濾紙片低溫干燥法保存絲狀真菌

摘要 將待保存菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板中央，在菌落周圍放置直徑3～5 mm的圓形無菌濾紙片，待真菌菌絲（孢子）長滿濾紙片后，將其取出放入無菌培養(yǎng)皿中，放置在底部盛有變色硅膠的干燥器中干燥3～5 d。將干燥后的帶菌濾紙片再轉(zhuǎn)入底部裝有無菌變色硅膠的無菌離心管中，用封口膜封口，放入透明冷凍盒內(nèi)-20 ℃保存。通過對保存周期為2～7年的15種真菌菌種共計260個菌株的存活情況及部分菌株的致病性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)保存的菌種存活率高，致病性和生物學(xué)特性不易退化。因此，濾紙片低溫干燥法保存絲狀真菌菌種，具有對設(shè)備要求簡單、占用空間小、保存容量大、保存時間長、工作效率高等優(yōu)點。

關(guān)鍵詞 菌種保存;濾紙片干燥;低溫;存活率;致病性;絲狀真菌

中圖分類號 R446.5? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）12-0005-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Drying Filter Paper at Low Temperature to Preserve Filamentous Fungi

YIN Liang-fen

（Experimental and Teaching Center of Crop Science in College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract The strains to be preserved were inoculated in the center of the PDA medium plate，a circular sterile filter paper with a diameter of 3 to 5 mm was placed around the colony.After the fungal hyphae （spores） were overgrown with the filter paper，took it out and put it into a sterile petri dish，and placed it in a desiccator filled with discolored silica gel at the bottom to dry for 3 to 5 days.Dried filter paper pieces were then put into centrifuge tubes with sterile silica gel at the bottom.After sealing with parafilm，the centrifuge tubes were finally put into a transparent freezer box and stored at -20 ℃.Through the detection of 260 isolates from 15 fungi species that preserved for 2-7 years，it was found that most of the detected strains maintained high survival rate and high virulence，and their biological characteristics do not degenerate easily.Using drying filter paper at low temperature to save filamentous fungi has the advantages such as requires simple equipments，occupies small space，has large storage capacity，keeps long storage time，and has high efficiency.

Key words Fungi strain conservation;Drying filter paper pieces;Low temperature;Survival rate;Pathogenicity;Filamentous fungi

菌種是生物學(xué)研究工作正常運行的物質(zhì)基礎(chǔ)。菌種質(zhì)量的高低決定著研究工作的成敗。為使自然界分離的優(yōu)質(zhì)菌株能夠保持原有的優(yōu)良性狀，最大限度地發(fā)揮作用，就需要盡可能完好地保存菌種。

微生物菌種的保存方法較多，各有優(yōu)缺點。大體上可分為4類，即繼代法、干燥法、低溫干燥法和超低溫冷凍法[1-3]。

繼代法，也叫定期移植法，即把菌種移植到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行保存的方法;該方法操作簡便、適用廣泛，不需要特殊設(shè)備;但缺點是微生物的生長和代謝活動幾乎沒有被抑制，因而保存時間較短，需要經(jīng)常進(jìn)行移植（90 d或者更短時間就需要移植一次），煩瑣費時;而且最致命的還是多次繼代培養(yǎng)后菌種的生物學(xué)特性退化，失去原有的優(yōu)良性狀[1-5]。干燥法是將菌種干燥后放置干燥環(huán)境保存的方法[1]，該方法保存時間長，但需要一直放置在干燥器中，保存容量小。低溫干燥法是將待保存真菌孢子懸浮在保護(hù)劑中，加干燥劑（如硅膠等）抽真空進(jìn)行干燥后，封口低溫保存[1];該保存方法菌種的存活率高、保存時間長、菌種穩(wěn)定性高，但操作煩瑣且需專用設(shè)備[1]。超低溫冷凍法是將菌種制成懸液，加入保護(hù)劑如甘油等分裝到離心管或者凍存管中，或者將菌種培養(yǎng)到濾紙片上，干燥后保存于-80 ℃的超低溫冰箱或者液氮（-196 ℃） 中;該方法保存時間長、菌種不易退化，但操作復(fù)雜，需特殊設(shè)備，液氮還需要定期添加[5-7]。83F82672-524C-4726-961C-C7B8E1E62CB2

