• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    馬達(dá)加斯加龍樹實時熒光定量PCR鑒定方法的研究

    2022-07-06 20:50:25李井干吳晶伏建國楊曉軍張明哲
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:實時熒光定量PCR鑒定

    李井干 吳晶 伏建國 楊曉軍 張明哲

    摘要 [目的]通過設(shè)計特異性引物與熒光探針,建立馬達(dá)加斯加龍樹(Didierea madagascariensis)實時熒光定量PCR鑒定方法。[方法]提取26份龍樹科植物基因組,并用內(nèi)源基因檢測DNA質(zhì)量;根據(jù)GenBank中已發(fā)表的馬達(dá)加斯加龍樹的PEPC基因序列,設(shè)計特異性引物與熒光探針,通過檢測26份供試樣本,檢測該方法的特異性;將樣品DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,以檢測實時熒光定量PCR方法的靈敏度。[結(jié)果]只有3份馬達(dá)加斯加龍樹樣本出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,其他23份龍樹科植物無典型的擴(kuò)增曲線;核酸原液與10-1~10-4倍稀釋液樣本均能夠得到典型擴(kuò)增曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)(R2)為0.995,檢測限量為5.2×10-3 ng/μL。[結(jié)論]該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高,可有效地應(yīng)用于馬達(dá)加斯加龍樹的鑒定。

    關(guān)鍵詞 馬達(dá)加斯加龍樹;實時熒光定量PCR;鑒定

    中圖分類號 Q 943? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

    文章編號 0517-6611(2022)12-0168-03

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.043

    開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):

    Research on Identification of Didierea madagascariensis with Real-time PCR Method

    LI Jing-gan,WU Jing,F(xiàn)U Jian-guo et al

    (Animal,Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs,Nanjing,Jiangsu 210019)

    Abstract [Objective]A real-time fluorescent quantitative PCR detection method for Didierea madagascariensis was established by designing specific primers and fluorescent probes.[Method]26 samples of didiereaceae plants were extracted,and DNA quality was detected with endogenous genes.Specific primers and probe were designed according to the published PEPC genes of Didierea madagascariensis and were used to detecting 26 testing samples,the specificity and sensitivity were detected by screening 26 testing samples.The sample DNA was serially diluted 10 times to test the sensitivity of real-time PCR method.[Result]Typical amplification curves could be obtained for 3 Didierea madagascariensis samples,but not for other 23 samples.The nucleic acid stoste and its diluents from 10-1-10-4 times could also be deteced the signals,the determination coefficient (R2)of the standard curve was 0.995 and the detection limit was 5.2×10-3 ng/μL.[Conclusion]The method has strong specificity and high sensitivity,and can be effectively applied to the identification of Didierea madagascariensis.

    Key words Didierea madagascariensis;Real-time PCR;Identification

    馬達(dá)加斯加龍樹(Didierea madagascariensis)屬龍樹科(Didiereaceae)刺棘木屬(Didierea)[1],馬達(dá)加斯加特有種,因當(dāng)?shù)厝祟惿?、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、養(yǎng)牛場建設(shè)而變得瀕危[2],被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ。龍樹科葉形多變,線形、梭形、卵形和心形都有,葉常在旱季脫落[3]。目前馬達(dá)加斯加龍樹的鑒定主要以形態(tài)學(xué)為主,且葉片是鑒定馬達(dá)加斯加龍樹的重要依據(jù),馬達(dá)加斯加龍樹的葉脫落后,會給馬達(dá)加斯加龍樹的鑒定帶來一定難度,因此需要制定分子生物學(xué)的鑒定方法,用于快速準(zhǔn)確鑒定馬達(dá)加斯加龍樹,為口岸進(jìn)境物種的鑒定研究奠定基礎(chǔ),并有助于瀕危物種的保護(hù)。

    實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[4]。實時熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好及高通量等特點[5],目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、育種學(xué)、營養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域[6-7],但該方法在瀕危物種的鑒定方面應(yīng)用較少。

    磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因在龍樹科植物內(nèi)廣泛存在[8],根據(jù)馬達(dá)加斯加龍樹PEPC序列特有的保守突變位點,設(shè)計用于實時熒光定量PCR的特異性引物和熒光探針,研究馬達(dá)加斯加龍樹的分子鑒定方法,并檢測該方法的實用性,為瀕危物種的鑒定提供新的方法和思路。4F2A077F-4076-4C23-80F4-03ADEFAA09F4

