肝豆?fàn)詈俗冃曰颊逨BN1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性研究

肝豆?fàn)詈俗冃杂址Q威爾遜氏病，是銅的轉(zhuǎn)運(yùn)基因ATP7B發(fā)生突變導(dǎo)致銅的轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄出現(xiàn)障礙，進(jìn)而造成的一種常染色體隱性遺傳性疾病

。肝豆?fàn)詈俗冃缘闹饕R床表現(xiàn)為肝損傷及神經(jīng)系統(tǒng)損傷，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，同時(shí)對(duì)生命安全也造成一定的威脅

。原纖維蛋白-1(fibrillin-1，F(xiàn)BN1)基因編碼的FBN1蛋白是微原纖維的主要成分，它是一種結(jié)構(gòu)蛋白，與纖維化程度有關(guān)

。而肝纖維化幾乎是所有肝豆?fàn)詈俗冃曰颊吒闻K的主要病理改變，推測(cè)FBN1可能與肝豆?fàn)詈俗冃缘牟±砀淖冇嘘P(guān)

。雖然FBN1基因甲基化在癌癥中的研究較多

，但關(guān)于FBN1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與肝豆?fàn)詈俗冃蚤g的關(guān)系仍需進(jìn)一步探究。因此，本研究通過探討FBN1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與肝豆?fàn)詈俗冃曰颊吲R床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床診斷及治療提供新靶點(diǎn)和依據(jù)。

1 資料與方法

選取重慶市黔江中心醫(yī)院和四川大學(xué)華西醫(yī)院2013年2月至2016年2月收治的79例肝豆?fàn)詈俗冃曰颊吒尾∽兘M織為研究對(duì)象(肝豆?fàn)詈俗冃越M)，年齡(45.28±13.46)歲(20～76歲)，男47例，女32例。選取其肝臟正常組織作為正常對(duì)照組。另收集患者肝豆?fàn)詈俗冃约易迨?、病程及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)、尿銅(urine copper，u-Cu)水平等基線資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)影像學(xué)檢查、臨床特征及組織病理證實(shí)確診為肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?，符合肝豆?fàn)詈俗冃栽\斷標(biāo)準(zhǔn)

；(2)病歷資料齊全者；(3)患者均自愿參加并簽署知情同意書；(4)術(shù)前未接受過其他輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤者；(2)有嚴(yán)重精神障礙者；(3)妊娠期或哺乳期婦女；(4)伴有其他肝臟疾病者。本研究經(jīng)重慶市黔江中心醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：Lw2012011)。

優(yōu)先選取連接鄉(xiāng)、鎮(zhèn)、大村莊之間的道路，通往高等級(jí)道路、車站、碼頭、礦山的道路，作為行政界線的道路，穿越國(guó)境線的道路以及連接水源的道路。一般應(yīng)使鄉(xiāng)鎮(zhèn)級(jí)居民地有道路通往、居民地與主要地物之間均有道路連接。兩居民地之間有數(shù)條道路相連接時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選取等級(jí)較高、距離較短的道路[2]。

PCR儀(型號(hào)：MA-1600)購(gòu)自中國(guó)雅睿生物。CpGenome DNA Modification Kit(貨號(hào)：XY-S7821)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司；DNA抽提試劑盒(貨號(hào)：JL1545)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；DAB顯色試劑盒(貨號(hào)：DA1010)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；FBN1抗體(貨號(hào)：ATA29131)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；PTG19-T載體(貨號(hào)：SWFZ022)購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；XL-10 Gold感受態(tài)細(xì)胞(貨號(hào)：CM-6013K)購(gòu)自上海淳麥生物科技有限公司。

肝豆?fàn)詈俗冃越MFBN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(70.89%)顯著高于正常對(duì)照組(13.92%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0.05)(見表3、圖2)。

研究區(qū)15年來年均RUE總體呈下降趨勢(shì)，年均下降 0.000 1。RUE最高值出現(xiàn)在 2002年，為0.016 18，最低值出現(xiàn)在2012年。從各縣來看，除若爾蓋縣以外，其他各縣最高值均出現(xiàn)在2002年。由表1可以得到，各縣RUE線性趨勢(shì)均為負(fù)值，其中石渠縣RUE下降最快，為研究區(qū)平均下降速度的兩倍，壤塘縣與甘孜縣下降速度最慢，其他4個(gè)縣下降速度近于研究區(qū)RUE下降的速度。

1.3.3 FBN1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織FBN1蛋白表達(dá)水平，常規(guī)操作(一抗為FBN1抗體)后采取半定量法進(jìn)行評(píng)分

。雙盲法進(jìn)行結(jié)果判定，隨機(jī)選10個(gè)高倍鏡視野(200倍)觀察，取每個(gè)標(biāo)本兩次觀察評(píng)分的平均值。首先按染色強(qiáng)度計(jì)分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無色為0分；之后按陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≥76%、51%～75%、26%～50%、6%～25%、≤5%分別判定為4、3、2、1、0分。上述兩種得分相乘，總分<4分為陰性(-)，≥4分為陽(yáng)性(+)。

