劍麻葉片纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)差異分析

黃顯雅 覃 旭 楊祥燕 李菊馨 彭欣怡 吳 密 金 剛 陳 濤

（廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，530001，廣西南寧）

劍麻（Agave sisalana）為龍舌蘭科龍舌蘭屬多年生草本植物，是重要的硬質(zhì)葉纖維作物。我國劍麻種植始于20世紀(jì)50年代初，據(jù)國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)墾局統(tǒng)計，2019年我國劍麻種植面積1.87萬hm2，纖維產(chǎn)量7.23萬t，總產(chǎn)值達6.48億元[1]，是我國熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物之一。與其他植物纖維相比，劍麻纖維具有纖維長、質(zhì)地硬、耐腐蝕、耐摩擦和拉力大等特點，在漁業(yè)、航海和工礦等領(lǐng)域都表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢和潛力。近年來，隨著世界資源危機日益嚴(yán)重，人類環(huán)保意識增強，天然可再生纖維資源越來越受重視，劍麻纖維產(chǎn)業(yè)將迎來更廣闊的利用空間。早期人們認(rèn)為栽培技術(shù)是影響纖維品質(zhì)的關(guān)鍵因素，但隨著對植物纖維細(xì)胞發(fā)育研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)從纖維發(fā)育生理學(xué)角度探索和提高植物纖維產(chǎn)量和質(zhì)量，才是進一步改進和完善現(xiàn)有栽培技術(shù)的關(guān)鍵[2]。此后人們逐漸從探索各種自然條件和栽培措施對植物纖維產(chǎn)量的影響，轉(zhuǎn)到深入研究植物纖維的生長發(fā)育規(guī)律及其影響因素。劍麻纖維在葉片中呈帶狀排布[3]。有報道[4-5]指出，劍麻纖維束是由多個不含原生質(zhì)體的細(xì)胞以“Steiner樹狀結(jié)構(gòu)”相連的中空微纖維構(gòu)成。高洸等[6]在觀察劍麻纖維結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，劍麻纖維次生壁外層（S1）原纖的排列走向與次生壁中層（S2）不同，S2與次生壁內(nèi)層（S3）的原纖排列走向也不同，說明劍麻纖維的形成是一個動態(tài)過程。劍麻纖維細(xì)胞的研究較棉花和竹子等作物滯后，目前關(guān)于劍麻纖維細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征的研究鮮見報道，這制約了劍麻纖維發(fā)育細(xì)胞機制研究的進程。透射電鏡（TEM）分辨率高，可直觀地展示生物細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)和亞顯微結(jié)構(gòu)，常應(yīng)用于觀察植物組織的超微結(jié)構(gòu)，研究植物生命過程中細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的特點與生理功能關(guān)系[7]。本研究運用透射電鏡技術(shù)觀察分析劍麻葉片纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，及確定用于研究纖維細(xì)胞發(fā)育研究的取樣部位，為劍麻纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征和發(fā)育規(guī)律等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)性和實驗性的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

劍麻H.11648取自廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所南寧劍麻試驗站劍麻種植示范基地。選取定植苗（大田定植1年的劍麻種苗）和3刀麻（開割3年的劍麻）的葉片為研究對象[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 確定劍麻葉片取樣部位 標(biāo)準(zhǔn)化種植的劍麻定植苗和3刀麻的單葉長度可分別達到60和120cm，單株葉片量分別約20和100片，為確定用于纖維細(xì)胞形態(tài)觀察的理想部位，需將其進行劃分后再進行采樣觀察分析，具體劃分方法見表1，示意圖見圖1。

表1 劍麻葉片劃分和成熟度定義取樣劃分Table 1 The division and maturity definition sampling division of sisal leaves

圖1 劍麻葉片劃分示意圖Fig.1 Sketch of sisal leaf division

1.2.2 取樣 劍麻葉片不同部位纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異：以定植苗和3刀麻的成熟葉為研究對象，分別取葉片中部和近軸端；劍麻不同成熟階段葉片纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異：以3刀麻為研究對象，分別取成熟葉、幼年葉和稚嫩葉的葉片近軸端。取葉片中心部分，割成0.5cm×0.5cm大小的組織塊，迅速置于預(yù)冷的3%戊二醛固定液中，并用真空泵抽氣至樣品完全沉入固定液里，進行透射電鏡觀察。

1.2.3 透射電鏡觀察 將劍麻葉片樣品置于1%四氧化鋨中進行再固定，然后經(jīng)過丙酮逐級脫水，脫水劑濃度梯度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100%濃度換3次）。將脫水后的樣品用環(huán)氧樹脂進行包埋。將滲透好的樣品塊放到適當(dāng)模具中，灌上包埋液經(jīng)過加溫聚合形成固體包埋塊。采用超薄切片機（徠卡）將包埋塊切割成約50nm的超薄切片，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網(wǎng)。分別用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，室溫條件下染色15～20min。最后用JEM-1400PLUS透射電鏡（日本）進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 劍麻葉片不同部位纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)差異

電鏡下可觀察定植苗葉片近軸端（圖2a）細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞胞漿中各細(xì)胞器均勻分布，細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)完整清晰。3刀麻葉片近軸端（圖2b）細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整清晰，與定植苗（圖2a）相比細(xì)胞體積大，各種細(xì)胞器數(shù)量變少并被液泡擠壓到細(xì)胞邊緣。而電鏡下劍麻定植苗和3刀麻的葉片中部（圖2c、d）大部分是不含細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞壁，只能觀察到少量存在原生質(zhì)體的細(xì)胞。由觀察結(jié)果可知，與葉片中部區(qū)域的纖維細(xì)胞相比，近軸端的纖維細(xì)胞更具有 發(fā)育活力。

