在4 ℃冰箱中臨時貯存，大鼠脫頸處死。

Figure 1.　Intraperitoneal injection of D-Hanks solution. After inhalation of 3% isoflurane with nasal mask to maintain anesthesia， the rats were intraperitoneally injected with 10 mL D-Hanks solution， and the abdomen was massaged for 1 min.

3.2腹膜源肥大細胞分離及上清液收集稱取0.85 g NaCl與10 mL超純水充分混合，得到濃度為8.5%的NaCl溶液，再將8.5%的NaCl溶液溶液10倍稀釋為0.85% NaCl溶液；預(yù)先配制具有生理性滲透壓的100% Percoll原液：按照9體積Percoll分離液與1體積的8.5％ NaCl溶液進行充分混合；再用0.85％ NaCl溶液稀釋成75%和70%的Percoll分離液；取2 mL的75% Percoll分離液和2 mL的70% Percoll分離液分別依次沿離心管壁加入；將腹腔灌洗液樣品于225×離心5 min，棄去上清，加入1 mL PBS重懸；將分離得到的細胞懸液沿管壁緩慢加入上述Percoll分離液中；然后放入離心機中，501×離心20 min；吸取位于75%和70% Percoll分離液之間的呈乳白色的細胞于1.5 mL EP管中，300×離心5 min，棄上清，吸取500 μL紅細胞裂解液（過濾除菌）于EP管中，重懸細胞，靜置約3 min后，306×離心5 min，棄去上清，以去除紅細胞；加入1 mL PBS于EP管中，通過無菌移液器反復(fù)吹打混勻以洗滌細胞；將20 μL甲苯胺藍染液加入20 μL細胞懸液，充分混勻染色2 min，鑒定肥大細胞；剩余的細胞懸液306×離心5 min，棄上清，加入1 mL由血清和DMSO按體積9∶1配制的凍存液，移液器吹打混勻后使用凍存管存放于-80 ℃冰箱。取肥大細胞常規(guī)復(fù)蘇，添加含10%無外泌體血清、10 μg/L IL-3和20 μg/L SCF的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長密度約90%時，收集細胞上清（共收集約50 mL），使用4 ℃、2 000×離心10 min，目的是去除細胞碎片用于提取外泌體。

3.3肥大細胞上清液外泌體分離將上述收集的細胞上清液放入37 ℃水浴鍋中速融，然后將樣品移至一個新的離心管內(nèi)4 ℃、2 000 ×離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，4 ℃、10 000×再次離心45 min，該步驟是為了去掉較大的細胞外囊泡；取上清，使用過濾膜（孔徑0.45 μm）進行過濾，回收濾液；將過濾后的液體裝入新的離心管中，改用超速離心機，4 ℃、100 000×離心70 min，去除上清；用10 mL預(yù)冷的1×PBS洗滌后，4 ℃、100 000×再次離心70 min；去除上清，再次用100 μL預(yù)冷的1×PBS重懸即為所要提取的外泌體。取10 μL外泌體用于外泌體形態(tài)觀察，10 μL用于外泌體粒徑檢測，20 μL用于外泌體表面標志蛋白分析，剩余的外泌體置于-80 ℃冰箱保存。

4　外泌體鑒定

4.1外泌體形態(tài)觀察使用Hitachi透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。使用移液器吸取上述提取的外泌體樣品10 μL小心滴入電鏡銅網(wǎng)，經(jīng)過1 min沉淀后，使用濾紙輕輕吸去銅網(wǎng)邊緣的液體，再向銅網(wǎng)內(nèi)滴加10 μL醋酸雙氧鈾，同樣沉淀1 min，吸干銅網(wǎng)邊緣多余的浮液，在室溫下自然風干數(shù)分鐘，選擇100 kV進行電鏡拍照，獲得外泌體形態(tài)檢測結(jié)果。

4.2外泌體粒徑分析使用NanoFCM納米流式檢測儀分析外泌體粒徑。將外泌體樣品取出10 μL稀釋到30 μL，檢測前按照說明書先用標準品測試儀器性能，外泌體樣品上機必須在儀器檢測合格后方可進行，注意上樣需根據(jù)說明書進行梯度稀釋，以免造成進樣針堵塞，待自動檢測完成后即可獲得外泌體的粒徑和濃度檢測結(jié)果。

4.3外泌體表面標志蛋白檢測使用納米流式檢測儀評估外泌體表面標志蛋白濃度。將20 μL外泌體稀釋至90 μL，取30 μL稀釋外泌體分別與20 μL熒光標記的CD9、CD81和IgG抗體混合均勻，在無光環(huán)境中37 ℃孵育30 min，加入1 mL預(yù)冷的PBS，選擇超速轉(zhuǎn)子，4 ℃、110 000×超速離心70 min，小心去除上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS，選擇超速轉(zhuǎn)子，再次4 ℃、110 000×超速離心70 min，小心去除上清，用50 μL預(yù)冷的1×PBS重懸，同樣需提前用標準品校正儀器，測試合格后方可上樣，注意需進行梯度稀釋以免造成進樣針堵塞，待樣本完成檢測即可獲得儀器檢測蛋白指標結(jié)果。

結(jié)果

1　大鼠腹膜源肥大細胞分離染色鑒定結(jié)果

使用Percoll密度梯度分離到的腹膜源肥大細胞呈白色云霧狀，如圖2所示。經(jīng)甲苯胺藍染色的肥大細胞呈藍紫色，形態(tài)多呈圓形、橢圓形，如圖3所示。復(fù)蘇肥大細胞，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后，如圖4所示，可見細胞布滿細胞培養(yǎng)板。

Figure 2.　Mast cells were isolated by Percoll density gradient separation.