肝移植手術(shù)后5年內(nèi)采用電話、入戶和門診等方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后第1～3年平均每3～6個(gè)月隨訪1次，之后每半年隨訪1次。其生存期從手術(shù)之日起計(jì)算。

1.3.1 樣品采集及保存：采集患者肝移植術(shù)中病變肝組織及其肝臟正常組織，部分置于-80 ℃保存；部分經(jīng)10%甲醛固定后，進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。肝豆?fàn)詈俗冃曰颊吒闻K病理表現(xiàn)：早期肝細(xì)胞呈小、大泡混合性脂變，肝小葉未見明顯炎癥(見圖1)。

1.3.2 FBN1基因甲基化測(cè)定：DNA抽提試劑盒提取受試者肝組織基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度后-20 ℃保存。采用亞硫酸氫鈉修飾試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，75 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系：模板DNA(50 ng/μl)2 μl，2×PCR Mix 25 μl，ddH

O 21 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl。目標(biāo)片段割膠回收后連接，PTG19-T做載體，采用XL-10 Gold感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、涂板，酶切法鑒定陽(yáng)性菌落，測(cè)序后甲基化數(shù)據(jù)用BIQ Analyzer軟件分析和整理。FBN1甲基化與非甲基化引物序列如表1所示，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

與此同時(shí)，還不斷加大了全縣77個(gè)探礦權(quán)的科學(xué)規(guī)范管理，與河南省地質(zhì)調(diào)查院等22個(gè)地勘單位建立了合作關(guān)系。全縣不僅又探明鉬金屬233萬(wàn)t，而且還新探明白鎢59萬(wàn)t，鉛鋅126萬(wàn)t，黃金74萬(wàn)t，為本縣的礦產(chǎn)資源可持續(xù)發(fā)展提供了充分的資源保障。

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)/%表示，組間比較行

檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析肝豆?fàn)詈俗冃曰颊逨BN1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系，采用Log-rank進(jìn)行生存曲線顯著性檢驗(yàn)，以

=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)；采用多因素Cox回歸分析影響肝豆?fàn)詈俗冃曰颊哳A(yù)后的因素。

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

隨訪5年，79例肝豆?fàn)詈俗冃曰颊咧兴劳?8例、生存61例。用Kaplan-Meier法分析FBN1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?年生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示FBN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?年生存率(69.64%)低于FBN1蛋白陰性表達(dá)患者(95.65%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

=6.269，

<0.05)；FBN1基因甲基化肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?年生存率(95.24%)高于FBN1基因非甲基化患者(70.69%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

=5.281，

<0.05)(見圖3～4)。

5.并購(gòu)價(jià)值的效應(yīng)體現(xiàn)。一個(gè)是效益效應(yīng)，據(jù)某些資料顯示，對(duì)于雙方融資成立的新公司，首次融資已經(jīng)超33億元，融資后公司的估值可超180億元，這是全球范圍最大的私募融資之一，這有利于新企業(yè)在未來的時(shí)間內(nèi)上市。兩家的合并重構(gòu)使得用戶數(shù)量急劇上升，覆蓋的群體范圍以及地域范圍也擴(kuò)大。新公司覆蓋了超過2800個(gè)縣、市、區(qū)，日訂單量突破1000萬(wàn)單，移動(dòng)端月度活躍用戶超1.5 億人，年購(gòu)買用戶近2億人，2015年總交易額超過1700億元人民幣。另一個(gè)是戰(zhàn)略效應(yīng)，對(duì)于企業(yè)來說，拿下O2O市場(chǎng)，就有在互聯(lián)網(wǎng)領(lǐng)域的主動(dòng)權(quán)，未來發(fā)展的潛力不可限量，美團(tuán)與大眾點(diǎn)評(píng)的戰(zhàn)略整合，兩家企業(yè)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有利于公司的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。

根據(jù)肝豆?fàn)詈俗冃曰颊逨BN1基因甲基化及其蛋白表達(dá)情況，將其分為FBN1非甲基化組58例，F(xiàn)BN1甲基化組21例；FBN1蛋白陰性組23例，F(xiàn)BN1蛋白陽(yáng)性組56例。FBN1基因甲基化及蛋白表達(dá)與性別、病程及AST、ALT水平無相關(guān)性(

>0.05)；FBN1基因甲基化及蛋白表達(dá)與年齡、肝豆?fàn)詈俗冃约易迨芬约癈P、u-Cu水平有相關(guān)性(

<0.05)(見表4)。

肝豆?fàn)詈俗冃越MFBN1基因甲基化率(26.58%)顯著低于正常對(duì)照組(63.29%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0.05)(見表2)。

將肝豆?fàn)詈俗冃曰颊呤欠癜l(fā)生死亡作為因變量，以患者FBN1基因甲基化、FBN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)、年齡、肝豆?fàn)詈俗冃约易迨贰P、u-Cu為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)BN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)是影響肝豆?fàn)詈俗冃曰颊咚劳龅莫?dú)立危險(xiǎn)因素(