此外，還有很多上述方法改進(jìn)的保存方法，如礦物油保存法[1，8]、Richards保存法[9]、濾紙低溫保存法[10-11]。

上述濾紙保存方法中，只利用真菌孢子進(jìn)行保存的方法適用范圍較窄，因為一些真菌菌株人工培養(yǎng)時不會產(chǎn)生孢子，或者即便產(chǎn)生分生孢子其量也非常小，無法利用該方法進(jìn)行保存;而利用菌絲（孢子）進(jìn)行保存的方法，雖然擴大了菌種的保存范圍，但由于信封與塑料密封袋的低密閉性，硅膠容易受潮，需要定期進(jìn)行更換，增加了工作量以及更換過程中菌種被污染的風(fēng)險。此外，信封或者硫酸紙袋都不透明，導(dǎo)致查找菌種不方便，而且活化菌種以及更換硅膠時需要逐層打開塑料密封袋、信封及硫酸紙袋，因而工作效率低。筆者介紹一種改進(jìn)的濾紙片低溫干燥保存法，即將帶菌濾紙片保存在添加有變色硅膠的透明離心管中，然后放置于透明冷凍盒內(nèi)進(jìn)行保存。經(jīng)過改進(jìn)后，上述保存方法中存在的問題都能得到很好的解決，從而能夠更好地保存菌種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種。褐腐病菌Monilinia fructicola、Monilia mumecola、Monilia yunnanensis、Monilinia linhartiana;實腐病菌 Diaporthe eres、Diaporthe fusicola;炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum acutatum;紋枯病菌Rhizoctonia solani;黃萎病菌 Verticillium dahliae;枯萎病菌 Fusarium oxysporum;小斑病菌 Bipolaris maydis;赤星病菌 Alternaria alternata;黑根霉 Rhizopus nigricans;犁頭霉 Absidia。

1.1.2 供試材料。單孔或雙孔文具用打孔器，孔徑4 mm左右;普通定性濾紙;1.5 mL或2.0 mL離心管（也可換為螺口、平底的指形管）;變色硅膠（規(guī)格型號HG/T 2765.4-2005，青島海洋化工有限公司）;普通玻璃干燥器;封口膜（PARAFILM）;透明塑料冷凍盒，規(guī)格不限。

1.2 試驗方法

1.2.1 變色硅膠干燥。將變色硅膠倒入玻璃培養(yǎng)皿或者瓷盤中，放入烘箱80 ℃干燥2 h至硅膠變?yōu)樯钏{(lán)色（干燥的變色硅膠呈深藍(lán)色，根據(jù)吸濕量的多少顏色會依次呈淡藍(lán)色、藍(lán)白色、藍(lán)紫色和粉紅色）后冷卻，然后倒入玻璃干燥器中備用。

1.2.2 變色硅膠滅菌。將變色硅膠倒入玻璃培養(yǎng)皿中，烘箱160 ℃滅菌2 h[1]，冷卻后加入無菌離心管中備用。

1.2.3 濾紙片及其滅菌。用打孔器將定性濾紙打成直徑3～5 mm的圓形濾紙片，放入玻璃培養(yǎng)皿中，121 ℃濕熱滅菌15 min后放超凈工作臺上備用。

1.2.4 帶菌濾紙片制作。將待保存的真菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）平板的中央，在接種點的周圍均勻擺放數(shù)個滅菌濾紙片，于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗培養(yǎng)（該條件為大部分絲狀真菌培養(yǎng)的最適條件）[1，12-13] 。培養(yǎng)過程中菌絲（孢子）生長到濾紙片上。濾紙片長滿菌絲（孢子）后取出，放置于無菌培養(yǎng)皿中。

1.2.5 帶菌濾紙片干燥。將放置有帶菌濾紙片的培養(yǎng)皿放入底部盛有干燥變色硅膠（呈深藍(lán)色）的干燥器內(nèi)，蓋上蓋子干燥3～5 d。

1.2.6 帶菌濾紙片保存。取1.5 mL的無菌離心管，于超凈工作臺酒精燈火焰旁將無菌變色硅膠加入離心管底部，然后將干燥好的帶菌濾紙片放入其中。用記號筆在離心管上寫上菌種名稱或編號及保存日期并用封口膜封口，最后放入透明冷凍盒中-20 ℃冰箱長期保存。

1.2.7 濾紙片低溫干燥法保存菌種的存活率測定。取低溫干燥法保存菌種濾紙片放置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)數(shù)天后檢查其存活率。存活率計算：同一種真菌移植的10片濾紙片中，能夠長出菌絲的濾紙片所占的百分比。如果同一種真菌保存有多個菌株且活化過其中的數(shù)個菌株，則存活率為活化過的所有菌株的平均值。

