基于二氨基馬來(lái)腈快速識(shí)別ClO-的熒光探針及應(yīng)用

王 超， 唐宏偉， 湯立軍， 邊延江

(渤海大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，功能有機(jī)分子實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013)

在日常生活中,次氯酸(HClO)常用于家用漂白劑、飲用水消毒劑等[1-3].作為重要的活性氧(ROS)物種之一，HClO在許多病理和生物過(guò)程中起著重要作用[4].在生理環(huán)境中，正常濃度的HClO或次氯酸根(ClO-)可作為免疫系統(tǒng)的抗菌劑[5]，但是過(guò)量的HClO/ClO-會(huì)引起許多疾病，如關(guān)節(jié)炎、腎臟疾病、肺損傷、心血管疾病、哮喘甚至癌癥等[6-8].因此，生物細(xì)胞內(nèi)HClO/ClO-的識(shí)別和含量測(cè)定對(duì)于醫(yī)療診斷等具有重要意義.

目前，電化學(xué)分析法、化學(xué)發(fā)光法和熒光分析法已被成功應(yīng)用于次氯酸的檢測(cè)，其中基于熒光探針的熒光分析法因其具有操作簡(jiǎn)便、響應(yīng)迅速、選擇性和靈敏度高、原位分析和活細(xì)胞成像等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[9-12].已經(jīng)開(kāi)發(fā)的用于檢測(cè)ClO-的熒光探針響應(yīng)機(jī)制多是利用特定的官能團(tuán)與HClO發(fā)生反應(yīng)[13-15]，這些探針在選擇性和靈敏度方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的特性，但存在合成過(guò)程復(fù)雜或pH適用范圍受限的問(wèn)題.本文中，筆者選擇二氨基馬來(lái)腈作為反應(yīng)官能團(tuán)對(duì)ClO-進(jìn)行識(shí)別[16-17]，該探針合成簡(jiǎn)單，且對(duì)ClO-表現(xiàn)出較靈敏的識(shí)別效果和較快的反應(yīng)速度，水溶性較好，pH適用范圍較寬(6～10)，在水樣中的ClO-檢測(cè)方面有較好的應(yīng)用效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

400 MHz核磁共振儀(美國(guó)Agilent 公司)；F-4700熒光分光光度計(jì)(日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)那珂事業(yè)所)；PHS-25型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器有限公司).

對(duì)羥基苯甲醛、碘甲烷、4-甲基吡啶、六次甲基四胺(HMTA)、二氨基馬來(lái)腈、三氟乙酸、無(wú)水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、各種陰離子化合物和活性物質(zhì)，所用藥品和試劑均為市售分析純，無(wú)需進(jìn)一步純化.各種陰離子化合物和活性物質(zhì)均用二次蒸餾水配置.

探針L標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：稱(chēng)取4.57 mg探針L用DMSO溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度線(xiàn)并搖勻，得到1 mmol/L的探針L標(biāo)準(zhǔn)溶液;再用移液器吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL容量瓶中，用V(DMF)∶V(H2O)=3∶7的溶液定容至刻度線(xiàn)并搖勻，得到10 μmol/L的探針L標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.2 探針L的合成

探針L的合成路線(xiàn)如圖1所示.首先，利用對(duì)羥基苯甲醛和1,4-二甲基吡啶碘化物反應(yīng)得到化合物1，化合物1再經(jīng)由Duff反應(yīng)得到化合物2，最后，化合物2與二氨基馬來(lái)腈反應(yīng)得到目標(biāo)探針L.