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料 所用26份試驗材料來自江蘇南京和福建廈門,均由相關(guān)專家鑒定,采集新鮮植株葉片進(jìn)行試驗。樣品的詳細(xì)信息見表1。

    1.2 基因組DNA提取

    先將供試植物葉片進(jìn)行表面消毒,用液氮研磨成粉,參照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說明書上的步驟方法,提取試驗樣品基因組DNA。用超微量分光光度計One drop OD2000+測定提取樣品DNA濃度。

    1.3 引物與探針設(shè)計

    通過BioEdit軟件對馬達(dá)加斯加龍樹的PEPC基因序列與龍樹科其他植物PEPC基因序列進(jìn)行多重序列比對,找出馬達(dá)加斯加龍樹的特異性位點突變區(qū),應(yīng)用引物和探針設(shè)計軟件Primer Express設(shè)計實時熒光定量PCR引物和探針。探針5′端含有FAM熒光報告基團(tuán),3′端含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)BHQ1。內(nèi)源基因參照SN/T 1204—2016中18S rRNA序列[9]。具體序列見表2。

    1.4 內(nèi)源基因檢測

    應(yīng)用通用植物內(nèi)源基因18S rRNA對提取樣品基因組DNA進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測,檢測待測樣品是否有典型擴(kuò)增曲線。如未出現(xiàn)實時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線,則說明提取的樣品DNA質(zhì)量有問題,或DNA提取液中有抑制物質(zhì),應(yīng)重新提取或純化待測樣品基因組DNA,直到擴(kuò)增出典型擴(kuò)增曲線。

    1.5 實時熒光PCR擴(kuò)增

    試驗所用TaKaRa Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)購自南京易特派儀器儀表有限公司,核酸提取試劑盒DNeasy Plant Mini kit購自凱杰公司,實時熒光PCR儀為ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀。

    實時熒光定量PCR反應(yīng)體系:Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)10.0 μL,上游引物 (10 μmol/L ) 0.8 μL,下游引物 (10 μmol/L) 0.8 μL,探針(10 μmol/L) 0.4 μL,ROX 0.4 μL,DNA模板2.0 μL,補(bǔ)水至20 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序:94 ℃,15 s;64 ℃,1 min。

    1.6 特異性試驗 將所有樣品放入實時熒光定量PCR儀,按照設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,觀察反應(yīng)體系的特異性。

    1.7 靈敏性試驗 取馬達(dá)加斯加龍樹葉片提取的基因組DNA,以超微量分光光度計測定核酸濃度,對DNA進(jìn)行10倍梯度系列稀釋,取各濃度DNA模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測,每個濃度做3個重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 內(nèi)源基因檢測

    用通用植物內(nèi)源基因18S rRNA對26份提取基因組DNA進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示所有待測樣品均有典型的擴(kuò)增曲線,其循環(huán)閾值(Ct)在12~20。按照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204—2016,內(nèi)源基因檢測Ct值需要小于或等于30。內(nèi)源基因檢測結(jié)果表明,所提樣品DNA均沒有問題,可以進(jìn)行后續(xù)靈敏度和特異性試驗。具體結(jié)果見圖1。

    2.2 實時熒光定量PCR特異性檢測

    應(yīng)用設(shè)計的特異性引物和熒光探針,對26份樣品DNA進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示只有3份馬達(dá)加斯加龍樹樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(圖2)。表明所設(shè)計的引物和熒光探針對馬達(dá)加斯加龍樹具有良好的特異性。

    2.3 實時熒光定量PCR檢測靈敏度

    提取馬達(dá)加斯加龍樹樣品D17基因組DNA后,測定核酸濃度為52.3 ng/μL。將該樣品DNA進(jìn)行 10倍梯度稀釋,以檢測實時熒光定量PCR方法的靈敏度。擴(kuò)增結(jié)果顯示,核酸原液與10-1~10-4倍稀釋液樣本均能夠得到典型的擴(kuò)增曲線,根據(jù)陰性對照設(shè)置閾值線,得到其Ct值分別為23.564、26.522、29.668、33.857、36.646;10-5、10-6和10-7 DNA稀釋液樣本未得到典型的擴(kuò)增曲線,判定為陰性。該靈敏度試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)(R2)為0.995(圖3),檢測限量為5.2×10-3 ng/μL。

