一株膠凍樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其解鉀活性

葉偉偉 楊曉燕 魏善強(qiáng) 張龍 黃俊

摘要 ?[目的]優(yōu)化該膠凍樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件及測(cè)定其解鉀活性。[方法]用火焰光度計(jì)法測(cè)定膠凍樣芽孢桿菌的解鉀量;通過大白菜的田間試驗(yàn)驗(yàn)證解鉀功能;通過培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。[結(jié)果]用火焰光度計(jì)法測(cè)定膠凍樣芽孢桿菌的解鉀量為121.3 mg/L，其解鉀率為12.06%;將其應(yīng)用到喜鉀作物大白菜上，通過大白菜的田間試驗(yàn)，與K0（空白對(duì)照）組相比大白菜產(chǎn)量增加了15.5%，與只加硫酸鉀的K1相比，產(chǎn)量差異不大;通過培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)基配比為蔗糖1.0%、酵母浸粉0.1%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.05%，最適培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵結(jié)果有效活菌數(shù)達(dá)到17.5×108 CFU/mL，芽孢率≥95%，解鉀率提高到23.02%。[結(jié)論]該膠凍樣芽孢桿菌可以將土壤中不可直接被作物吸收利用的鉀素分解為作物可以直接利用的速效鉀形態(tài)。

關(guān)鍵詞 膠凍樣芽孢桿菌;火焰光度計(jì)法;培養(yǎng)條件;優(yōu)化;解鉀率;有效活菌數(shù);芽孢率

中圖分類號(hào) Q93-335? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）12-0011-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.003

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of the Culture Condition of a Jelly-like Bacillus Strain and Its Potassium-releasing Activity

YE Wei-wei，YANG Xiao-yan，WEI Shan-qiang et al

（Shandong Jinniu Biotechnology Co.， Ltd.， Jinan， Shandong 250000）

Abstract [Objective] To optimize the culture conditions of the jelly-like Bacillus strain and determine its potassium-releasing activity.[Method] The potassium solubilization amount of Bacillus jelly was determined by flame photometer;the potassium solubilization function was verified by the field test of Chinese cabbage;the best medium and culture conditions were obtained through the optimization of medium composition and culture conditions.[Result] The amount of potassium release of Bacillus jelly measured by flame photometer was 121.3 mg/L， and the potassium release rate was 12.06%. It was applied to the potassium-loving crop Chinese cabbage，through the field test of Chinese cabbage，compared with the K0 （blank control） group， the yield of Chinese cabbage increased by 15.5%;compared with K1 with only potassium sulfate， there was little difference in yield. Through the optimization of the medium composition and culture conditions， the best medium ratio was obtained sucrose 1%， yeast extract 0.1%， magnesium sulfate 0.02%， dipotassium hydrogen phosphate 0.05%， the most suitable culture conditions were temperature 30 ℃， pH 7.0， rotation speed 200 r/min， the effective number of viable bacteria reaches 17.5×108 CFU/mL as a result of fermentation， the spore rate was ≥95%， and the potassium solution rate was increased to 23.02%.[Conclusion] The Bacillus jelly can decompose the potassium in soil that cannot be directly absorbed by crops into quick-acting potassium forms that can be directly used by crops.

Key words Bacillus jelly;Flame photometer method;Culture condition;Optimization;Potassium solution rate;Effective number of viable bacteria;Spore rate

鉀是農(nóng)作物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，其以離子態(tài)或可溶性鹽類被吸附在原生質(zhì)表面上而存在于高等植物中，起著促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、光合作用的進(jìn)行和催化重要的酶促反應(yīng)等重要作用。我國(guó)耕地土壤中蘊(yùn)含著豐富的鉀元素，但95%的鉀存在于鉀長(zhǎng)石和云母這兩類礦物中，不能被植物直接有效利用[1]。近年來隨著土壤養(yǎng)分的失衡，耕地中的速效鉀含量也以2 mg/（kg·a）的速度損耗;又因化肥的過量施用，造成一些鉀被土壤固結(jié)，形成各種化學(xué)鹽分，在土壤中積累，造成土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)失調(diào)、物理性狀變差。鉀元素已經(jīng)成為農(nóng)作物生長(zhǎng)的限制因子[2-4]，因此，如何讓土壤中含鉀硅酸鹽礦物轉(zhuǎn)化為可被作物直接吸收利用的速效鉀形態(tài)，從而提高土壤中的速效鉀含量，成為未來農(nóng)業(yè)科技研究的發(fā)展方向之一。

