20 ℃和25 ℃條件下秀麗隱桿線蟲衰老過程中磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究

李佳淇，吳 真，張旭敏

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200438； 2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

在衰老過程中，生物體會經(jīng)歷多種多樣的結(jié)構(gòu)與功能的變化，主要包括運(yùn)動活動減少、整體代謝率和認(rèn)知功能降低、消化功能受損和DNA損傷增加等[1]。延緩這些變化在衰老相關(guān)研究中至關(guān)重要，可以為延長人類的壽命提供理論基礎(chǔ)。秀麗隱桿線蟲(下面簡稱線蟲)是生命科學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)研究中重要的模式生物之一，生命周期較短、易飼養(yǎng)且繁殖快，并且與人類基因的同源性達(dá)到80%，衰老相關(guān)的信號通路也都在線蟲中實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)的研究，因此，它是研究衰老的一個(gè)重要模型。對細(xì)胞中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行表征，包括蛋白質(zhì)在任何時(shí)期的表達(dá)、功能、結(jié)構(gòu)、修飾和相互作用是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要內(nèi)容[2]。借助蛋白質(zhì)組學(xué)手段，可以系統(tǒng)地對線蟲進(jìn)行大規(guī)模研究，這對于衰老相關(guān)研究有重要意義。Walther等[3]通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在線蟲的長壽突變體中，分子伴侶相關(guān)的蛋白質(zhì)聚集增加，說明衰老過程中發(fā)生異常蛋白質(zhì)隔絕以維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。Narayan等[4]采用SILAC(Stable-Isotope Labelling by Amino Acids in cell culture)方法進(jìn)行線蟲衰老過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，比較不同時(shí)期的蛋白質(zhì)豐度變化，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)顯著變化的代謝過程，驗(yàn)證了在衰老過程中受到損害的過氧化物酶體的運(yùn)輸過程。

線蟲的壽命能夠被溫度顯著影響[5]，在20 ℃下培養(yǎng)，線蟲平均生存21天，在25 ℃下培養(yǎng)平均壽命可減少10天[6]。蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，對于蛋白質(zhì)行駛功能十分重要[7-8]，在調(diào)節(jié)高溫環(huán)境下線蟲晚期生命活動中也起到重要作用[9-10]。常溫和高溫下的線蟲的衰老機(jī)制尚不清楚，本課題組前期的研究表明，線蟲在正常溫度(20 ℃)和高溫(25 ℃)下的衰老過程中，激酶CK2，MAPK和CAMK2也許起到重要作用，并且驗(yàn)證了磷酸化蛋白GTBP-1能夠在這兩個(gè)溫度條件下調(diào)節(jié)線蟲壽命[9]。為了獲得更多的線蟲衰老過程中的磷酸化組學(xué)信息，我們嘗試使用基于DIA(Data Independent Acquisition)的非標(biāo)記定量方法[11]，對常溫和高溫培養(yǎng)條件下線蟲衰老過程中的磷酸化組學(xué)變化進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N2線蟲購買于CGC(Caenorhabditis Genetics Center)官網(wǎng)，Amicon Ultra-4(30-kDa cutoff)Filter來自Merck-Millipore(Bedford, MA， USA)，TiO2購于GL Sciences(Tokyo, Japan)，乳酸購于Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA)。

1.2 樣品預(yù)處理

收集使用NGM(Nematode Growth Medium)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的線蟲[9]，清洗3次后超聲提取蛋白質(zhì)。使用FASP(Filter Aided Proteome Preparation)方法[12]，胰酶酶切蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽段。采用基于TiO2的添加乳酸試劑的方法富集磷酸化肽段[13]，分成兩部分，一部分用于數(shù)據(jù)依賴性采集(Data Dependent Acquisition, DDA)模式建庫，一部分用于數(shù)據(jù)非依賴型采集(Data Independent Acquisition, DIA)搜庫。

1.3 DDA樣品的預(yù)分離

將各個(gè)樣品中酶切后肽段各取90 μg混合后使用堿性反相色譜預(yù)分離。使用的色譜柱是Gemini-NX C18反相色譜柱(內(nèi)徑4.6 mm，柱長250 mm，粒徑3 μm)，色譜設(shè)備是Thermo Fisher Scientific的Ultimate 3000系列。