    3 討論與結(jié)論

    CITES的精神在于管制而非完全禁止野生物種的國際貿(mào)易,其用物種分級與許可證的方式,以達(dá)成野生物種市場的永續(xù)利用性,我國于1980年12月25日加入該公約。馬達(dá)加斯加龍樹被列入CITES附錄Ⅱ中,屬于被管制的國際貿(mào)易對象。為更好履行CITES公約責(zé)任,提高外來物種的快速準(zhǔn)確檢測能力,建立馬達(dá)加斯加龍樹的實時熒光定量PCR鑒定方法,不僅對馬達(dá)加斯加龍樹的保護(hù)具有重要意義,也有助于提升瀕危物種的鑒定水平。

    PEPC是C4植物[10]和CAM植物[11]光合作用的關(guān)鍵酶之一,在種子萌發(fā)和形成[12]、調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞[13]、促進(jìn)蘋果酸的合成[14]、植物抗生物和非生物脅迫[15]中有重要作用。PEPC基因具有高度的保守性[16],已用于鐵皮石斛[17]和菌草[18]的遺傳多樣性分析,表明PEPC基因可以作為物種鑒定的候選片段。

    該研究根據(jù)馬達(dá)加斯加龍樹與其他龍樹科物種PEPC序列差異,設(shè)計開發(fā)了馬達(dá)加斯加龍樹的特異性引物探針,該引物可以將馬達(dá)加斯加龍樹從刺棘木科植物中區(qū)分開來,表現(xiàn)出了良好的特異性。該方法檢測限量為5.2×10-3 ng/μL,具有良好的靈敏度,提取的樣品DNA完全能夠滿足檢測鑒定需要。該方法的建立將有助于植物物種的準(zhǔn)確鑒定工作的開展,對瀕危物種的保護(hù)具有重要意義,也為我國CITES履約、海關(guān)執(zhí)法等提供更加科學(xué)準(zhǔn)確的技術(shù)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

    [1]

    RAUH W.The morphology and systematic position of the Didiereaceae of Madagascar[J].Bothalia,1983,14(3/4):839-843.4F2A077F-4076-4C23-80F4-03ADEFAA09F4

    [2] ERBAR C,LEINS P.Floral ontogeny and systematic position of the Didiereaceae[J].Plant systematics and evolution,2006,261(1/2/3/4):165-185.

    [3] 王成聰.探究龍樹科的奧秘[J].園林,2014(1):20-23.

    [4] 廉紅霞,高騰云,傅彤,等.實時熒光定量PCR定量方法研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,22(10):128-129,132.

    [5] HUGGETT J,DHEDA K,BUSTIN S,et al.Real-time RT-PCR normalisation;strategies and considerations[J].Genes and immunity,2005,6(4):279-284.

    [6] ZIMMERMANN B,HOLZGREVE W,WENZEL F,et al.Novel real-time quantitative PCR test for trisomy 21[J].Clinical chemistry,2002,48(2):362-363.

    [7] KESSLER H H,PREININGER S,STELZL E,et al.Identification of different states of hepatitis B virus infection with a quantitative PCR assay[J].Clinical and diagnostic laboratory immunology,2000,7(2):298-300.

    [8] CHRISTIN P A,ARAKAKI M,OSBORNE C P,et al.Shared origins of a key enzyme during the evolution of C4 and CAM metabolism[J].Journal of experimental botany,2014,65(13):3609-3621.

    [9] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法:SN/T 1204—2016[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

    [10] HATCH M D.C4 photosynthesis:A unique elend of modified biochemistry,anatomy and ultrastructure[J].Biochimica et biophysica acta(BBA)-reviews on bioenergetics,1987,895(2):81-106.

    [11] BORLAND A M,TAYBI T.Synchronization of metabolic processes in plants with Crassulacean acid metabolism[J].Journal of experimental botany,2004,55(400):1255-1265.

    [12] OLEARY B,F(xiàn)EDOSEJEVS E T,HILL A T,et al.Tissue-specific expression and post-translational modifications of plant-and bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase isozymes of the castor oil plant,Ricinus communis L[J].Journal of experimental botany,2011,62(15):5485-5495.

    [13] COUSINS A B,BAROLI I,BADGER M R,et al.The role of phosphoenolpyruvate carboxylase during C4 photosynthetic isotope exchange and stomatal conductance[J].Plant physiology,2007,145(3):1006-1017.

    [14] NOMURA M,MAI H T,F(xiàn)UJII M,et al.Phosphoenolpyruvate carboxylase plays a crucial role in limiting nitrogen fixation in Lotus japonicus nodules[J].Plant and cell physiology,2006,47(5):613-621.

