新型心肌黃酶檢測熒光探針的合成及生物成像

周 瑩，房街芹，賈明軒，朱立平

(云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091)

我國是惡性腫瘤的高發(fā)國家，對癌癥的監(jiān)測與治療一直是醫(yī)學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)方向。分子氧是好氧生物中一種重要代謝產(chǎn)物，對于維持細(xì)胞的生命活動(dòng)具有十分重要的意義[1]。當(dāng)組織氧供應(yīng)受限制時(shí)，會發(fā)生低氧現(xiàn)象，導(dǎo)致依賴氧氣的生理過程發(fā)生顯著變化。由于癌細(xì)胞以極快的速度不停生長，其內(nèi)部需氧量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出血液的供應(yīng)量，極易導(dǎo)致組織內(nèi)部出現(xiàn)低氧[2]。在固體腫瘤內(nèi)，低氧導(dǎo)致部分酶出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象，其中硝基還原酶、偶氮還原酶及心肌黃酶的濃度變化最為明顯[3]。

心肌黃酶(DT-diaphorase)，簡稱DTD，是一種細(xì)胞質(zhì)黃素蛋白酶[4]。由于心肌黃酶在癌細(xì)胞中的表達(dá)量是在正常細(xì)胞中的2～50倍，因此心肌黃酶可用作癌癥的生物標(biāo)志物及熒光探針目標(biāo)的檢測物[5]。鑒于心肌黃酶檢測的重要性，開發(fā)心肌黃酶含量檢測方法及心肌黃酶高表達(dá)區(qū)域定位技術(shù)十分重要，也受到了國內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

有機(jī)小分子熒光探針，由于其具有多樣性的結(jié)構(gòu)、可調(diào)控的光譜性質(zhì)及對識別物具有高選擇性、高靈敏度響應(yīng)等特點(diǎn)，已逐漸成為廣泛應(yīng)用于生物小分子檢測的主要研究手段和工具[6,7]。但目前已有的心肌黃酶探針中普遍存在發(fā)射波長較短、響應(yīng)時(shí)間長、選擇性低等問題，這嚴(yán)重影響了心肌黃酶熒光探針的準(zhǔn)確性和靈敏性[8]。結(jié)合專一性識別模式，引入發(fā)射波長較長的熒光團(tuán)母體，利用新型光學(xué)成像技術(shù)，開發(fā)快速、準(zhǔn)確的心肌黃酶檢測探針，用于細(xì)胞內(nèi)低氧水平的檢測、輔助惡性腫瘤的早期診斷，是我們近期的工作重點(diǎn)，具有十分重要的理論及臨床意義[3,9,10]。

本研究選擇尼羅紅類衍生物作為熒光基團(tuán)，通過酯鍵或酰胺鍵的連接方式與識別基團(tuán)三甲基苯醌相連[11]，設(shè)計(jì)了“off-on”型響應(yīng)探針Milla 1。其探針具有良好的光穩(wěn)定性和光響應(yīng)性，當(dāng)與心肌黃酶反應(yīng)后，可觀察到635 nm處發(fā)射峰熒光強(qiáng)度增加約4.4倍。探針Milla 1對心肌黃酶的檢測表現(xiàn)出檢測限低、反應(yīng)時(shí)間短、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)。因此，探針Milla 1被成功應(yīng)用于HeLa細(xì)胞和秀麗隱桿線蟲內(nèi)源性和外源性的心肌黃酶檢測中，證明了Milla 1是一個(gè)良好的心肌黃酶檢測探針。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)中所提及的和所使用的所有藥品試劑均為市售分析純，購買后不需要任何處理可直接用于實(shí)驗(yàn)[12]。心肌黃酶(DTD)采購于上海源葉科技有限公司，S1007-2 KU(20 mg)。使用梅特勒托利AB204-N分析天平進(jìn)行稱量，使用布魯克DRX 500核磁共振儀通過1H-NMR和13C-NMR確定合成的探針，使用Agilent100LC/MSD TOF高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析驗(yàn)證，使用島津UV-240IPC紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行紫外光譜測試，使用F97XP熒光可見分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜測試，使用Olympus FV-10i激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，最后的秀麗隱桿線蟲熒光成像是通過Olympus BX51熒光正置顯微鏡進(jìn)行測試的。

1.2 探針Milla 1的合成

化合物MA的合成步驟：冰浴條件下將化合物1(4.35 g，26.4 mmol)溶于15 mL濃鹽酸和5 mL水的混合物中，取亞硝酸鈉(2.18 g，31.6 mmol)溶于15 mL水并分批滴加到反應(yīng)體系中，室溫反應(yīng)2 h。得棕色固體MA，產(chǎn)物不穩(wěn)定，不需純化直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