液相色譜流動相A液為10 mmol/L碳酸氫銨，B液為10 mmol/L碳酸氫銨，80%乙腈。使用40 min梯度進(jìn)行色譜分離，分別收集每分鐘的流出液，正交法混為10個(gè)樣品，將混好的樣品分裝凍干后保存在-80 ℃等待后續(xù)分析。

1.4 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜儀采用搭載了EASY-nLC 1200液相系統(tǒng)的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀。樣品分析使用單柱系統(tǒng)，為實(shí)驗(yàn)室填裝的C18色譜柱(內(nèi)徑75 μm×柱長25 cm，Reprosil-Pur 120 C18-AQ填料)。流動相A為水，流動相B為乙腈。洗脫梯度為90 min: 0～3 min，2%～5%緩沖液B，200 μL/min；3～68 min，5%～40%緩沖液B，200 μL/min；68～78 min，40%～60%緩沖液B，200 μL/min；78～80 min，60%～100%緩沖液B，200 μL/min；80～90 min，保持100%緩沖液B，200 μL/min。

用于建庫樣品的質(zhì)譜分析是數(shù)據(jù)依賴型采集(DDA)，一級的分辨率是60 k，二級是30 k，循環(huán)時(shí)間是3 s，采用的碎裂方式是HCD(Higher Energy Collisional Dissociation)。實(shí)驗(yàn)組樣品采用數(shù)據(jù)非依賴型采集(DIA)。一級的分辨率是60 k，二級的分辨率是15 k。一個(gè)分析中設(shè)置了4個(gè)一級全掃描，每個(gè)全掃描后設(shè)置了15個(gè)二級掃描。設(shè)置了可變窗口。

1.5 DDA數(shù)據(jù)分析

用于建庫的DDA數(shù)據(jù)原始文件導(dǎo)入Proteome Discoverer(2.4版，Thermo Fisher Scientific)中的Mascot服務(wù)器(2.7版，Matrix Science, London, U.K.)[14]。從Uniprot上下載線蟲數(shù)據(jù)庫(20200321，26 747個(gè)序列)。數(shù)據(jù)搜索參數(shù)為: 酶設(shè)置為Trypsin/P；最高2個(gè)漏切位點(diǎn)；一級質(zhì)譜母離子偏差為10×10-6，二級質(zhì)譜子離子偏差為0.05 Da；半胱氨酸殘基上的丙酮酰胺化設(shè)置成固定參數(shù)；甲硫氨酸氧化，蛋白質(zhì)N端乙?；K氨酸/絲氨酸/酪氨酸磷酸化設(shè)置成可變修飾。使用ptmRS模塊對磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行打分，篩選磷酸化位點(diǎn)可能性大于等于0.75的肽段匹配圖譜(Peptide-Spectrum Matches, PSM)，然后導(dǎo)入Skyline建立譜圖庫。

1.6 DIA數(shù)據(jù)分析

DIA數(shù)據(jù)的分析在Skyline軟件中完成，參數(shù)設(shè)置如下: 在肽段設(shè)置中，Trypsin作為蛋白酶；最多允許兩個(gè)錯(cuò)切位點(diǎn)；IRT(11條)作為保留時(shí)間預(yù)測；時(shí)間窗口是2 min；譜圖庫為Mascot搜索的DDA質(zhì)譜結(jié)果創(chuàng)建；修飾的選擇與DDA搜庫中的相同；最大可變修飾是6。在離子對的設(shè)置中，母離子的電荷數(shù)為2，3，4，5和6；離子電荷數(shù)是1和2；離子類型包括b，y，p；子離子選擇設(shè)置成從離子3到最后一個(gè)離子-1；0.02質(zhì)荷比作為離子匹配耐受性；儀器最大質(zhì)荷比為2 000，最小質(zhì)荷比為300。對于Skyline導(dǎo)出的數(shù)據(jù)也進(jìn)行進(jìn)一步篩選: 只保留precursor離子；刪除鑒定到多種漏切位點(diǎn)的肽段；刪除3組重復(fù)中兩組以上沒有鑒定信息的肽段；刪除鑒定到的帶有氧化或乙酰化修飾的肽段。磷酸化肽段和蛋白鑒定結(jié)果、差異表達(dá)結(jié)果以及所有相關(guān)原始數(shù)據(jù)上傳到iProX數(shù)據(jù)庫，ID為IPX0003177000。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程