    [15] CHENG G,WANG L,LAN H Y.Cloning of PEPC-1 from a C4 halophyte Suaeda aralocaspica without Kranz anatomy and its recombinant enzymatic activity in responses to abiotic stresses[J].Enzyme and microbial technology,2016,83:57-67.

    [16] SVENSSON P,BLSING O E,WESTHOFF P.Evolution of C4 phosphoenolpyruvate carboxylase[J].Archives of biochemistry and biophysics,2003,414(2):180-188.

    [17] 劉玲,吳睿,牛志韜,等.基于TRAP分子標(biāo)記的鐵皮石斛野生居群的分析與鑒別[J].藥學(xué)學(xué)報,2016,51(12):1926-1933.

    [18] 梅嘉洺,黃小霞,王詠,等.46份菌草種質(zhì)資源PEPC基因的PCR-RFLP多樣性分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,35,60(11):45-50,60.4F2A077F-4076-4C23-80F4-03ADEFAA09F4

    猜你喜歡
    實時熒光定量PCR鑒定
    山東壽光蔬菜種業(yè)集團(tuán)示范園部分番茄品種褪綠病毒感染分析
    丹參蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表達(dá)分析
    雞卵清蛋白啟動子慢病毒載體構(gòu)建及熒光定量PCR檢測重組慢病毒滴度
    1—脫氧野尻霉素對家蠶中腸BmSuc1基因表達(dá)及其酶活性的影響
    αB—crystallin在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義
    試析檔案整理與鑒定
    青年時代(2016年28期)2016-12-08 19:41:51
    古籍版本鑒定
    淺議檢察機(jī)關(guān)司法會計鑒定的主要職責(zé)
    青銅器鑒定與修復(fù)初探
    資治文摘(2016年7期)2016-11-23 00:23:20
    八種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定
    国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 91成年电影在线观看| 欧美精品一区二区大全| 精品国产乱码久久久久久小说| 女人精品久久久久毛片| 中国美女看黄片| 欧美日韩av久久| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲国产av新网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩欧美免费精品| 一个人免费在线观看的高清视频 | 一个人免费看片子| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲少妇的诱惑av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品二区激情视频| 成年人免费黄色播放视频| 69av精品久久久久久 | 青草久久国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品 欧美亚洲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一区二区三区四区激情视频| 日日夜夜操网爽| 中文字幕av电影在线播放| 9191精品国产免费久久| 无限看片的www在线观看| 超碰成人久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一级毛片电影观看| 日韩大片免费观看网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩中文字幕视频在线看片| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品av麻豆狂野| av不卡在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲免费av在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久 成人 亚洲| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲欧美激情在线| 久久久久久久国产电影| 精品视频人人做人人爽| 国产三级黄色录像| 51午夜福利影视在线观看| 69av精品久久久久久 | 精品福利永久在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 免费av中文字幕在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美日韩亚洲高清精品| 丁香六月天网| 18禁国产床啪视频网站| 日本黄色日本黄色录像| 丝袜美腿诱惑在线| 两性夫妻黄色片| 亚洲avbb在线观看| 免费在线观看日本一区| 久久久久网色| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美黑人精品巨大| 午夜福利免费观看在线| 国产男女超爽视频在线观看| 女人久久www免费人成看片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久性视频一级片| 婷婷丁香在线五月| 人人澡人人妻人| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 美国免费a级毛片| 丝袜美足系列| www日本在线高清视频| 精品少妇久久久久久888优播| 精品高清国产在线一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 国产精品1区2区在线观看. | 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美黑人欧美精品刺激| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美日韩福利视频一区二区| 免费不卡黄色视频| 精品久久蜜臀av无| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 成人国产av品久久久| 香蕉国产在线看| 亚洲人成电影观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲五月婷婷丁香| 99热国产这里只有精品6| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产av精品麻豆| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 777米奇影视久久| 老司机影院成人| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 曰老女人黄片| 考比视频在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男女免费视频国产| 黑人猛操日本美女一级片| 久久久精品94久久精品| 国产成人av激情在线播放| 国产成人欧美| 亚洲九九香蕉| www.熟女人妻精品国产| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线观看免费午夜福利视频| 精品高清国产在线一区| 欧美日韩黄片免| av欧美777| 日本黄色日本黄色录像| av网站免费在线观看视频| 日本av免费视频播放| 中文字幕色久视频| 9热在线视频观看99| 搡老岳熟女国产| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品久久久久久电影网| 丝袜人妻中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 男人操女人黄网站| 一区二区av电影网| 777米奇影视久久| 黄片播放在线免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 一本综合久久免费| 激情视频va一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 99久久人妻综合| 午夜激情av网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久久精品人妻al黑| 捣出白浆h1v1| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区精品91| 一进一出抽搐动态| 欧美一级毛片孕妇| 久久青草综合色| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 