1939年，亞歷山大羅夫從土壤中分離篩選出一種可以分解正長(zhǎng)石和磷灰石并釋放出鉀元素和磷元素的細(xì)菌，將其命名為硅酸鹽細(xì)菌，一些研究學(xué)者又稱為鉀細(xì)菌或膠質(zhì)芽孢桿菌[5-6]，后來我國(guó)一些學(xué)者把這些解鉀菌統(tǒng)稱為解鉀微生物。解鉀微生物（potassium-solubilizing microorganism）是能夠在土壤中或純培養(yǎng)條件下，將含鉀礦物如長(zhǎng)石、云母等不能被農(nóng)作物吸收利用的礦物態(tài)鉀分解產(chǎn)生水溶性鉀的微生物[7]。土壤中的解鉀微生物在世界各地不同土壤中分布廣泛，研究報(bào)道較多的有環(huán)狀芽孢桿菌（Bacilluscirculans）、膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和土壤芽孢桿菌（B.daphicus），其中最常見的為膠質(zhì)芽孢桿菌。膠質(zhì)芽孢桿菌又稱膠凍樣芽孢桿菌，一些分類學(xué)學(xué)者將膠凍樣芽孢桿菌歸為芽孢桿菌屬，1993年Ash等[8]通過對(duì)芽孢桿菌屬51個(gè)種的16S rRNA基因序列及其他相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)膠凍樣芽孢桿菌歸為另一新屬，并命名為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），因此膠凍樣芽孢桿菌又稱為膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）。Ross等[9]研究認(rèn)為膠凍樣類芽孢桿菌可以在含有鉀長(zhǎng)石粉的無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明膠凍樣芽孢桿菌具有解鉀功能。

筆者前期從土壤中篩選到一株膠凍樣芽孢桿菌，通過火焰光度計(jì)法測(cè)得該菌株的解鉀率，并通過種植喜鉀作物的田間試驗(yàn)再次驗(yàn)證了該菌株的解鉀功能;然后采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其培養(yǎng)基成分、發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了最佳培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，并通過50 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）由山東勁牛集團(tuán)股份有限公司分離并保存。礦物材料購買鉀長(zhǎng)石粉。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基為無氮培養(yǎng)基，其組成成分為葡萄糖10 g/L、磷酸氫二鉀0.2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉0.2 g/L、硫酸鉀0.2 g/L、碳酸鈣5 g/L、瓊脂粉18 g/L?；A(chǔ)培養(yǎng)基為無氮培養(yǎng)基，其組成成分為葡萄糖10 g/L、磷酸氫二鉀0.2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉0.2 g/L、硫酸鉀0.2 g/L、碳酸鈣5 g/L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膠凍樣芽孢桿菌菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)方法。

（1）斜面活化培養(yǎng)。將-20 ℃保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，30 ℃，培養(yǎng)48 h。

（2）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。無菌條件下將活化好的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)20 h即為種子液，同樣無菌條件下，將種子液以2%的接種量接入500 mL三角瓶中，搖瓶裝液量為20%，30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔12 h檢測(cè)一次，48 h結(jié)束培養(yǎng)，重復(fù)培養(yǎng)3次。

（3）50 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。以5%的接種量將種子液（搖瓶發(fā)酵20 h）接種于發(fā)酵罐中，30 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量為3.3 L/min，發(fā)酵60～72 h，芽孢率≥95%視為發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 活菌計(jì)數(shù)及芽孢率分析方法。

活菌計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法[10-11]，芽孢率采用芽孢染色后顯微鏡下計(jì)數(shù)計(jì)算。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)室解鉀率的測(cè)定。