化合物XD3的合成步驟：氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將MA和1，6-二羥基萘(2 g，12.5 mmol)溶于30 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，140 ℃回流4 h，冷卻至室溫。層析柱法純化(二氯甲烷(DCM)：乙酸乙酯=10:1)得深綠色固體XD3，產(chǎn)率50%。

化合物MG，MH的合成步驟詳見參考文獻(xiàn)[2,12-16]。

探針Milla 1的合成步驟：取化合物XD3(170 mg，0.5 mmol)和化合物MH(125 mg，0.5 mmol)溶于30 mL無水DCM中，加入催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)(30 mg，0.25 mmol)，室溫反應(yīng)1 h后，向反應(yīng)體系加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)(145 mg，0.75 mmol)，室溫過夜反應(yīng)。層析柱法純化(石油醚：DCM=1:3)，得深紫色固體Milla 1，產(chǎn)率75%。1H-NMR(400 MHz，氘代氯仿(CDCl3))：δ8.30～8.27(d，J=8.8 Hz，1 H)，8.20(d，J=2.0 Hz，1 H)，7.59～7.57(d，J=9.2 Hz，1 H)，7.25～7.23(t，J=4.4 Hz，1 H)，6.68～6.65(m，6 H)，6.45(d，J=2.0 Hz，1 H)，6.34(s，1 H)，3.49～3.43(m，4 H)，2.20～2.18(d，J=8.3 Hz，3 H)，1.97(s，3 H)，1.92(s，3 H)，1.65(s，2 H)，1.56(s，2 H)，1.27～1.24(t，J=7.0 Hz，6 H)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 12.31，12.75，14.56，29.14，38.57，45.28，47.97，96.41，105.64，110.04，116.39，123.55，125.06，127.77，129.65，131.38，133.83，138.88，139.15，139.44，143.03，147.07，151.15，152.00，152.47，153.03，171.21，182.90，187.53，191.11。HEMS(ESI)：C34H34N2O6，通過計(jì)算得[M+H]+=567.249，實(shí)測值：m/z=567.249。

合成路線如圖1所示。

圖1 探針Milla 1合成路線

1.3 光譜測試

1.4 細(xì)胞、線蟲成像實(shí)驗(yàn)

內(nèi)源性心肌黃酶實(shí)驗(yàn)方法：在細(xì)胞中加入抗氧化劑谷胱甘肽乙基酯，濃度分別為0，0.4，0.8和1.2 mg·mL-1。在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h，用PBS緩沖液清洗干凈后，加入探針Milla 1母液10 μmol，于原條件下孵育2 h后，繼續(xù)用PBS緩沖液清洗干凈，再分別加入20 μL的DAPI(4’，6-二脒基-苯基吲哚)試劑恒溫孵育30 min。待測細(xì)胞繼續(xù)用PBS緩沖液清洗干凈，在共聚焦顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞成像。

外源性心肌黃酶實(shí)驗(yàn)方法：在細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別加入心肌黃酶活力單位為0，15，30和65 μ·mL-1于37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h后，用PBS緩沖液清洗干凈，再分別加入探針Milla 1母液和NADH溶液，使細(xì)胞中探針濃度保持在20 μmol，NADH濃度保持在0.5 mmol，繼續(xù)于原條件下孵育2 h后，用PBS緩沖液沖洗干凈，再次分別加入20 μL的DAPI試劑，繼續(xù)恒溫孵育30 min。待測細(xì)胞用PBS緩沖液清洗干凈，在共聚焦顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞成像。

在培養(yǎng)線蟲的試管中分別加入活力單位為0，30和65 μ·mL-1的心肌黃酶，在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h后，用PBS緩沖液清洗干凈后，加入探針Milla 1母液(20 μmol)和NADH(0.5 mmol)，之后繼續(xù)在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h。待測試線蟲用PBS緩沖液清洗后，在熒光正置顯微鏡上進(jìn)行生物成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針Milla 1對心肌黃酶的紫外光譜測試

探針Milla 1對心肌黃酶的紫外滴定使用島津UV-240IPC紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行測定。我們利用DMSO/PBS(1/1，V/V，pH=7.4)作為測試體系，在外源性加入NADH(0.5 mmol)的條件下研究了Milla 1和心肌黃酶的紫外可見光譜的變化，其紫外可見吸收光譜如圖2(A)所示。探針Milla 1在560 nm處有一個(gè)吸收峰，隨著心肌黃酶的不斷加入，當(dāng)酶的活力達(dá)到65 μ·mL-1時(shí)，吸收光譜藍(lán)移至550 nm處，強(qiáng)度無明顯變化，測試體系達(dá)到飽和。