老汉色∧v一级毛片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲视频免费观看视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 男人操女人黄网站| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲欧美清纯卡通| 两个人免费观看高清视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲国产欧美网| 一个人免费看片子| 波多野结衣一区麻豆| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 新久久久久国产一级毛片| av超薄肉色丝袜交足视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜免费成人在线视频| 香蕉国产在线看| 一区二区三区乱码不卡18| 国产主播在线观看一区二区| 热99re8久久精品国产| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久久欧美国产精品| bbb黄色大片| 国产老妇伦熟女老妇高清| a级片在线免费高清观看视频| 最黄视频免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产一卡二卡三卡精品| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品 国内视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩欧美一区视频在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品九九99| 大码成人一级视频| 老汉色∧v一级毛片| 性色av乱码一区二区三区2| 多毛熟女@视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 美女中出高潮动态图| 久久久国产成人免费| 热99国产精品久久久久久7| 99精品欧美一区二区三区四区| e午夜精品久久久久久久| 国产精品1区2区在线观看. | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 1024视频免费在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 成人免费观看视频高清| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美在线黄色| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美精品高潮呻吟av久久| av网站免费在线观看视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜精品久久久久久毛片777| 岛国在线观看网站| 国产精品av久久久久免费| 精品一区在线观看国产| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美日韩视频精品一区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 一区二区av电影网| 美国免费a级毛片| 亚洲第一青青草原| 大码成人一级视频| 亚洲全国av大片| 伊人亚洲综合成人网| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av片天天在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 精品一区在线观看国产| 亚洲欧美色中文字幕在线| 69精品国产乱码久久久| 国产视频一区二区在线看| 亚洲成人国产一区在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 色播在线永久视频| 欧美日韩黄片免| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女视频免费永久观看网站| 考比视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲avbb在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久天堂一区二区三区四区| 国产激情久久老熟女| 亚洲伊人色综图| 国产精品偷伦视频观看了| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精品美女久久av网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| www.自偷自拍.com| 精品福利永久在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 五月开心婷婷网| 男女国产视频网站| 精品视频人人做人人爽| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲中文字幕日韩| 久久人妻熟女aⅴ| 老司机午夜福利在线观看视频 | 视频区图区小说| 黑人欧美特级aaaaaa片| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久久人人人人人| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品一区二区在线不卡| 下体分泌物呈黄色| 天天影视国产精品| 国产亚洲精品久久久久5区| 日本wwww免费看| 丁香六月欧美| 男女午夜视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费日韩欧美在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线精品无人区一区二区三| 黄片播放在线免费| 亚洲av美国av| 久久午夜综合久久蜜桃| kizo精华| 久久久久精品国产欧美久久久 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 不卡一级毛片| 91国产中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产成人精品久久二区二区免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产91精品成人一区二区三区 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 12—13女人毛片做爰片一| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| av一本久久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| www.熟女人妻精品国产| 飞空精品影院首页| 久久久精品免费免费高清| 国产男女超爽视频在线观看| 成人国产av品久久久| 国产精品 欧美亚洲| av电影中文网址| 成人国产一区最新在线观看| 国产又爽黄色视频| 亚洲精品一二三| cao死你这个sao货| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产淫语在线视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品一区二区免费欧美 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲专区字幕在线| 成年动漫av网址| 中文欧美无线码| 亚洲精品av麻豆狂野| www.自偷自拍.com| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产国语露脸激情在线看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本五十路高清| 中文字幕人妻丝袜制服| 一本色道久久久久久精品综合| 精品国产国语对白av| 国产日韩欧美亚洲二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 我的亚洲天堂| 久久天堂一区二区三区四区| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 国产又爽黄色视频| 一本色道久久久久久精品综合| www.