收集在20 ℃和25 ℃培養(yǎng)條件下第1天(青年)、第5天(中年)、第10天(老年)線蟲成蟲樣品，進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，本次實(shí)驗(yàn)采用了3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，具體分析流程見圖1。不同線蟲樣品收集后分成兩部分，一部分用于DIA搜庫，磷酸化富集后質(zhì)譜分析，另一部分用于DDA建庫，預(yù)分后磷酸化富集然后質(zhì)譜分析。兩個(gè)部分的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Proteome Discoverer(2.4版本)搜庫，用于建庫的數(shù)據(jù)選取位點(diǎn)可能性打分，得分大于等于0.75的磷酸化肽段導(dǎo)入Skyline建庫，然后導(dǎo)入另一部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行DIA搜庫。Skyline導(dǎo)出的數(shù)據(jù)去冗余后導(dǎo)入到圖中所示的生物信息學(xué)軟件中分析。

圖1 線蟲衰老過程中磷酸化組學(xué)分析流程Fig.1 The workflow of phosphoproteomic study on C.elegans during aging process

2.2 磷酸化蛋白質(zhì)組的定性與定量分析

共6 624條非冗余的磷酸化肽段被定量到，這些肽段含有6 910個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對應(yīng)2 997個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。對于磷酸化肽段的位點(diǎn)分析，6 077條(91.74%)磷酸化肽段上有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)，526條(7.94%)磷酸化肽段上有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)；還有21條(0.32%)磷酸化肽段帶有3個(gè)或4個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖2(a)所示，見第298頁)。此外，在檢測到的6 910個(gè)磷酸化位點(diǎn)中，有5 831個(gè)(84.4%)發(fā)生在絲氨酸(pS)上，有941個(gè)(13.6%)發(fā)生在蘇氨酸(pT)上，有138個(gè)(2.0%)發(fā)生在酪氨酸(pY)上。

圖2 線蟲總磷酸化蛋白質(zhì)組的初步定量分析Fig.2 Preliminary quantitative analysis of phosphoproteomics in C.elegans(a) 鑒定到的磷酸化肽段含有不同數(shù)目磷酸化位點(diǎn)分布情況；(b) 總磷酸化肽段上磷酸化位點(diǎn)種類；(c) 正常溫度下，磷酸化水平發(fā)生顯著變化的磷酸化位點(diǎn)；(d) 高溫下，磷酸化水平發(fā)生顯著變化的磷酸化位點(diǎn)分布；(e) 高溫與正常溫度比較，發(fā)生顯著變化的磷酸化位點(diǎn)。

在正常溫度(20 ℃)培養(yǎng)條件下，磷酸化水平顯著變化的磷酸化肽段(Fold Change≥2或≤0.5，P≤0.01)有478條，對應(yīng)421個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)，501個(gè)磷酸化位點(diǎn)(pS為411個(gè)，pT為80個(gè)，pY為10個(gè))。在高溫(25 ℃)培養(yǎng)條件下，衰老過程中磷酸化水平發(fā)生顯著變化的有628條磷酸化肽段，對應(yīng)530個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)，664個(gè)磷酸化位點(diǎn)(pS為516個(gè)，pT為123個(gè)，pY為25個(gè))。高溫(25 ℃)與正常溫度(20 ℃)培養(yǎng)相比，磷酸化水平發(fā)生顯著變化的有410條磷酸化肽段，對應(yīng)365個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)，427個(gè)磷酸化位點(diǎn)(pS為343個(gè)，pT為66個(gè)，pY為18個(gè))。