1.2.8 濾紙片低溫干燥法保存菌種的致病力測定。在活化好的待測菌種如褐腐病菌菌落邊緣用直徑為5 mm的打孔器打取菌絲塊，接種到該菌種的寄主（核果或仁果類水果）果實上（果實先用同樣的打孔器打孔，然后將菌絲塊菌絲面朝下塞到孔里），將接種果實放入底部鋪有濕紙巾的瓷盤里，用保鮮膜蓋上后放入光照培養(yǎng)箱中，（23±1） ℃[14-20]、光照條件12 h/12 h[12-15]培養(yǎng)1～7 d觀察發(fā)病情況并測量病斑大小，計算病斑擴展速率并評價該菌種的致病力。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶菌濾紙片制作

菌種移植培養(yǎng)時，先在PDA培養(yǎng)基平板中部放置數(shù)片無菌濾紙片，然后將待保存菌種的菌絲塊置于無菌濾紙片圍成的圓圈中央;如果接菌后想保存，則將濾紙片放置在菌落邊緣先端菌絲尚未到達(dá)的地方（圖1a），這樣菌絲往外生長擴展時就會長到濾紙片上。待整個濾紙片都長滿菌絲（孢子）時，帶菌濾紙片制作完成（圖1b）。

2.2 帶菌濾紙片干燥

將長滿菌絲（孢子）的帶菌濾紙片轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中（圖2a），然后放置于底部盛有干燥變色硅膠的玻璃干燥器中干燥3～5 d（圖2b）。

2.3 帶菌濾紙片保存

干燥后的帶菌濾紙片放入底部裝有無菌變色硅膠的1.5 mL無菌離心管，用封口膜（PARAFILM）封口（圖3a），后放入透明冷凍盒內(nèi)，于-20 ℃冰箱中長期保存（圖3b）。

2.4 變色硅膠不同濕度時顏色變化

變色硅膠吸濕后其顏色因濕度不同會發(fā)生改變。干燥狀態(tài)呈深藍(lán)色，此時濕度為0（圖4a）;濕度約為10%時呈淡藍(lán)色（圖4b）;濕度約為25%時呈藍(lán)白色（圖4c）;濕度約為40%時呈藍(lán)紫色（圖4d）;濕度約為50%時呈粉色（圖4e）。菌種保存過程中如果變色硅膠呈粉紅色，表明其吸濕性已經(jīng)很弱，無法繼續(xù)維持所保存菌種的干燥環(huán)境，需要進(jìn)行更換。83F82672-524C-4726-961C-C7B8E1E62CB2

2.5 保存菌種干燥狀態(tài)檢查 從冰箱中取出冷凍盒，直接通過冷凍盒的透明底部觀察離心管中硅膠顏色的變化（圖5），硅膠顏色為粉色時需要進(jìn)行更換。常使用的冷凍盒規(guī)格為100格（10行10列），利用該保存方法，100個菌種的干燥狀態(tài)檢查只需要幾秒鐘的時間。

2.6 濾紙片低溫干燥法保存菌種的存活率及生物學(xué)特性測定

該研究檢測了用濾紙片低溫干燥法保存的15種真菌260株菌株的存活率。結(jié)果表明，除水稻紋枯病菌外，其他菌種的存活率達(dá)80%以上，多數(shù)菌種的存活率達(dá)100%。從表1可以看出，人工培養(yǎng)能夠產(chǎn)生分生孢子或者菌絲濃密的菌種成活率最高，可達(dá)100%;而不產(chǎn)生分生孢子且菌絲稀疏的菌種存活率相對較低。水稻紋枯病菌保存了2次，2013年保存的菌種，2014—2017年活化成功，2018年未活化成功;2018年保存的菌種，2021年活化時存活率達(dá)70%。與水稻紋枯病菌相似，桃褐腐病菌M.yunnanensis在人工培養(yǎng)時不產(chǎn)生分生孢子，菌絲也較稀疏，2012—2020年共保存了281株來自不同地區(qū)及寄主上的該病原菌菌株，數(shù)年間活化過其中的45個菌株且全部存活。

另外還觀察了上述15種真菌活化后的生物學(xué)特性，如菌落生長特性、產(chǎn)孢特性等，發(fā)現(xiàn)與分離初期的菌種沒有太大差異。如褐腐病菌M.fructicola，保存4年的、來自桃的分離菌活化后與剛分離的、來自枇杷的分離菌一樣，在PDA培養(yǎng)基上菌落都呈褐色，產(chǎn)生大量分生孢子。且保存4年的桃分離菌菌落生長速率為14 mm/d，而剛分離的枇杷菌株為15 mm/d[14-20]，差異不大。