圖2 劍麻定植苗和3刀麻的成熟葉片近軸端和中部的纖維束細(xì)胞透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy of fiber bundle cells in the proximal end and middle of mature leaves of young and three knife sisal

2.2 劍麻不同成熟階段葉片纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)差異

進一步觀察了3刀麻不同成熟階段的葉片束纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特點，發(fā)現(xiàn)不論葉片發(fā)育程度如何，在近軸端均能觀察到含有完整原生質(zhì)體的活纖維細(xì)胞（圖3）。由圖3可知，3個葉片成熟階段的葉束纖維細(xì)胞中各種細(xì)胞器被液泡擠壓到細(xì)胞的邊緣，其中葉綠體是最突出的細(xì)胞器，有少量嗜鋨顆粒分布于葉綠體表面。成熟葉（圖3a～c）和幼年葉（圖3d～f）的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整清晰，內(nèi)部細(xì)胞器均貼壁分布，細(xì)胞核以常染色質(zhì)為主，葉綠體多呈梭形，外膜完整，可見較清晰的片層結(jié)構(gòu)和垛疊區(qū)，在成熟葉（圖3c）和幼年葉（圖3f）中還分別觀察到葉綠體膨脹變圓、細(xì)胞膜不連續(xù)和存在空泡的現(xiàn)象。與其他成熟階段相比，稚嫩葉（圖3g～i）細(xì)胞內(nèi)葉綠體出現(xiàn)皺縮及片層結(jié)構(gòu)排列較紊亂、線粒體腫脹、胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡（圖3g）、細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多（圖3h）和質(zhì)壁分離（圖3i）的現(xiàn)象。

圖3 不同成熟階段的劍麻葉片束纖維細(xì)胞透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy of fiber bundle cells at different ripeness stages of sisal leaves

3 討論

植物細(xì)胞發(fā)育是一個典型的細(xì)胞程序性死亡過程[9]，植物纖維細(xì)胞發(fā)育大致分成原始纖維細(xì)胞形成期、細(xì)胞伸長期、細(xì)胞初生壁形成期和細(xì)胞次生壁形成、增厚期[10-11]，雖然相鄰時期之間并沒有截然區(qū)分的界線且有所重疊[12]，但每個時期的纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)都各有特點。早期的植物纖維細(xì)胞發(fā)育研究報道[13-14]指出，棉花的纖維細(xì)胞分化過程中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中會出現(xiàn)密集的電子物質(zhì)，推測暗細(xì)胞可能是正在分化的纖維原始細(xì)胞，亮細(xì)胞則是非纖維原始細(xì)胞，但是竹子等多細(xì)胞纖維作物的纖維細(xì)胞起源尚不明確。當(dāng)纖維細(xì)胞分化完成后，細(xì)胞會在液泡的作用下經(jīng)歷非極性伸長（膨脹伸長）和極性伸長[15-16]，同時伴隨著細(xì)胞壁的形成。初生壁形成初期細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細(xì)胞器的數(shù)量都顯著增多，在液泡的持續(xù)擠壓下，細(xì)胞器被擠壓到細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)，此時細(xì)胞質(zhì)變得稀薄，透光性增強，細(xì)胞壁開始累積木質(zhì)素進入次生細(xì)胞壁形成和增厚階段[17-19]，并啟動程序性死亡，且原生質(zhì)體開始降解[20]。

本研究分別取2個生長時期的不同葉片區(qū)域（中部、近軸端）和3個成熟度葉片（稚嫩葉、幼年葉、成熟葉）的組織作為樣品，利用TEM觀察組織的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果顯示，葉片中部區(qū)域的細(xì)胞多為不含原生質(zhì)體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，表明葉片中部的纖維細(xì)胞多處于發(fā)育成熟階段，不宜作為研究劍麻葉片纖維細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)形態(tài)差異的對象；而葉片近軸端的纖維細(xì)胞胞漿中能觀察到細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，且細(xì)胞器被液泡擠壓到細(xì)胞壁的邊緣等，在其他作物表現(xiàn)為纖維細(xì)胞伸長期或纖維細(xì)胞初生壁形成期的特征形態(tài)，表明近軸端存在處于發(fā)育階段的纖維細(xì)胞。在稚嫩葉近軸端細(xì)胞還觀察到葉綠體皺縮及片層結(jié)構(gòu)排列較紊亂，線粒體腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，還存在細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多和質(zhì)壁分離等細(xì)胞凋亡的特征，說明稚嫩葉中有處于次生壁增厚期的纖維細(xì)胞。

4 結(jié)論

綜合觀察結(jié)果可知，劍麻葉片中部的纖維細(xì)胞多為不含原生質(zhì)體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，表明該區(qū)域的纖維細(xì)胞處于發(fā)育成熟階段，不具備觀察細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)特點的條件。進一步觀察不同成熟度的劍麻葉片近軸端的纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)存在大量含有完整原生質(zhì)體的活細(xì)胞，且能觀察到細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多和質(zhì)壁分離等細(xì)胞凋亡的特征，表明該區(qū)域的纖維細(xì)胞仍有生長發(fā)育能力，具備觀察葉纖維細(xì)胞發(fā)育細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異的條件，是觀察的理想取樣部位。值得注意的是，稚嫩葉中能同時觀察到處于初生細(xì)胞壁形成期和次生細(xì)胞壁形成期的纖維細(xì)胞，但是纖維細(xì)胞發(fā)育活躍程度與葉片成熟程度之間的關(guān)系還需進一步研究確認(rèn)。