響應(yīng)面法優(yōu)化赤霞珠葡萄皮渣白藜蘆醇提取工藝的研究

王海波 李薇

(武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415)

葡萄皮渣是葡萄發(fā)酵釀酒之后的剩余物，含有大量的多酚類物質(zhì)[1,2]，其中白藜蘆醇就是重要的組成部分。研究證明，白藜蘆醇具有廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)多種疾病有顯著的治療效果[3,4]。當(dāng)前，葡萄皮渣被當(dāng)作廢棄物處理，或者簡(jiǎn)單的制作成飼料，易造成環(huán)境污染，生物利用度小，不符合對(duì)資源充分利用的發(fā)展理念[5,6]。本實(shí)驗(yàn)以寧夏赤霞珠葡萄的皮渣為研究對(duì)象，采用超聲波破碎和乙醇浸提相結(jié)合、單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)合分析[7,8]的方法對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行提取[9,10]，以期改進(jìn)葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝條件，從而為葡萄釀酒工業(yè)中皮渣的綜合開發(fā)利用及白藜蘆醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

將皮渣烘箱50℃烘干，用中草藥粉碎機(jī)粉碎40目篩過篩，用石油醚進(jìn)行脫脂處理，脫脂后50℃烘干[11]。

1.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取0.0025g白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇完全溶解并用棕色容量瓶定容至50mL。不同稀釋倍數(shù)后，分別得到1μg·mL-1、2μg·mL-1、3μg·mL-1、4μg·mL-1、5μg·mL-1白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。在波長(zhǎng)306nm下用無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照分別測(cè)吸光值，得出線性回歸曲線方程為y=0.194x+0.0057，其中R2=0.9997，表明白藜蘆醇濃度在1～5μg·mL-1存在較好的線性關(guān)系，可用于后期樣品的濃度分析。

1.2 白藜蘆醇提取與得率計(jì)算

稱取葡萄皮渣0.5g，加入乙醇混合均勻，水浴鍋中浸提后，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，在306nm下測(cè)量吸光度值，通過白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，進(jìn)而計(jì)算得率。

白藜蘆醇的得率(μg·mg-1)=(C×V×n)/(m×1000)

式中，C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品液的吸光值應(yīng)得白藜蘆醇含量，μg·mL-1；V為樣品液的體積，L；n為稀釋倍數(shù)；m為稱取樣品粉末的質(zhì)量，g。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇得率的影響

稱取9份0.5g葡萄皮渣粉末，以料液比1∶10，分別加入55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇溶液混合，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測(cè)定吸光度值，計(jì)算白藜蘆醇得率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 料液比對(duì)白藜蘆醇得率的影響

稱取10份0.5g葡萄皮渣粉末，分別以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55為料液比，乙醇濃度65%，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測(cè)定吸光度值，計(jì)算白藜蘆醇得率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 超聲波功率對(duì)白藜蘆醇得率的影響

稱取6份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率為50W、100W、200W、300W、400W、500W，超聲時(shí)間10min，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測(cè)定吸光度值，計(jì)算白藜蘆醇得率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 超聲波時(shí)間對(duì)白藜蘆醇得率的影響

稱取6份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率300W，超聲時(shí)間分別為5min、10min、15min、20min、25min、30min，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測(cè)定吸光度值，計(jì)算白藜蘆醇得率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 浸提溫度對(duì)白藜蘆醇得率的影響

稱取5份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率300W，超聲時(shí)間25min，浸提溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，浸提時(shí)間60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測(cè)定吸光度值，計(jì)算白藜蘆醇得率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 浸提時(shí)間對(duì)白藜蘆醇得率的影響

稱取5份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率300W，超聲時(shí)間25min，溫度45℃，浸提時(shí)間分別為15min、30min、45min、60min、75min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測(cè)定吸光度值，計(jì)算白藜蘆醇得率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并在考慮到軟件設(shè)計(jì)條件的基礎(chǔ)上，選定3個(gè)因素作為考察對(duì)象，以白藜蘆醇得率為考察指標(biāo)，利用Design Expert軟件來(lái)設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，并對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，確定模型和因素的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇得率的影響