依據(jù)王珣玨等[12]解鉀菌解鉀效率檢測(cè)方法的比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6%H2O2消煮后，用火焰光度計(jì)所測(cè)鉀含量包括菌體吸附鉀、部分細(xì)胞內(nèi)鉀及溶液中游離態(tài)鉀[13]所測(cè)得的溶液中K+質(zhì)量濃度和解鉀率是4種處理方法中得到的結(jié)果最準(zhǔn)確的，因此選用培養(yǎng)基經(jīng)H2O2處理后測(cè)鉀的方法用火焰光度計(jì)測(cè)定該菌株的解鉀能力。首先配制好系列鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在火焰光度計(jì)上測(cè)定待測(cè)液的速效鉀含量[14]。將搖瓶發(fā)酵種子液以2%的接種量接種到100 mL含1 g鉀長(zhǎng)石粉的缺鉀培養(yǎng)基中，以加入等量無菌水為空白對(duì)照，30 ℃，200 r/min，搖床振蕩培養(yǎng)7 d;取培養(yǎng)液10 mL，加入2 mL 6%H2O2，在沸水浴中消化1 h，取消化液13 000 r/min離心5 min，取上清在火焰光度計(jì)上測(cè)定K+濃度。解鉀率計(jì)算公式如下：

解鉀率=X1-X0M×W×2×104×100%（1）

式中，X1為待測(cè)液速效鉀含量（mg/L）;

X0為空白對(duì)照鉀含量（mg/L）;

M為鉀長(zhǎng)石粉重量（g）;

W為鉀長(zhǎng)石中鉀含量（%）[15]。

研究顯示天然鉀長(zhǎng)石中的鉀含量約為12%[16]。

1.3.4 膠凍樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。

1.3.4.1 碳源篩選及含量?jī)?yōu)化試驗(yàn)。

不同碳源對(duì)不同微生物菌種發(fā)酵的影響不同，碳源選擇原則是既能快速被菌體吸收利用，又能提高有效活菌數(shù)及芽孢率，但微生物工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)基用量大，所以在選用碳源時(shí)要使用價(jià)格低廉且易于獲得的碳源;因蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉相對(duì)價(jià)格低廉且易制取和獲得而被作為首選。該研究以培養(yǎng)膠凍樣芽孢桿菌的經(jīng)典培養(yǎng)基無氮培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取常見碳源蔗糖、淀粉、糖蜜進(jìn)行碳源單因子篩選及含量?jī)?yōu)化試驗(yàn)，見表1。

1.3.4.2 氮源篩選及含量?jī)?yōu)化試驗(yàn)。

培養(yǎng)基氮源有無機(jī)氮源和有機(jī)氮源2種，研究表明無機(jī)氮源和有機(jī)氮源在菌體發(fā)酵的不同階段作用不同，在發(fā)酵前期無機(jī)氮源更有利于被菌體快速吸收利用，而有機(jī)氮源則是在菌體生長(zhǎng)一定階段后才被菌體重復(fù)利用[17]。該研究以培養(yǎng)膠凍樣芽孢桿菌的經(jīng)典培養(yǎng)基無氮培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，綜合原料成本及獲取難易程度，選取常見氮源酵母浸粉、牛肉膏、豆粕、硫酸銨進(jìn)行氮源單因子篩選及含量?jī)?yōu)化試驗(yàn)，見表2。

1.3.4.3 溫度、初始pH及轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)。

培養(yǎng)溫度、初始pH及轉(zhuǎn)速是影響菌株生長(zhǎng)的主要條件，利用單因素試驗(yàn)確定培養(yǎng)基最佳培養(yǎng)條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

1.3.5 正交試驗(yàn)。

利用單因素試驗(yàn)確定的最佳碳源、氮源和中心水平，選取蔗糖、酵母浸粉、硫酸鎂和磷酸氫二鉀含量進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，獲得最優(yōu)發(fā)酵配方，正交試驗(yàn)因素和水平見表4。

1.3.6 發(fā)酵罐試驗(yàn)。

采用正交試驗(yàn)獲得的最佳培養(yǎng)基配方及單因素試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵工藝條件，以5%的接種量將種子液接種于裝液量為70%的50 L發(fā)酵罐中，30 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量為3.3 L/min，48 h發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液先離心再進(jìn)行噴霧干燥得到菌粉，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)及單位濃度內(nèi)菌的解鉀活性。