2.2 探針Milla 1對心肌黃酶的熒光光譜測試

隨后，我們對Milla 1和心肌黃酶的反應(yīng)進(jìn)行了熒光光譜研究(DMSO/PBS=1/1，V/V，pH=7.4，激發(fā)波長：585 nm，狹縫寬度：5 nm×5 nm，電壓：700 V)。如圖2(B)所示，隨著不同酶活力單位的心肌黃酶的加入，在最大發(fā)射波長635 nm處的熒光值不斷增加，當(dāng)心肌黃酶的酶活力達(dá)到65 μ·mL-1時(shí)，熒光強(qiáng)度增加了約4.4倍后，不再發(fā)生變化。以上光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Milla 1可用于心肌黃酶含量變化的熒光光學(xué)檢測。

λ/nm

2.3 探針Milla 1對心肌黃酶的檢出限測試

接下來，我們進(jìn)行了Milla 1和心肌黃酶(DMSO/PBS=1/1，V/V，pH=7.4)的反應(yīng)檢出限測試。如圖3(A)所示，在心肌黃酶濃度范圍為0～8 μ·mL-1時(shí)，熒光發(fā)射強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9699)。基于國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)規(guī)定的檢出限(LOD)公式LOD=3σ/k[17-18]，(σ表示空白試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k表示熒光強(qiáng)度與心肌黃酶濃度之間校準(zhǔn)曲線的斜率)。計(jì)算可得到，該反應(yīng)檢測限為0.4 μ·mL-1。以上檢測限數(shù)值表明，Milla 1對心肌黃酶的檢測具有較高的靈敏度。

2.4 探針Milla 1的熒光選擇和紫外選擇性光譜測試

DTD/μ·mL-1

2.5 探針Milla 1對心肌黃酶的響應(yīng)時(shí)間測試

我們分別對探針Milla 1和不同濃度心肌黃酶(0，65 μ·mL-1)在60 min反應(yīng)內(nèi)，635 nm處的熒光值進(jìn)行了測試。如圖3(D)所示，探針Milla 1在沒有DTD時(shí)，635 nm處的熒光強(qiáng)度沒有變化；在65 μ·mL-1心肌黃酶的作用下，可以發(fā)生斷鍵反應(yīng)，釋放出熒光團(tuán)，引起635 nm處的熒光值增強(qiáng)。反應(yīng)進(jìn)行20 min后，635 nm處的熒光強(qiáng)度趨近于平穩(wěn)不再改變。因此，我們可以推測探針Milla 1與心肌黃酶的反應(yīng)時(shí)間約為20 min。

2.5 探針Milla 1對心肌黃酶的反應(yīng)機(jī)理

在NADH的存在下，探針Milla 1與心肌黃酶發(fā)生還原反應(yīng)及質(zhì)子化，使反應(yīng)基團(tuán)苯醌變?yōu)閷Ρ蕉?或半醌)，利用斷鍵反應(yīng)釋放出熒光團(tuán)XD3，實(shí)現(xiàn)對心肌黃酶的光學(xué)檢測。如圖4(A)為探針Milla 1與心肌黃酶反應(yīng)的機(jī)理圖。如圖4(B)所示，探針分子離子峰為[M+H]+：567.249，加入心肌黃酶反應(yīng)后，該探針分子離子峰消失，同時(shí)檢測到斷鍵反應(yīng)后的熒光團(tuán)分子離子峰[M+H]+：335.1389(圖4(C))。以上質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明了我們提出的反應(yīng)機(jī)理是正確。

圖4 (A)探針Milla 1與心肌黃酶(DTD)反應(yīng)的機(jī)理圖。(B)探針Milla 1與心肌黃酶(DTD)反應(yīng)前的高分辨質(zhì)譜圖。(C)探針Milla 1與心肌黃酶(DTD)反應(yīng)后的高分辨質(zhì)譜圖。

2.7 探針Milla 1對心肌黃酶的細(xì)胞毒性測試

為研究探針在生物體內(nèi)的毒性情況，我們對探針進(jìn)行了不同癌細(xì)胞和人正常細(xì)胞內(nèi)的毒性測試。如圖5所示，在探針濃度為40 μmol時(shí)，探針Milla 1對肺癌A549、肝癌SMMC-7721、宮頸癌Hela、乳腺癌MCF-7和結(jié)腸癌SW480的體外腫瘤和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的體外生長均未達(dá)到半數(shù)抑制活性。以上實(shí)驗(yàn)證明，探針Milla 1對癌細(xì)胞和人正常細(xì)胞的毒性均較小。