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加白藜蘆醇得率逐漸升高。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到65%時(shí)，白藜蘆醇得率最高，為3.16μg·mg-1。但是當(dāng)乙醇濃度超過65%時(shí)，白藜蘆醇得率逐漸下降，65%乙醇濃度有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)白藜蘆醇得率的影響

從圖2可以看出，當(dāng)料液比逐漸增大時(shí)，白藜蘆醇得率逐漸上升。當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，白藜蘆醇得率最高，為12.63μg·mg-1。當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，雖然白藜蘆醇得率繼續(xù)上升，但是上升趨勢(shì)趨于平緩，表明料液比為1∶40時(shí)有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖2 料液比對(duì)白藜蘆醇得率的影響

2.1.3 超聲波功率對(duì)白藜蘆醇得率的影響

由圖3可以看出，當(dāng)超聲波功率逐漸增大時(shí)，白藜蘆醇得率逐漸增加。當(dāng)超聲波功率達(dá)到300W時(shí)，白藜蘆醇得率最高，為13.77μg·mg-1。但是，隨著超聲波功率繼續(xù)增大白藜蘆醇得率開始下降，表明超聲波功率為300W時(shí)有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖3 超聲波功率對(duì)白藜蘆醇得率的影響

2.1.4 超聲波時(shí)間對(duì)白藜蘆醇得率的影響

由圖4可以看出，隨著超聲波時(shí)間的增加，白藜蘆醇的得率逐漸上升。當(dāng)超聲波時(shí)間為25min時(shí)，白藜蘆醇得率最高，為14.3μg·mg-1。但是，當(dāng)超聲波時(shí)間繼續(xù)增加白藜蘆醇得率開始下降，表明超聲波時(shí)間為25min時(shí)有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖4 超聲波時(shí)間對(duì)白藜蘆醇得率的影響

2.1.5 浸提溫度對(duì)白藜蘆醇得率的影響

由圖5可以看出，隨著浸提溫度的增加，白藜蘆醇的得率隨之上升。當(dāng)浸提溫度達(dá)到45℃時(shí)，白藜蘆醇的的得率最高，為15.8μg·mg-1。但是，當(dāng)浸提溫度繼續(xù)提高，白藜蘆醇的得率開始下降，表明浸提溫度為45℃時(shí)有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖5 浸提溫度對(duì)白藜蘆醇得率的影響

2.1.6 浸提時(shí)間對(duì)白藜蘆醇得率的影響

由圖6可知，隨著浸提時(shí)間的增加，白藜蘆醇的得率也隨之升高。當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到45min時(shí)，白藜蘆醇得率最高，為16.04μg·mg-1。但是，當(dāng)浸提時(shí)間繼續(xù)增加，白藜蘆醇的得率開始下降，表明浸提時(shí)間為45min時(shí)有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖6 浸提時(shí)間對(duì)白藜蘆醇得率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和軟件設(shè)計(jì)要求，確定料液比1∶40、浸提溫度45℃、浸提時(shí)間45min，選取乙醇濃度(%)、超聲波時(shí)間(min)、超聲波功率(W)作為考察因素，以白藜蘆醇得率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以獲得白藜蘆醇的最佳提取條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過Design Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析得到3個(gè)因素與白藜蘆醇得率之間的二次多項(xiàng)式模型，式中Y為白藜蘆醇得率預(yù)測(cè)值，A為乙醇濃度，B為超聲波功率，C為超聲波時(shí)間，得出Y=17.22-0.069A+0.19B+0.28C+0.18AB-0.16AC-0.13BC-0.67A2-0.33B2-0.87C2。響應(yīng)曲面二次多項(xiàng)式模型的方差分析見表3。

由表3可知，回歸模型(P<0.0001)極顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9836，失擬項(xiàng)(P=0.4869>0.05)，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本模型擬合度良好，能較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。且失擬項(xiàng)中的F值小，說明實(shí)驗(yàn)值與理論值的誤差小，更能反映模型的可靠性。超聲波功率和超聲波時(shí)間對(duì)白藜蘆醇得率影響效果顯著，而乙醇濃度對(duì)提取效果的影響不顯著。根據(jù)F值大小可以判斷，這3個(gè)因素在所選的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)影響的順序?yàn)槌暡〞r(shí)間(min)>超聲波功率(W)>乙醇濃度(%)。