1.3.7 田間試驗(yàn)。

選取喜鉀作物大白菜為試驗(yàn)材料，品種為西星秋王。試驗(yàn)地土壤類型為褐土、表層質(zhì)地為輕壤，土壤肥力較高，排灌條件良好。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，處理①（K0），空白處理即不施加任何東西;處理②（K1），不加菌液加硫酸鉀;處理③（K2），加菌液不加硫酸鉀;處理④（K3），加菌液加硫酸鉀。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)處理的小區(qū)面積為45 m2，隨機(jī)排列，小區(qū)設(shè)立保護(hù)行2 m;網(wǎng)室栽培，定期澆水，保持試驗(yàn)田濕度，網(wǎng)室有遮雨篷防止因下雨而導(dǎo)致養(yǎng)分流失。試驗(yàn)時(shí)間8月1日至10月31日。試驗(yàn)期間田間管理措施一致，白菜采收按小區(qū)單獨(dú)采收、稱重、計(jì)產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)室解鉀率測(cè)定

將菌株種子液接種到以鉀長(zhǎng)石粉為唯一鉀源的培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d后，取培養(yǎng)液經(jīng)6%H2O2消化處理，測(cè)定該菌株的解鉀量為121.3 mg/L，空白對(duì)照組解鉀量為1.5 mg/L，計(jì)算可得其解鉀率為12.06%。

2.2 膠凍樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 碳源篩選及含量?jī)?yōu)化。

有研究表明，可溶性淀粉、糖蜜有利于菌體生長(zhǎng)和芽孢的形成，而蔗糖有利于菌體生長(zhǎng)但抑制芽孢形成[18]。從表5可以看出，隨著蔗糖添加量的增多，有效活菌數(shù)并沒有隨之增多，反而下降，雖然蔗糖有利于菌體生長(zhǎng)，但是大量的蔗糖也抑制了芽孢的形成，從而降低了菌的存活率，所以隨著蔗糖添加量的增多，有效活菌數(shù)沒有一直增多，反而下降。隨著糖蜜添加量的增多，有效活菌數(shù)增多，但1.0%和2.0%糖蜜的添加量的有效活菌數(shù)并沒有顯著區(qū)別，而且在添加量相同的情況下，添加糖蜜的有效活菌數(shù)和芽孢數(shù)均低于添加蔗糖的有效活菌數(shù)和芽孢數(shù)，所以添加蔗糖優(yōu)于糖蜜;選取最優(yōu)1.0%蔗糖添加量和不同比例淀粉組合作為復(fù)合碳源的有效活菌數(shù)和芽孢數(shù)也低于單獨(dú)添加蔗糖的有效活菌數(shù)和芽孢數(shù)，綜合有效活菌數(shù)和芽孢形成情況，選取最佳碳源為蔗糖，1.0%為最佳用量進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.2 氮源篩選及含量?jī)?yōu)化。從表6可以看出，除豆粕外，酵母浸粉、硫酸銨、牛肉膏這幾種氮源對(duì)膠凍樣芽孢桿菌芽孢的形成影響并不大。當(dāng)分別用酵母浸粉、豆粕、牛肉膏作為單一氮源時(shí)，酵母浸粉作為單一氮源的有效活菌數(shù)均高于其他2種單一氮源，尤其是酵母浸粉添加量為0.10%時(shí)，有效活菌數(shù)最高（8.5×108 CFU/mL），也均高于0.10%酵母浸粉和不同比例硫酸銨組合作為復(fù)合氮源的有效活菌數(shù)。綜合芽孢形成情況、成本等因素，選取最佳氮源為酵母浸粉及其添加量為0.10%進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.3 溫度、初始pH及轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件優(yōu)化。由圖1可知，該膠凍樣芽孢桿菌在30 ℃培養(yǎng)時(shí)有效活菌數(shù)最多（9.2×108 CFU/mL），同一發(fā)酵周期內(nèi)較37 ℃培養(yǎng)時(shí)有效活菌數(shù)（3.2×108 CFU/mL）高出65%，試驗(yàn)得出的該培養(yǎng)溫度與赫玲玲等[19]解鉀膠凍樣芽孢桿菌的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化中的培養(yǎng)溫度（37 ℃）不同，經(jīng)分析可知，其發(fā)酵初期的溫度是在28～32 ℃，發(fā)酵后期溫度升至37 ℃，是因?yàn)樵谳^高發(fā)酵溫度下菌體易形成芽孢，所以膠凍樣芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)增殖期和芽孢形成期的溫度不同，與趙志浩等[1]的膠質(zhì)芽孢桿菌的發(fā)酵工藝研究和田間應(yīng)用結(jié)果相符，也說明相同菌種不同的培養(yǎng)目的有不同的發(fā)酵溫度[20]。