2.7 濾紙片低溫干燥法保存菌種的致病力測定 為測定該方法保存菌種的致病力是否存在退化現(xiàn)象，該研究挑選了3種培養(yǎng)性狀及保存年限不同的褐腐病菌與新分離菌株進(jìn)行致病力對比試驗。3個保存菌種分別是保存4年的M.fructicola、保存6年的M.mumecola、保存7年的M.yunnanensis。其中，M.fructicola人工培養(yǎng)時能產(chǎn)生大量分生孢子，存活率為100%;M.mumecola人工培養(yǎng)時不產(chǎn)生分生孢子，但菌絲濃密，存活率也為100%;M.yunnanensis人工培養(yǎng)時不產(chǎn)生分生孢子，菌絲稀疏，存活率為98%。新分離菌株為分離自枇杷的M.fructicola，3個保存菌種分離自桃。所以在枇杷及桃上都進(jìn)行了回接試驗。

接種結(jié)果如圖6所示，新分離菌M.fructicola在枇杷和桃上都能致病，產(chǎn)生褐色病斑及大量分生孢子（圖6a、e）;保存4年的M.fructicola菌在枇杷和桃上也產(chǎn)生褐色病斑及大量分生孢子（圖6b、f）;保存6年的M.mumecola菌（圖6c、g）及保存7年的M.yunnanensis菌（圖6d、h）也產(chǎn)生差不多大小的褐色病斑，但分生孢子相對較少，這是由于不同種之間的差異造成的。

同樣是屬于M.fructicola的菌株，來自枇杷的新分離菌株接種枇杷時，病斑擴展速度為17.4 mm/d;而保存4年，來自桃的菌株則為15.9 mm/d;但接種桃時，來自枇杷的新鮮菌株病斑的擴展速度為12.8 mm/d;來自桃、保存4年的菌株病斑擴展速度卻為14 mm/d[14-20]。這些數(shù)據(jù)說明菌種的致病力與保存年限沒有直接關(guān)系，也就是說該方法保存的菌種其致病力沒有明顯退化。

3 討論與結(jié)論

以前的濾紙片保存方法是讓菌絲（孢子）長在濾紙上，干燥后放入硫酸紙袋中，外面用塑料密封袋封口或者在硫酸紙袋和塑料密封袋中間加一個裝有干燥變色硅膠的信封，放入-20 ℃冰箱進(jìn)行保存。該方法的優(yōu)點是保存的菌種范圍廣且保存時間長，缺點是硫酸紙袋和塑料密封袋的密閉性較差，會導(dǎo)致菌種受潮因而保存時間不長，硅膠容易受潮，需要定期進(jìn)行更換，增加了工作量以及更換過程中菌種被污染的風(fēng)險。此外，由于信封或者硫酸紙袋都不透明，導(dǎo)致查找菌種、活化菌種以及更換硅膠時需要逐層打開塑料密封袋、信封及硫酸紙袋，工作效率低下。

該研究介紹的濾紙片低溫干燥法保存真菌菌種，利用離心管作為保存容器進(jìn)行菌種保存。離心管密閉性高，又添加了硅膠干燥劑，能長時間為所保存菌種提供干燥的環(huán)境，菌種在這種條件下代謝極低，因而保存時間長，且其生物學(xué)特性不易發(fā)生退化。同時，離心管和冷凍盒均為透明，通過冷凍盒蓋子即可方便快捷地查找目標(biāo)菌種;而從透明冷凍盒底部及四周可見離心管中變色硅膠的顏色，據(jù)此可判斷所保存菌種的干燥狀態(tài)以及是否需要更換變色硅膠等。離心管的高密封性可有效隔絕外界濕氣，因此不需要經(jīng)常更換硅膠。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院作物學(xué)實驗教學(xué)中心用此法所保存的數(shù)千份菌種中，有數(shù)百份為保存10年以上的菌種，僅有個別菌種其離心管中的硅膠變?yōu)榉凵?，需要更換，其他絕大多數(shù)都不需要更換。另外，此法活化菌種及更換變色硅膠都比較方便，只需要打開離心管蓋子進(jìn)行操作即可。