Figure 3.　Mast cells isolated were identified by toluidine blue staining.

Figure 4.　Post-recovery mast cell culture for 14 d. Mast cells covered almost the entire cell culture plate.

2　外泌體鑒定結(jié)果

透射電鏡下觀察到外泌體呈邊緣厚，中心薄的圓盤狀，大小不一，邊界清稀，結(jié)構(gòu)完整，如圖5A所示。外泌體的直徑分布主要位于30～150 nm之間，平均粒徑為75.33 nm，如圖5B所示。外泌體表面表達標志蛋白CD9和CD81表達陽性，而同型對照IgG為陰性，如圖5C所示。

Figure 5.　Identification of exosomes secreted by peritoneal mast cells. A： the exosomes observed under transmission electron microscope； B： particle size distribution was detected by nano-flow cytometry （NanoFCM）； C： exosome-specific markers CD81 and CD9 were determined by NanoFCM. Red particles represent positivity.

討論

本研究描述了一種成年SD大鼠的腹膜源肥大細胞外泌體提取方案，結(jié)果表明應(yīng)用Percoll密度梯度分離法分離SPF級大鼠腹腔灌洗液中的肥大細胞聯(lián)合超速離心法分離肥大細胞上清液中外泌體的方法是可行的。所獲得的肥大細胞外泌體表現(xiàn)出典型特征，如杯盤狀，表面標志蛋白CD9和CD81陽性等。大量文獻多是研究對皮膚源［6］、骨髓源和腹膜源［7］肥大細胞的分離培養(yǎng)，或是對血液、尿液［8］和永生細胞［9］等外泌體進行提取，但是關(guān)于腹膜源肥大細胞分泌的外泌體研究甚少。本研究利用Percoll密度梯度離心，并采用細胞生長因子IL-3和SCF聯(lián)合培養(yǎng)得到純度較高的原代腹膜來源的肥大細胞，對收集的細胞上清液使用超速離心法分離外泌體，為后續(xù)研究肥大細胞外泌體在疾病中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

Percoll是一種硅膠顆粒混懸液，對細胞無毒性，可根據(jù)肥大細胞的密度（1.09～1.17）×103g/L調(diào)節(jié)分離液密度［10］，既能保護細胞生物活性又可提取到高純度細胞。值得注意的是，在本實驗提取過程中關(guān)鍵的步驟是吸取腹腔灌洗液時，要盡可能避免樣本的血液污染并盡量吸入最大量的灌洗液，這對于獲得大量高純度的腹膜源肥大細胞至關(guān)重要。

外泌體的分離方法主要包含超速離心、體積排阻色譜法、過濾法、免疫分離、隔離篩選法及密度梯度離心等，其中超速離心法是外泌體分離的金標準。研究證實超速離心法分離外泌體純度高、回收率高，同時最大限度減少蛋白質(zhì)聚集體和其他膜粒子的共純化，有利于保護外泌體的功能，這對后續(xù)進行外泌體相關(guān)的研究至關(guān)重要。對提取到的外泌體鑒定方法一般從三個方面進行，即外泌體形態(tài)觀察、粒徑分析和標志蛋白檢測。NanoFCM是從單顆粒水平檢測粒徑分布、濃度和熒光分析［11］。在檢測外泌體的粒徑方面，NanoFCM的分辨率較納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis， NTA）方法更高，所檢測的直徑范圍更廣，能夠覆蓋完整的外泌體粒徑范圍，這使檢測結(jié)果更精確。在檢測外泌體蛋白標志物方面，NanoFCM與常用的Western blot相比，不僅可以從單顆粒水平對外泌體進行精確計數(shù)，還能對蛋白標志物進行雙熒光標記。

綜上所述，本研究通過Percoll密度梯度分離法聯(lián)合超速離心法提取大鼠腹膜源肥大細胞外泌體，并對所提取到的外泌體進行形態(tài)學(xué)及生物學(xué)兩個方面進行驗證，為進一步研究腹膜源肥大細胞外泌體相關(guān)功能奠定基礎(chǔ)。

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Isolation, culture and identification of mast cell exosomes from rat peritoneum

WANG Kai， HOU Yu-jun， LIAO Chen-xi， TAN Yu， WANG Lu， CHEN Ying， ZHOU Si-yuan△

（，，610075，）

Isolation， culture and identification of mast cell exosomes.Peritoneal lavage fluid was extracted from 8-to-10-week-old female SD rats. The mast cells were isolated by Percoll density gradient separation method. Interleukin-3 and stem cell growth factor were added to induce mast cell maturation. Mast cells were identified by toluidine blue staining. Mast cell supernatant was collected， and exosomes were separated by high-speed low-temperature centrifugation. Transmission electron microscopy， particle size analysis and flow cytometry were used to detect the shape， diameter and marker protein of exosomes， respectively.Isolated mast cells were stained blue-purple with toluidine blue. The particle size distribution range was 30 to 150 nm， the average particle size was 75.33 nm. Expression of exosomal surface marker proteins CD9 and CD81 were detected.The complete mast cell exosomes were successfully isolated from the rat abdominal cavity.

Mast cells； Exosomes； Ultracentrifugation

R33-33； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.024

1000-4718（2022）06-1148-05

2021-12-29

2022-04-12

國家自然科學(xué)基金資助項目（No. 82074558）

Tel： 028-87689918； E-mail： zsy@cdutcm.edu.cn

（責任編輯：宋延君，李淑媛）