<0.05)，F(xiàn)BN1基因甲基化是影響肝豆?fàn)詈俗冃曰颊咚劳龅谋Ｗo(hù)因素(

<0.05)(見表5)。

3 討論

肝豆?fàn)詈俗冃耘R床癥狀差異較大，無法通過任何一項(xiàng)或幾項(xiàng)指標(biāo)確診或排除，極易出現(xiàn)誤診、漏診等

。肝豆?fàn)詈俗冃曰颊唧w內(nèi)銅排泄出現(xiàn)障礙，在腦、腎、肝等器官處蓄積同時(shí)導(dǎo)致相應(yīng)病變，進(jìn)而造成患者病情加重，治療效果較差

。近年來分子生物醫(yī)學(xué)快速發(fā)展，然而目前關(guān)于肝豆?fàn)詈俗冃陨飿?biāo)志物的研究較少。因此，尋找切實(shí)有效的肝豆?fàn)詈俗冃陨飿?biāo)志物顯得尤為重要。

蘭江大橋高高地矗立著。蔣大偉把車開到路邊，兩人仰頭看著大橋。橋上，車輛在不停地穿梭流動(dòng)。蔣大偉低聲地：這就是蘭江大橋！鄭馨默默看著大橋，沒有說話。蔣大偉繼續(xù)說道：我沒說錯(cuò)吧，蘭江大橋很有氣勢(shì)，很美。鄭馨還是沒說話，她打開車門，蔣大偉：就這么下車了，不想再說點(diǎn)什么嗎？鄭馨仍然沒說話，蔣大偉急了：等等！臨死之前，還有什么未了之事，或許我能再幫你個(gè)忙。鄭馨皺緊眉頭，像竭力想著什么。蔣大偉說：反正是快死的人了，沒什么不好說的。鄭馨想了想，咬牙切齒地：我想等陳曉來，讓他看看我是怎么死的！

目前研究表明，表觀遺傳的重要組成部分為DNA甲基化驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA甲基化是一些功能基因沉默或失活的常見機(jī)制

。因此，基因甲基化在疾病的發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮重要作用。FBN1基因由66個(gè)外顯子組成，其編碼的蛋白是一個(gè)350 ku的糖蛋白

。FBN1可參與組成彈性蛋白，而彈性蛋白是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用

。Wang等

研究表明，纖維蛋白原是肝豆?fàn)詈俗冃灾械年P(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，肝豆?fàn)詈俗冃越MFBN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(70.89%)高于正常對(duì)照組(13.92%)，而肝豆?fàn)詈俗冃越MFBN1基因甲基化率(26.58%)低于正常對(duì)照組(63.29%)。提示FBN1基因啟動(dòng)子的低甲基化及蛋白高表達(dá)可能與肝豆?fàn)詈俗冃缘陌l(fā)生、發(fā)展有關(guān)。此外，本研究中FBN1基因甲基化及蛋白表達(dá)與年齡、肝豆?fàn)詈俗冃约易迨芬约癈P、u-Cu水平有相關(guān)性。研究表明，u-Cu升高和血清CP降低是診斷肝豆?fàn)詈俗冃缘膮⒖家罁?jù)，CP、u-Cu水平異常的患者肝功能大多異常

。推測(cè)FBN1基因低甲基化使FBN1蛋白表達(dá)水平升高，F(xiàn)BN1參與合成彈性蛋白的作用異常增加，使得某些膠原纖維在肝內(nèi)的病理沉積過多，造成肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叱霈F(xiàn)肝纖維化，進(jìn)而影響肝功能。結(jié)合本研究對(duì)臨床病理特征與基因甲基化及蛋白表達(dá)水平關(guān)系的分析結(jié)果，進(jìn)一步推測(cè)FBN1基因低甲基化、FBN1蛋白高表達(dá)可能多發(fā)生于年齡<45歲、有肝豆?fàn)詈俗冃约易迨返母味範(fàn)詈俗冃曰颊摺１狙芯拷Y(jié)果中FBN1基因非甲基化及蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率較低，且FBN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)是患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，F(xiàn)BN1基因甲基化是患者死亡的保護(hù)因素。提示FBN1基因低甲基化及蛋白高表達(dá)可能不利于肝豆?fàn)詈俗冃曰颊哳A(yù)后，推測(cè)FBN1的低甲基化及高表達(dá)導(dǎo)致肝纖維化及肝功能損傷加重，肝豆?fàn)詈俗冃曰颊卟∏榧又?，死亡率增加?/p>

綜上所述，F(xiàn)BN1基因甲基化及蛋白表達(dá)水平與肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叩呐R床病理特征及預(yù)后關(guān)系密切，通過對(duì)FBN1基因甲基化的研究，可能對(duì)推動(dòng)臨床今后尋找更多的肝豆?fàn)詈俗冃苑肿由飳W(xué)標(biāo)志物有重要作用。然而FBN1基因甲基化的檢測(cè)過程中可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，進(jìn)而造成研究結(jié)果出現(xiàn)偏倚，有待今后加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

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