圖1 探針L的合成路線(xiàn)Fig.1 Synthetic Route of Probe L

1.2.1 化合物1的合成及表征

將1.22 g對(duì)羥基苯甲醛(10 mmol)和2.35 g 1,4-二甲基吡啶碘化物(10 mmol)溶于40 mL無(wú)水乙醇中，加入2滴哌啶后回流16 h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾粗產(chǎn)物，用冰乙醇洗滌3次，得到紅色固體(化合物1)2.88 g(8.5 mmol)，產(chǎn)率為85 %.1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：8.67(s,2H),8.03(s,2H),7.87(d,J=13.9 Hz,1H),7.53(d,J=5.5 Hz,2H),7.14(d,J=14.0 Hz,1H),6.74(d,J=5.3 Hz,2H),4.15(s,3H).13CNMR(101 MHz,DMSO-d6)δ：163.09,153.14,144.43,141.66,130.57,124.48,122.28,117.99,116.79,46.36.

1.2.2 化合物2的合成及表征

將680 mg化合物1(2 mmol)和450 mg六次甲基四胺(3.2 mmol)溶于15 mL三氟乙酸中，TLC薄層板跟蹤反應(yīng)，加熱至反應(yīng)完全，待反應(yīng)物冷卻至室溫后，加入25 mL 1 mol/L的HCl溶液,攪拌至有沉淀物析出，過(guò)濾后得到405 mg黃色粉末狀化合物2(1.1 mmol)，產(chǎn)率為55 %[18].1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:11.43(s,1H),10.34(s,1H),8.83(d,J=6.4 Hz,2H),8.17(d,J=6.5 Hz,2H),8.03(d,J=16.4 Hz,1H),8.01(d,J=6 Hz,1H),7.92(d,J=8.7 Hz,1H),7.40(d,J=16.4 Hz,1H),7.15(d,J=8.6 Hz,1H),4.23(s,3H).13CNMR(101 MHz,DMSO-d6)δ：190.73,162.73,153.02,145.42,140.59,135.73,129.19,127.27,123.61,123.15,121.89,118.72,47.15.HRMS(ESI+):m/zCalcd.for C15H14NO2[M-I]+240.101 9,found:240.101 8.

1.2.3 探針L的合成及表征

向裝有攪拌子的50 mL圓底燒瓶中加入367 mg化合物2(1 mmol)和108 mg二氨基馬來(lái)腈(1 mmol)，再加入7 mL無(wú)水乙醇回流4 h，待反應(yīng)物冷卻至室溫后，過(guò)濾，用冰乙醇洗滌3次，干燥后得到320 mg黃色固體粉末(探針L)(0.7 mmol)，產(chǎn)率為70 %.1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：11.15(s,1H),8.82(d,J=6.6 Hz,2H),8.58(s,1H),8.54(s,1H),8.14(d,J=6.6 Hz,2H),8.06(s,2H),7.91(d,J=16.3 Hz,1H),7.68(d,J=6.8 Hz,1H),7.48(d,J=16.3 Hz,1H),7.08(d,J=8.5 Hz,1H),4.24(s,3H).13CNMR(101 MHz,DMSO-d6)δ：160.00,152.73,151.09,145.09,140.26,133.70,128.04,126.84,126.54,123.01,122.02,121.17,117.18,114.48,113.91,103.23,46.83.HRMS(ESI+):m/zCalcd.for C19H16N5O[M-I]+330.134 9,found:330.135 4.

1.3 探針L對(duì)ClO-的光譜測(cè)試

熒光光譜的選擇、滴定、競(jìng)爭(zhēng)、pH、時(shí)間掃描和應(yīng)用測(cè)試均吸取2 mL探針L標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μmol/L)，向其中加入所需濃度的其他陰離子化合物或活性物質(zhì)后進(jìn)行熒光光譜測(cè)試.其中,pH響應(yīng)實(shí)驗(yàn)是吸取2 mL用酸度計(jì)分別調(diào)配好的不同pH的探針L溶液.用于光譜測(cè)試的激發(fā)波長(zhǎng)均為455 nm.