圖5 探針Milla 1對癌細(xì)胞A549、SMMC-7721、Hela、SW480、MCF-7和人正常細(xì)胞BEAS-2B的毒性測試圖

2.8 探針Milla 1對心肌黃酶的細(xì)胞成像測試

我們利用宮頸癌Hela細(xì)胞，進(jìn)行了光學(xué)成像實(shí)驗(yàn)，探索了探針Milla 1對內(nèi)源性和外源性的心肌黃酶的光學(xué)響應(yīng)及檢測能力。由于抗氧化劑谷胱甘肽乙基酯孵育的Hela細(xì)胞會呈現(xiàn)低氧狀態(tài)，其自身會產(chǎn)生一定量的心肌黃酶。如圖6(A)所示，在內(nèi)源性心肌黃酶成像實(shí)驗(yàn)中，隨著加入的抗氧化劑(谷胱甘肽乙基酯)的量增加，細(xì)胞內(nèi)低氧程度逐漸加強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)也呈現(xiàn)明顯的熒光增強(qiáng)梯度性變化現(xiàn)象。由此可知，探針Milla 1可以通過熒光成像的方法檢測細(xì)胞內(nèi)源性心肌黃酶含量變化并反映出相關(guān)區(qū)域的低氧程度。如圖6(B)所示，在細(xì)胞外源性心肌黃酶成像中，加入不同酶活力的心肌黃酶后，探針也可以在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯梯度性熒光增強(qiáng)現(xiàn)象。因此我們認(rèn)為，通過探針Milla 1熒光強(qiáng)度的變化可以檢測出細(xì)胞內(nèi)源性和外源性的心肌黃酶含量波動(dòng)，進(jìn)而反映出相關(guān)區(qū)域低氧程度。(圖6(C)、(D))

圖6 (A)探針Milla 1(20 μmol)在Hela細(xì)胞中的內(nèi)源性心肌黃酶的熒光成像，(B)探針Milla 1(20 μmol)在Hela細(xì)胞中的外源性心肌黃酶的熒光成像。(a)為明場(白光)通道；(b)為探針Milla 1(紅光)通道；(c)為DAPI核染色(藍(lán)光)通道；(d)為前三個(gè)通道的疊加圖。(C)探針Milla 1內(nèi)源性心肌黃酶熒光強(qiáng)度值。(D)探針Milla 1外源性心肌黃酶熒光強(qiáng)度值。

2.9 探針Milla 1對心肌黃酶的秀麗隱桿線蟲熒光成像測試

除此之外，我們利用探針Milla 1，以秀麗隱桿線蟲為生物模型，再次測試其在生物體中對心肌黃酶檢測及成像的可能性。如圖7(A)所示，在秀麗隱桿線蟲進(jìn)行外源性心肌黃酶和探針Milla 1孵育后，隨心肌黃酶濃度的增加，線蟲體內(nèi)呈現(xiàn)梯度性的紅色熒光增強(qiáng)現(xiàn)象。(圖7(B))由此可見，探針Milla 1可成功用于秀麗隱桿線蟲外源性心肌黃酶檢測和光學(xué)成像實(shí)驗(yàn)中。

圖7 (A)探針Milla 1(20 μmol)在NADH(0.5 mmol)存在下，通過心肌黃酶孵育的線蟲的活體熒光成像圖。(a1)、(b1)和(c1)為明場(白光)通道，(a2)、(b2)和(c2)為探針Milla 1(紅光)通道。(B)探針Milla 1在不同濃度下的平均熒光強(qiáng)度值

3 結(jié)論

綜上所述，我們設(shè)計(jì)合成了基于二甲基苯醌識別機(jī)理的新型熒光探針Milla 1，并將其應(yīng)用于心肌黃酶的體內(nèi)及體外檢測中。探針Milla 1表現(xiàn)出對心肌黃酶的快速專一性識別，Milla 1對心肌黃酶的檢測具有檢測限低和選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。HeLa細(xì)胞和線蟲成像實(shí)驗(yàn)表明，Milla 1可以檢測到內(nèi)源性和外源性心肌黃酶含量的變化，進(jìn)而對相關(guān)生物體內(nèi)低氧程度進(jìn)行光學(xué)監(jiān)測，具有良好的應(yīng)用前景。我們希望本文的有機(jī)合成和測試能夠?yàn)橐院蟮男募↑S酶檢測用熒光探針設(shè)計(jì)和合成提供幫助。