由圖2可知，不同的初始pH對(duì)菌種的發(fā)酵結(jié)果有不同的影響，但是合適的初始pH可以縮短菌體的生長(zhǎng)周期，加快菌體的生長(zhǎng)繁殖速度[21]。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在6.0、6.5的弱酸性環(huán)境時(shí)，有效活菌數(shù)相對(duì)較低，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在7.0～8.0中性至弱堿環(huán)境時(shí)，有效活菌數(shù)增加，初始pH在7.5時(shí)，有效活菌數(shù)最高，為8.9×108 CFU/mL，由此可得出該膠凍樣芽孢桿菌適合在中性至弱堿性條件下生長(zhǎng)。

有研究表明，膠質(zhì)芽孢桿菌為好氧菌，且臨界氧濃度也很高，不同的轉(zhuǎn)速會(huì)有不同的通氣量，因此轉(zhuǎn)速也是影響膠凍樣芽孢桿菌菌量的重要因素[22]。從圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，膠凍樣芽孢桿菌的菌量隨著轉(zhuǎn)速的增加而增加，在200 r/min的轉(zhuǎn)速下，菌量最高，為9.1×108 CFU/mL，但是在200～220 r/min的轉(zhuǎn)速下，菌量隨著轉(zhuǎn)速的增加而降低，由此可以得出該膠凍樣芽孢桿菌的最適轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取蔗糖、酵母浸粉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表7，從正交試驗(yàn)的結(jié)果分析可知，影響膠凍樣芽孢桿菌發(fā)酵總菌數(shù)的因素由主到次依次為A（蔗糖）>B（酵母浸粉）>C（硫酸鎂）>D（磷酸氫二鉀）;培養(yǎng)基的最佳組合是A2B2C1D1，即蔗糖1.0%、酵母浸粉0.10%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.05%，并在最佳配比條件下進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，有效活菌數(shù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示總菌數(shù)平均為17.5×108 CFU/mL，比優(yōu)化前（16.5×108 CFU/mL）提高了6.1%。

2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵

在正交試驗(yàn)獲得的最佳培養(yǎng)基配方及單因素試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵工藝條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行50 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)以5%的接種量，pH 7.0～8.0，轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量為3.3 L/min，30 ℃培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為72 h，每12 h取一次樣，平板計(jì)數(shù)法測(cè)總菌數(shù)，油鏡下觀察芽孢大小狀態(tài)及脫落情況。由圖4可知，發(fā)酵至48 h有效活菌數(shù)最高，此后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，有效活菌數(shù)逐漸減少;在油鏡觀察下，在發(fā)酵24 h取樣鏡檢時(shí)，發(fā)現(xiàn)有菌體形狀大小整齊，有孢囊出現(xiàn)，48 h鏡檢時(shí)，55%左右的芽孢脫落，大小一致，同步率95%左右，因此，在此次試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，該膠凍樣芽孢桿菌在未補(bǔ)料且單批次發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵周期為48 h左右，如需一定的有效活菌數(shù)和芽孢率，還需要進(jìn)行補(bǔ)料試驗(yàn)或再次優(yōu)化培養(yǎng)條件，以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)需求。通過火焰光度計(jì)法再次測(cè)定優(yōu)化培養(yǎng)基后培養(yǎng)的該菌的解鉀量為231.5 mg/L，空白對(duì)照組解鉀量為1.5 mg/L，計(jì)算可得單位濃度內(nèi)該菌的解鉀率為23.02%，說明優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件后單位濃度內(nèi)的有效活菌數(shù)增多，所以再次測(cè)定單位濃度菌的解鉀率提高了。

2.5 田間試驗(yàn)