1.4 探針L檢測(cè)實(shí)際水樣品中的ClO-

用V(DMF)∶V(水樣品)=3∶7的溶液配制10 μmol/L的測(cè)試液，并加入0～650 μmol/L的ClO-，通過(guò)監(jiān)測(cè)探針L在585 nm處的熒光強(qiáng)度變化，得到熒光強(qiáng)度與加標(biāo)濃度之間的關(guān)系.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針L對(duì)ClO-的選擇性測(cè)試

在V(DMF)∶V(H2O)=3∶7,pH=6.71的混合溶液中測(cè)試探針L(10 μmol/L)對(duì)各種陰離子，ROS，活性氮(RNS)的響應(yīng)情況，分別加入65倍的陰離子，ROS/RNS(ClO-，SCN-，S2O32-，N3-，AcO-，NO2-，I-，HSO3-，C2O42-，SO42-，CN-，Br-，Cl-，F(xiàn)-，H2O2，ONOO-，NO·，ROO·，·OH，1O2)后其熒光光譜如圖2所示.可以看出，探針L在630 nm處幾乎沒(méi)有熒光發(fā)射，加入ClO-后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移至585 nm，ONOO-和CN-的加入產(chǎn)生了較小的熒光強(qiáng)度變化，而其他物質(zhì)的加入并未導(dǎo)致明顯的熒光強(qiáng)度變化，表明探針L對(duì)ClO-的選擇具有較好的專(zhuān)一性.

圖2 加入各種陰離子或活性物質(zhì)后 探針L的熒光光譜變化Fig.2 Fluorescence Spectral Changes of Probe L with Adding of Various Anions or Active Substances

圖3 加入不同濃度ClO-后探針L的熒光光譜變化Fig.3 Fluorescence Spectral Changes of Probe L with Adding Different Concentrations of ClO-

2.2 探針L對(duì)ClO-的熒光滴定實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行探針L識(shí)別ClO-的滴定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示.可以看出，隨著ClO-濃度的不斷增大，探針L的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在加入65倍的ClO-后達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài).因此，測(cè)試出探針L對(duì)ClO-的識(shí)別在ClO-濃度達(dá)到650 μmol/L時(shí)飽和，且熒光強(qiáng)度與ClO-濃度(0～650 μmol/L)之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系(R2=0.993 28).如圖4所示，根據(jù)檢測(cè)限(LOD)計(jì)算公式:LOD=3σ/k[19-20]，計(jì)算得到探針L對(duì)ClO-的檢測(cè)限為1.03 μmol/L.表明探針L對(duì)ClO-的識(shí)別具有較高的靈敏度.

2.3 其他物質(zhì)對(duì)探針L的干擾性測(cè)試

對(duì)探針L進(jìn)行了抗干擾實(shí)驗(yàn).首先，在探針L的混合溶液中分別加入65倍的陰離子，ROS/RNS(ClO-，SCN-，S2O32-，N3-，AcO-，NO2-，I-，HSO3-，C2O42-，SO42-，CN-，Br-，Cl-，F(xiàn)-，H2O2，ONOO-，NO·，

ROO·，·OH，1O2)，再分別加入等量的ClO-進(jìn)行熒光光譜測(cè)試，結(jié)果如圖5所示.通過(guò)比較585 nm處的熒光強(qiáng)度變化可以看出，在其他物質(zhì)存在的情況下，探針L對(duì)ClO-的響應(yīng)不受影響.因此得出結(jié)論，探針L對(duì)ClO-的檢測(cè)具有出色的抗干擾能力，可作為單一性識(shí)別ClO-的探針.

圖4 探針L的熒光強(qiáng)度與ClO-濃度 之間的線(xiàn)性關(guān)系Fig.4 Linear Relationship of Fluorescence Intensity of Probe L with ClO- Concentrations

圖5 加入干擾物及再分別加入ClO-后 探針L熒光強(qiáng)度的對(duì)比結(jié)果Fig.5 Comparison Results of Fluorescence Intensity of Probe L with Adding Interfering Substance and Followed by Adding ClO-

2.4 探針L識(shí)別ClO-的pH響應(yīng)實(shí)驗(yàn)

