單氰胺水劑高效液相色譜分析方法研究

付萍萍，姜軍俠，王玉萍，王素琴

(陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測中心，陜西 西安 710003)

1 前言

單氰胺化學(xué)名稱為氰基胺[1]，原藥為無色吸濕晶體，熔點(diǎn)為45℃～46℃[2]。該產(chǎn)品屬于植物休眠中止劑，通過刺激植物體內(nèi)過氧化氫酶的活性，加速植物體內(nèi)氧化磷酸戊糖循環(huán)，從而加速了對代謝最為基礎(chǔ)的脫氧核糖核酸的生成，導(dǎo)致植物體休眠終止，刺激植物發(fā)芽、調(diào)節(jié)植物生長[1]。本文采用高效液相色譜法，通過對不同流動相的選擇，克服了單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品稱取困難，樣品檢測過程中單氰胺含量偏高等問題。該方法操作簡便、快速，分離效果和穩(wěn)定性好，且準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到定量分析的要求，可作為企業(yè)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制和質(zhì)檢機(jī)構(gòu)質(zhì)量檢測的參考方法。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 甲醇：色譜純；氨水溶液：分析純；水：超純水； 單氰胺標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ω≥98.5%；單氰胺50%水劑。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1 260，具有二極管陣列檢測器和自動進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站；Millipore超純水制備系統(tǒng)；色譜柱：250mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C18；恒溫水浴鍋。

2.3 液相色譜操作條件 流動相：Ψ(甲醇 ： 水 ： 氨水)=5 ： 95 ： 0.3，經(jīng)濾膜過濾，并進(jìn)行脫氣；流量：0.7mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：220nm；進(jìn)樣體積：5μL；保留時(shí)間：單氰胺約2.9min。

上述液相色譜操作條件，系典型操作參數(shù)，可根據(jù)不同儀器特點(diǎn)，對給定的操作參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整，以期獲得最佳效果。典型的單氰胺的標(biāo)樣、樣品色譜圖(圖1、圖2)。

圖1 單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖(1—單氰胺 2—雙氰胺)

圖2 50%單氰胺水劑試樣液相色譜圖(1—單氰胺 2—雙氰胺)

2.4 測定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 將單氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于50±2 ℃水浴中加熱到完全轉(zhuǎn)化成液體狀態(tài)，迅速稱取0.05g(精確至0.000 1g)單氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50mL容量瓶中，加入20mL水，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度并搖勻。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取含0.05g(精確至0.000 1g)單氰胺的試樣于50mL容量瓶中，加入20mL水，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾。

2.4.3 測定 在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，各針相對響應(yīng)值變化<1.5%時(shí)，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)樣測定。

2.4.4 計(jì)算 將測得的2針試樣溶液及試樣溶液前后2針標(biāo)樣溶液中單氰胺的峰面積分別進(jìn)行平均，按下式計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)：

式中：

A2—試樣溶液中單氰胺峰面積的平均值；

m1—標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

ω—標(biāo)樣中單氰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

A1—標(biāo)樣溶液中單氰胺峰面積的平均值；

m2—試樣的質(zhì)量，g。

3 結(jié)果分析

3.1 色譜條件選擇 色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根據(jù)單氰胺物化性質(zhì)、溶劑的紫外吸收波長，選擇水作為溶劑溶解樣品。首先選擇Ψ(甲醇：3%氨水溶液)=5：95(用磷酸調(diào)pH值到6.5左右)流動相，用磷酸調(diào)pH值，單氰胺有效成分不能有效分離出來，所測水劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高；其次選擇Ψ(甲醇：2mmoL/L乙酸銨水溶液)=5：95，單氰胺有效成分不能有效分離出來，所測水劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然偏高(圖3)；然后選擇Ψ(甲醇：水：氨水)=5 ： 95 ： 0.3作為流動相，可以將樣品中的單氰胺和雙氰胺有效分離(圖2)，這時(shí)候雙氰胺在樣品中的干擾已消除，單氰胺質(zhì)量合格，峰純度達(dá)標(biāo)。

圖3 50%單氰胺水劑試樣液相色譜圖(單氰胺與雙氰胺未分開)

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 單氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是白色結(jié)晶狀固體，易吸潮結(jié)塊，稱取困難。根據(jù)單氰胺的熔點(diǎn)低的特點(diǎn)(熔點(diǎn)45℃)，選擇在50±2 ℃水浴中加熱至標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)完全轉(zhuǎn)化為液體，迅速稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

圖4 單氰胺的紫外光譜圖

3.3 檢測波長的選擇 單氰胺的紫外光譜圖(圖4)，從圖中可以看到單氰胺的最大吸收波長約在210nm處，在該波長處溶劑干擾較大，故將檢測波長確定為220nm，干擾少，靈敏度也能夠滿足分析的要求。

3.4 分析方法的線性相關(guān)性試驗(yàn) 按標(biāo)樣溶液的制備方法配制(499～179 7mg/L)5個(gè)不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照STD1至STD5的順序測定每個(gè)溶液中單氰胺的峰面積，取2次測定的平均結(jié)果。以單氰胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)為Y=2.632 8x+87.364，r=0.999 9，(圖5)。

圖5 單氰胺線性關(guān)系圖

3.5 分析方法的精密度試驗(yàn) 按上述色譜操作條件對同一樣品平行5次進(jìn)行測定，測得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.043；變異系數(shù)為0.089%。(表1)。

3.6 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 從已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品中稱取5個(gè)試樣，分別加入一定量的單氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測得單氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均回收率為100.93% (表2)。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3.7 方法特異性 本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別單氰胺。單氰胺標(biāo)樣、50%單氰胺水劑中的單氰胺HPLC-DAD峰純度均>990，有效成分處無其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度(圖6、圖7)。

圖6 單氰胺標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖7 單氰胺水劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

4 結(jié)論

綜上，本文建立的HPLC分析方法，保留時(shí)間合理，精密度與準(zhǔn)確度較高，可快速分離測定樣品中單氰胺和雙氰胺兩種成分，且單氰胺線性關(guān)系性好，符合農(nóng)藥產(chǎn)品的質(zhì)量分析要求，對于保證50%單氰胺水劑產(chǎn)品質(zhì)量，維護(hù)消費(fèi)者的利益起到作用。