利用濾紙片低溫干燥法進(jìn)行保存時，如果一次性保存的菌種數(shù)量比較大，通常先將濾紙片圍成圓圈放置在培養(yǎng)基平板上，再將菌塊接到圓圈中央，這樣同一把鑷子消毒后可以放置多皿濾紙片，從而提高工作效率。菌種培養(yǎng)過程中如果想保存，則需要將濾紙片放置在菌落邊緣先端菌絲尚未到達(dá)的培養(yǎng)基上，這樣菌絲才能長到濾紙片上;如果菌落已經(jīng)長滿培養(yǎng)皿或者菌落邊緣快要到達(dá)培養(yǎng)皿邊緣則不建議進(jìn)行菌種保存，此時無法保證足夠量的菌絲（孢子）長到濾紙片上。對于菌絲特別稀疏的菌種進(jìn)行保存，可先將無菌濾紙片用滅菌的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基，即PDA培養(yǎng)基去掉瓊脂）泡一下，濾紙片上擴展的菌絲（孢子）量會增加。保存過程中添加到離心管里的滅菌硅膠粒需要使用新的，而干燥用的硅膠粒則可以反復(fù)使用。

濾紙片低溫干燥保存方法中，2013年保存的水稻紋枯病菌于2018年活化時其存活率為0，第2次保存的存活率也不高。而同樣是人工培養(yǎng)時不產(chǎn)生孢子或者產(chǎn)生極少量孢子，且菌絲也稀疏的褐腐病菌M.yunnanensis和M.linhartiana卻能達(dá)到80%以上的存活率。尤其是M.yunnanensis菌種，從2012年開始華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院作物學(xué)實驗教學(xué)中心共分離保存過281株來自不同寄主及地區(qū)的菌株，且活化過其中的45個菌株，沒有出現(xiàn)過1例存活率為0的情況。水稻紋枯病菌存活率低下的原因不明。木瓜褐腐病菌中有些菌株的菌絲非常稀疏，濾紙片上幾乎看不見菌絲，導(dǎo)致保存的菌種存活率低下。83F82672-524C-4726-961C-C7B8E1E62CB2

雖然利用濾紙片低溫干燥保存方法出現(xiàn)水稻紋枯病菌5年后存活率為0的情況，但相比華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院作物學(xué)實驗教學(xué)中心同時使用過的繼代保存法和石蠟油保存法，該方法的優(yōu)勢仍很明顯。濾紙片保存的所有菌種同時都進(jìn)行過PDA斜面4 ℃冰箱保存，除黑根霉、犁頭霉、褐腐病菌M.fructicola 3個菌種2年后仍能存活外，其他菌種尤其水稻紋枯病菌存活周期短的僅90 d，長的能達(dá)1年以上。而利用該方法保存，即便2018年活化時存活率為0的水稻紋枯病菌，其在2014—2017年卻每年都能活化成功。此外，繼代保存的菌種還會出現(xiàn)生物學(xué)特性退化的情況，如利用繼代法保存的棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌等多次繼代保存后會出現(xiàn)不產(chǎn)生分生孢子的情況。而石蠟油保存的菌種，雖然5年以后仍能存活，但放冰箱里只能直立，占用空間較大，且活化時菌落帶有黏性，碰過石蠟油的接種針在酒精燈上灼燒滅菌時會發(fā)出炸裂聲，油花四濺，同時散發(fā)出石蠟油的異味。

致病力測定試驗可以看出，同樣的M.fructicola菌種，保存4年的菌種致病力與剛分離的菌種沒有區(qū)別，說明該保存方法能夠很好地保存菌種的優(yōu)良性狀，菌種的生物學(xué)特性不易退化。對于人工培養(yǎng)時不產(chǎn)生孢子、菌絲稀疏的菌種，要解決成活率低下的問題，只需要在菌種保存時加大保存濾紙片的數(shù)量，同時活化時1次取2張或者3張濾紙片進(jìn)行活化即可。

濾紙片低溫干燥保存方法有效規(guī)避了繼代保存法多次繼代培養(yǎng)而導(dǎo)致的菌種活力下降以及冷凍保存法需要特殊設(shè)備且費用高昂的問題。該保存方法中濾紙片放置在離心管中保存，不僅占用空間小，保存容量大，一個普通冰箱的冷凍室就能夠輕松保存數(shù)千份菌種。此外，菌種取用方便，需要時找到所需菌種打開封口，取出1片濾紙片進(jìn)行活化，余下的菌種封口放回去繼續(xù)保存。

綜上所述，該保存方法具有對設(shè)備要求簡單、占用空間小、保存容量大、保存時間長、取用方便及菌種成活率高、致病力強 、生物學(xué)特性不容易退化、工作效率高等優(yōu)點，值得推廣應(yīng)用。

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