該研究通過田間試驗(yàn)觀察解鉀菌對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。8月1日進(jìn)行田間試驗(yàn)并觀察大白菜生長(zhǎng)期內(nèi)的生物學(xué)性狀，包括株高、單株重、球莖大小，10月31日采收，統(tǒng)計(jì)各小區(qū)產(chǎn)量，結(jié)果如表8所示。

根據(jù)表8中數(shù)據(jù)，分別對(duì)K0與K1、K2、K3在株高、單株重、球莖和小區(qū)產(chǎn)量方面進(jìn)行單樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，株高、單株重、球莖和小區(qū)產(chǎn)量均在0.05水平差異顯著。K1與K0相比，在株高、單株重、球莖和小區(qū)產(chǎn)量上均高于K0，可見K1中大白菜利用了硫酸鉀中的鉀素，提高了大白菜產(chǎn)量;K2比K1在株高、單株重、球莖和小區(qū)產(chǎn)量上均有所提高，且K1施加硫酸鉀，K2未施加硫酸鉀，說明K2施加的菌液有效促進(jìn)了土壤中鉀素的利用，使K2組中大白菜產(chǎn)量明顯提高。從表8還可以看出，K3在株高、單株重、球莖和小區(qū)產(chǎn)量上均比施加了硫酸鉀的K1有明顯提高，從而也可以得出K3中施加的菌液提高了土壤中鉀素的利用率;而且在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用火焰光度計(jì)也測(cè)出了該菌的解鉀量，綜上所述可以得出該膠凍樣芽孢桿菌具有解鉀功能，可以使土壤中不可被直接吸收利用的鉀素形態(tài)分解為大白菜可以吸收利用的速效鉀形態(tài)，使得大白菜在生長(zhǎng)過程對(duì)鉀素的需求得到滿足。

3 討論與結(jié)論

膠凍樣芽孢桿菌根據(jù)不同來源、不同貯藏條件及不同的研究目的，其發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件不同[23]，發(fā)酵結(jié)果也會(huì)存在一定的差異。該研究對(duì)膠凍樣芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的碳源、氮源種類進(jìn)行了單因素含量?jī)?yōu)化試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵最適溫度、最佳pH、最適轉(zhuǎn)速進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，并且依據(jù)單因素和發(fā)酵條件優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行了4因素3水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果顯示最佳培養(yǎng)基配比為蔗糖1.0%、酵母浸粉0.10%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.05%，發(fā)酵結(jié)果測(cè)得有效活菌數(shù)為17.5×108 CFU/mL，結(jié)果比優(yōu)化前提高了6.1%，且發(fā)酵結(jié)果比王金玲等[24]進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化后有效活菌數(shù)達(dá)到3.47×108 CFU/mL、吳向華等[22]對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化后有效活菌數(shù)達(dá)到9.58×108 CFU/mL都有一定程度的提高。

該研究選用培養(yǎng)基經(jīng)H2O2處理后測(cè)鉀的方法，經(jīng)測(cè)定該膠凍樣芽孢桿菌的解鉀率為12.06%，通過對(duì)其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，再次測(cè)定單位濃度內(nèi)該菌的解鉀率提高到23.02%，但與李海龍等[25]從土壤中分離的芽孢桿菌QL21的解鉀率為25.1%、趙飛等[26]從鉀礦物表面分離篩選出來的2株菌的解鉀率分別為29.8%、25.4%相比，該菌株的解鉀能力仍存在一定的差距，因此需要進(jìn)一步馴化、改良該菌株的解鉀能力;與賀積強(qiáng)等[27]從紫色土壤中分離篩選出的40株解鉀菌的解鉀率為0.66%～7.90%相比，該菌株的解鉀能力也具有較大的優(yōu)勢(shì)。由此可知，不同的菌株及處于不同生境的解鉀菌，因其生態(tài)演化機(jī)制不同，其解鉀能力也不同，解鉀量也是有限的，因此分離、篩選出高效解鉀菌株或者通過基因工程及誘變育種等技術(shù)手段獲得高繁殖力、高解鉀能力的優(yōu)良菌株是今后解鉀菌的研究方向之一。

綜上所述可知該膠凍樣芽孢桿菌具有一定的解鉀能力，如果實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)含有該菌的生物菌肥并將其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，為土壤提供充足的鉀素，滿足農(nóng)作物生長(zhǎng)，還需要進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化和改良該菌株。

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