2.3 差異磷酸化蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過在線軟件WoLF PSORT(https: ∥wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行差異顯著磷酸化蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測，主要就常溫衰老過程、高溫衰老過程、溫度影響導(dǎo)致變化三方面進(jìn)行了分析。線蟲在常溫衰老過程中成蟲期的第10天/第5天，第5天/第1天，第10天/第1天兩兩比較，得到顯著變化的磷酸化蛋白。高溫衰老過程分析同理。溫度影響導(dǎo)致變化采用25 ℃第1天/20 ℃第1天，25 ℃第5天/20 ℃第5天，25 ℃第10天/20 ℃第10天兩兩比較，得到顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)。根據(jù)圖3，差異顯著的磷酸化蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、線粒體、細(xì)胞外等，其中最多定位在細(xì)胞核，顯示細(xì)胞核中磷酸化蛋白質(zhì)豐度隨著衰老或者溫度的影響變化最為突出。細(xì)胞核作為真核生物重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是遺傳與代謝的調(diào)控中心。細(xì)胞核在衰老過程中可能出現(xiàn)染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄水平改變、組蛋白修飾等現(xiàn)象[15]，是細(xì)胞衰老過程中的重要場所。細(xì)胞質(zhì)對于細(xì)胞功能至關(guān)重要，其中包含線粒體、高爾基體、核糖體等細(xì)胞器，能夠發(fā)生復(fù)雜的生命活動，與衰老過程息息相關(guān)。

圖3 差異顯著的磷酸化蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞預(yù)測定位Fig.3 Subcellular localization prediction of significantly regulated phosphoproteins(a) 常溫衰老過程中顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；(b) 高溫衰老過程中顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；(c) 高溫相對于常溫相同時(shí)間點(diǎn)顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。

2.4 差異磷酸化蛋白質(zhì)的氨基酸保守基序分析

激酶能夠識別特定氨基酸的保守基序(motif)，然后將底物磷酸化。通過在線分析工具M(jìn)OMO Modification Motifs(https: ∥meme-suite.org/meme/tools/momo)進(jìn)行motif分析。對于常溫和高溫衰老過程各自Day10/Day5，Day10/Day1，Day5/Day1進(jìn)行兩兩比較，得到的差異顯著的磷酸化肽段(Fold Change≥2或≤0.5，P≤0.01)分成上調(diào)、下調(diào)兩組，對于溫度影響，則將3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的25 ℃/20 ℃比較。在常溫衰老過程中，磷酸化水平上調(diào)的有304條肽段，下調(diào)的有183條肽段。在高溫衰老過程中，磷酸化水平上調(diào)的有363條肽段，下調(diào)的有273條肽段。高溫相對于常溫，磷酸化水平出現(xiàn)上調(diào)有242條肽段，下調(diào)有172條肽段。圖4展示了這些磷酸化肽段的保守基序分析結(jié)果。

圖4 線蟲衰老過程中顯著變化的磷酸化蛋白的保守基序識別Fig.4 Motif discovery on significantly changed phosphoproteins in C.elegans during aging process(a) 常溫衰老過程中顯著變化的磷酸化motif(左邊展示顯著上調(diào)的motif—xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx；右邊展示顯著下調(diào)的motif—xxxRxxSxxxxxx和xxxxxxSPxxxxx)；(b) 高溫衰老過程中顯著變化的磷酸化motif(左邊展示顯著上調(diào)的motif—xxxRxxSxxxxxx， xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx；右邊展示顯著下調(diào)的motif—xxxRxxSxxxxxx， xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx)；(c) 溫度影響導(dǎo)致的顯著變化的磷酸化motif(xxxxxxSPxxxxx發(fā)生顯著上調(diào))。

識別到的顯著變化的motif有xxxRxxSxxxxxx、xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx，其中“x”代表任意氨基酸。通過查閱文獻(xiàn)，進(jìn)一步查找能夠識別這些motif的激酶。RxxS位點(diǎn)可以通過蛋白激酶B(Akt)、絲裂原和壓力激活激酶1/2以及AMP活化蛋白激酶發(fā)生磷酸化[16]。鑒定到了AMP活化蛋白激酶的γ亞基Q22022磷酸化蛋白，通過非標(biāo)記定量方法比較相對表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)其在常溫和高溫衰老過程中顯著變化。S/TP位點(diǎn)可以通過脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶發(fā)生磷酸化，如p34cdc2(CDK1)[17]、(CDK2)[18]和Erk1。這些蛋白激酶的識別基序發(fā)生了顯著變化，表明激酶活性可能在顯著增加或者降低，參與線蟲的衰老過程的調(diào)節(jié)。