測(cè)試了探針L在不同pH值下對(duì)ClO-的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖6所示.可以看出,探針L在不同pH值下的混合溶液中均表現(xiàn)出弱熒光.探針L中加入ClO-后，當(dāng)2≤pH<6或pH>10時(shí)，探針L的發(fā)光性能受到pH影響，而pH為6～10時(shí)，熒光強(qiáng)度保持平穩(wěn)，說(shuō)明酸性和強(qiáng)堿性條件會(huì)影響探針L對(duì)ClO-的響應(yīng)，即探針L識(shí)別ClO-的適用條件為中性或弱堿性.表明探針L在檢測(cè)生物環(huán)境中的ClO-方面有潛在應(yīng)用.

圖6 不同pH，探針L與ClO-結(jié)合后的熒光強(qiáng)度變化Fig.6 Fluorescence Intensity Changes of Probe L Combined with ClO- at Different pH

圖7 探針L與ClO-作用后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化情況Fig.7 Changs of Fluorescence Intensity with Time After the Reaction of Probe L with ClO-

2.5 探針L對(duì)ClO-的響應(yīng)時(shí)間測(cè)試

探針L對(duì)ClO-響應(yīng)時(shí)間的測(cè)試結(jié)果如圖7所示.可以看出，探針L中加入65倍的ClO-后，探針L的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)，且在200 s時(shí)熒光強(qiáng)度基本平穩(wěn)，說(shuō)明探針L與ClO-在200 s時(shí)達(dá)到完全響應(yīng).

2.6 探針L識(shí)別ClO-的機(jī)理

圖8 探針L對(duì)ClO-的響應(yīng)機(jī)理Fig.8 The Response Mechanism of Probe L to ClO-

2.7 探針L檢測(cè)水樣中的ClO-

為了研究探針L在真實(shí)環(huán)境中的實(shí)用性，在DMF-水樣的溶液中，采用加標(biāo)的方法監(jiān)測(cè)探針L在585 nm處的熒光強(qiáng)度，得到熒光強(qiáng)度與添加ClO-的濃度(440～490 μmol/L)之間的良好線(xiàn)性關(guān)系(R2>0.99)(圖9).如表1所示，對(duì)自來(lái)水樣品中ClO-的檢測(cè)，其回收率為100.2 %～100.3 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=3)為0.22 %～0.44 %;對(duì)飲用水樣品中ClO-檢測(cè)的回收率為99.8 %～100.4 %，RSD為0.12 %～0.37 %.因此，探針L可應(yīng)用于實(shí)際水樣品中ClO-的檢測(cè)并具有較好的檢測(cè)效果.

圖9 熒光強(qiáng)度與ClO-加標(biāo)濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系Fig.9 Linear Relationship Between Fluorescence Intensity and Spiked Concentrations of ClO-

表1 探針L檢測(cè)水樣品中ClO-的加標(biāo)回收率結(jié)果Tab.1 Results of Spiked Recovery of ClO-in Water Samples Detected by Probe L

3 結(jié) 論

基于二氨基馬來(lái)腈合成了熒光探針L，其合成過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)ClO-的識(shí)別具有較高的靈敏度，反應(yīng)速度較快(200 s)，檢測(cè)限較低(1.03 μmol/L)，pH適用范圍較廣(6～10)，且不受其他物質(zhì)(ClO-，SCN-，S2O32-，N3-，AcO-，NO2-，I-，HSO3-，C2O42-，SO42-，CN-，Br-，Cl-，F(xiàn)-，H2O2，ONOO-，NO·，ROO·，·OH，1O2)的干擾，具有高選擇性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證明了探針L能應(yīng)用于真實(shí)水樣中ClO-的檢測(cè).此外，探針L識(shí)別ClO-的機(jī)理為利用ClO-的氧化性使探針L在反應(yīng)過(guò)程中釋放出相應(yīng)的醛，通過(guò)熒光增強(qiáng)而高選擇性識(shí)別ClO-.研究表明該探針在監(jiān)測(cè)生物環(huán)境中的ClO-濃度方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值.