自偷自拍.com| 视频区图区小说| 午夜精品国产一区二区电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 嫩草影视91久久| 黄色片一级片一级黄色片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 麻豆国产av国片精品| 韩国高清视频一区二区三区| 香蕉国产在线看| 亚洲三区欧美一区| 后天国语完整版免费观看| 另类精品久久| 午夜福利,免费看| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品一二三| 91大片在线观看| 欧美午夜高清在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线永久观看黄色视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 考比视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 最新在线观看一区二区三区| 欧美在线黄色| 一级毛片电影观看| 国产不卡av网站在线观看| 中文字幕色久视频| 国产高清视频在线播放一区 | 久久 成人 亚洲| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲五月婷婷丁香| 搡老熟女国产l中国老女人| 天天影视国产精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜老司机福利片| 精品福利观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产激情久久老熟女| 男人舔女人的私密视频| 成在线人永久免费视频| 午夜福利,免费看| 日韩大片免费观看网站| 久热爱精品视频在线9| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品国产一区二区久久| 老司机亚洲免费影院| 国产又色又爽无遮挡免| 嫁个100分男人电影在线观看| 黑人操中国人逼视频| 久久天堂一区二区三区四区| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品一区二区在线观看99| 男女国产视频网站| 亚洲精品一区蜜桃| 男女边摸边吃奶| 91精品国产国语对白视频| 一区福利在线观看| av福利片在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 深夜精品福利| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一二三四在线观看免费中文在| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 狂野欧美激情性xxxx| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产av国产精品国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 麻豆av在线久日| 国产99久久九九免费精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 女警被强在线播放| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人欧美| 精品福利永久在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲男人天堂网一区| av电影中文网址| 久久中文字幕一级| av免费在线观看网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产成人欧美| 最新在线观看一区二区三区| h视频一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 男女之事视频高清在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美午夜高清在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 99久久综合免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲成人免费av在线播放| 一区二区av电影网| 飞空精品影院首页| 黄片大片在线免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品少妇内射三级| 亚洲精品美女久久av网站| 精品第一国产精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产男女内射视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产一区二区在线观看av| 成人av一区二区三区在线看 | 亚洲三区欧美一区| 1024视频免费在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产亚洲精品久久久久5区| 丰满迷人的少妇在线观看| 丰满少妇做爰视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 蜜桃国产av成人99| 十八禁人妻一区二区| 久久人人爽人人片av| 最新的欧美精品一区二区| 一本综合久久免费| 岛国毛片在线播放| 国产男人的电影天堂91| 三上悠亚av全集在线观看| 美女主播在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 99精品久久久久人妻精品| 美女视频免费永久观看网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日本a在线网址| 色老头精品视频在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一级毛片电影观看| 国产av一区二区精品久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲第一av免费看| 一级毛片电影观看| 黄片小视频在线播放| 国产99久久九九免费精品| 国产免费现黄频在线看| 91九色精品人成在线观看| 黄频高清免费视频| 下体分泌物呈黄色| a在线观看视频网站| 妹子高潮喷水视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 久久人人爽人人片av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美人与性动交α欧美软件| 免费观看人在逋| 99国产精品99久久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 美女中出高潮动态图| 美女扒开内裤让男人捅视频| 在线观看人妻少妇| 精品少妇久久久久久888优播| 美女高潮到喷水免费观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久成人av| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲中文字幕日韩| 91国产中文字幕| 国产高清视频在线播放一区 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99热全是精品| 最新的欧美精品一区二区| 久久久久网色| 欧美精品一区二区大全| a 毛片基地| 一级片免费观看大全| 精品福利观看| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品第二区| 国产色视频综合| 午夜视频精品福利| 成在线人永久免费视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品久久久久久精品古装| 日本av免费视频播放| 黄色 视频免费看| 视频区图区小说| 久久精品国产a三级三级三级| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲伊人色综图| 久久久久视频综合| 精品国产一区二区三区四区第35| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产在视频线精品| 满18在线观看网站| 亚洲专区国产一区二区| 男女边摸边吃奶| 丰满饥渴人妻一区二区三| 69精品国产乱码久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产看品久久| 国产高清videossex| 99re6热这里在线精品视频| 真人做人爱边吃奶动态| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 五月天丁香电影| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 两个人免费观看高清视频| 在线观看舔阴道视频| 国产黄频视频在线观看| 欧美在线黄色| 精品高清国产在线一区| 超色免费av| 亚洲第一av免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 丝袜人妻中文字幕| 午夜影院在线不卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美日韩黄片免| 精品一区二区三区四区五区乱码| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久综合国产亚洲精品| videosex国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 交换朋友夫妻互换小说| 韩国高清视频一区二区三区| 青草久久国产| 成年av动漫网址| 精品一区二区三区四区五区乱码| 少妇精品久久久久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 1024香蕉在线观看| 日本av手机在线免费观看| videosex国产| 99国产精品一区二区三区| 永久免费av网站大全| 一区二区三区激情视频| 三级毛片av免费| 天天影视国产精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久|