2.5 差異磷酸化蛋白質(zhì)的功能分析

使用在線軟件DAVID(https: ∥david.ncifcrf.gov/home.jsp)對顯著變化的磷酸化蛋白進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集(P≤0.05)，分析了常溫衰老、高溫衰老及溫度變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)功能(圖5，見第300頁)和通路(圖6，見第300頁)變化。在常溫衰老過程中，顯著變化的蛋白質(zhì)主要參與到發(fā)育、繁殖、運(yùn)動、定位等生物學(xué)過程(圖5(a))，行使了蛋白或小分子結(jié)合、蛋白酶調(diào)節(jié)活性等分子功能(圖5(b))。與常溫衰老相比，高溫衰老過程中，顯著變化的蛋白質(zhì)還參與了生長、代謝和生物學(xué)過程調(diào)節(jié)等過程(圖5(c))，以及大分子復(fù)合物結(jié)合和核孔的結(jié)構(gòu)成分的功能(圖5(d))，說明一些特定的蛋白質(zhì)可能參與高溫加速衰老的過程。溫度改變造成的顯著變化的蛋白質(zhì)參與了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、小分子、有機(jī)環(huán)狀化合物等的結(jié)合，以及成長、發(fā)育和繁殖等生物學(xué)過程(圖5(e，f))，表明了不同溫度環(huán)境下線蟲的生物學(xué)功能與過程變化。

圖5 20 ℃/25 ℃下線蟲衰老過程中顯著變化的磷酸化蛋白的生物學(xué)功能分析Fig.5 GO analysis of significantly altered phosphoproteins in C.elegans during aging process under 20 ℃ or 25 ℃(a，b) 常溫衰老過程中豐度顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)的BP和MF分析；(c，d) 高溫衰老過程中豐度顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)的BP分析和MF分析；(e，f) 同一時(shí)期溫度影響導(dǎo)致豐度顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)的BP分析和MF分析。BP: biological process，展示蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程。MF: molecular function，表示蛋白質(zhì)的分子功能。

圖6 20 ℃/25 ℃下線蟲衰老過程中顯著變化的磷酸化蛋白的KEGG富集分析Fig.6 KEGG analysis of significantly changed phosphoproteins in C.elegans during aging process under 20 ℃ or 25 ℃(a) 常溫衰老過程中差異顯著的磷酸化蛋白質(zhì)的KEGG分析；(b) 高溫衰老過程中差異顯著的磷酸化蛋白質(zhì)的KEGG分析；(c) 溫度影響導(dǎo)致的顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)的KEGG分析。

常溫衰老中KEGG分析富集到了核糖體相關(guān)通路，抗生素的生物合成、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和半乳糖代謝通路(圖6(a))。高溫衰老中KEGG分析富集到了核糖體和剪接體相關(guān)通路、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和抗生素的生物合成通路(圖6(b))。在溫度影響過程中，顯著變化的有核糖體相關(guān)通路、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、脂代謝、抗生素的生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路(圖6(c))。

3 小 結(jié)

長壽一直是人類關(guān)注的焦點(diǎn)，而想要延長壽命便需要延緩衰老。線蟲因?yàn)閴勖?、個(gè)體小、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)成為衰老研究的模式生物。蛋白質(zhì)磷酸化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與生物體內(nèi)的多種生命活動，參與衰老過程。為了獲得更多的衰老相關(guān)磷酸化組學(xué)信息，采用DIA非標(biāo)定量的方法探究不同溫度條件下衰老過程中線蟲體內(nèi)磷酸化組學(xué)變化，并對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。共9 145條可信度較高的磷酸化肽段被鑒定到，對應(yīng)3 317個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。經(jīng)過去冗余篩選，最終6 624條磷酸化肽段被定量到，其中顯著變化的磷酸化肽段有1 093條，包含1 426個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對應(yīng)858個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)，通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，揭示了衰老相關(guān)的磷酸化組學(xué)信息。

對顯著變化的磷酸化肽段的Motif分析，發(fā)現(xiàn)了激酶Akt、CDK1、CDK2等可能在線蟲衰老過程中發(fā)揮作用。對顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、線粒體等。通過對顯著變化的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)了可能與衰老相關(guān)的蛋白功能和核糖體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路，這些通路相互作用，調(diào)控著線蟲體內(nèi)的衰老進(jìn)程。

本文通過分析DIA非標(biāo)定量方法獲得的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了衰老過程中變化顯著的磷酸化蛋白，揭示了可能在線蟲衰老過程中發(fā)揮作用的信號通路和激酶，為線蟲衰老相關(guān)磷酸化組學(xué)研究提供了更多的實(shí)驗(yàn)思路。