表3 響應(yīng)曲面二次多項(xiàng)式模型的方差分析

各因素的交互作用對(duì)白藜蘆醇得率影響如圖7～9所示。

由圖7～9可知，當(dāng)乙醇濃度(A)較大、超聲波功率(B)和超聲波時(shí)間(C)較小時(shí)，響應(yīng)面曲線較陡峭，同時(shí)等高線密度大，說明此時(shí)A、B、C 3因素對(duì)白藜蘆醇得率影響較為顯著。但是當(dāng)A取值較小，B、C取值較大時(shí)，響應(yīng)面曲線較平緩，同時(shí)等高線密度較小，說明此時(shí)各因素對(duì)白藜蘆醇得率影響較小。

圖7 得率=f(A,B)的響應(yīng)面(a)和等高線(b)

圖8 得率=f(A,C)響應(yīng)面(a)和等高線(b)

圖9 得率=f(B,C)響應(yīng)面(a)和等高線(b)

且看3個(gè)等高線的圖形均呈現(xiàn)橢圓形，說明乙醇濃度、超聲波功率和超聲波時(shí)間之間的交互作用均顯著。

通過Design Expert軟件分析得到的白藜蘆醇最佳提取工藝為乙醇濃度64.82%，料液比1∶40，超聲波功率324.54W，超聲波時(shí)間25.74min，浸提溫度45℃，浸提時(shí)間45min，在此條件下，白藜蘆醇得率的理論值可達(dá)到17.2679μg·mL-1。

2.3 模型的驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證其可靠性，考慮到實(shí)際情況與實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備因素，采取乙醇濃度65%、料液比1∶40、超聲波功率325W、超聲波時(shí)間26min、浸提溫度45℃、浸提時(shí)間45min。根據(jù)上述條件進(jìn)行3組重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最后得出平均得率為17.24μg·mg-1?？芍邹继J醇得率的實(shí)驗(yàn)值與理論值誤差極小，具有良好的擬合性，響應(yīng)面獲得的最佳提取條件可靠。

3 結(jié)果與討論

采用乙醇浸提和超聲波破碎結(jié)合的方法，從寧夏赤霞珠釀酒葡萄皮渣中提取白藜蘆醇，研究提取時(shí)各工藝條件的影響，并輔以響應(yīng)面的方法進(jìn)行分析論證，最終得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度65%，料液比1∶40，超聲波功率325W，超聲波處理時(shí)間26min，浸提溫度45℃，浸提時(shí)間45min，最終使得白藜蘆醇的得率由最初的3.16μg·mg-1提高到17.24μg·mg-1，本改進(jìn)方法對(duì)于提高寧夏赤霞珠釀酒皮渣得率較為明顯。

實(shí)驗(yàn)過程中，隨著乙醇濃度的增加白藜蘆醇得率有所提高，分析原因?yàn)榘邹继J醇呈弱極性，難溶于水，易溶于乙醇等有機(jī)溶劑，但是當(dāng)乙醇濃度持續(xù)增大時(shí)，高濃度的醇會(huì)使白藜蘆醇轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇甘，導(dǎo)致白藜蘆醇的得率下降。隨著料液比的增高，白藜蘆醇得率會(huì)提高，但當(dāng)溶劑飽和時(shí)，此時(shí)再增加料液比，可能增加其他物質(zhì)的溶出[8]。此外，超聲波可以更有效地破碎細(xì)胞，促進(jìn)有效成分與溶劑的接觸，能夠快速有效的提取。但是超聲波在運(yùn)行時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱量，由于乙醇易揮發(fā)且白藜蘆醇受熱不穩(wěn)定，則導(dǎo)致在超聲波功率過高時(shí)，反而獲得白藜蘆醇量較低[11]。同樣，因?yàn)榘邹继J醇的對(duì)熱不穩(wěn)定性，當(dāng)浸提溫度繼續(xù)升高時(shí)，過高的溫度容易使其分解或者轉(zhuǎn)化，反而使得白藜蘆醇的得率降低[11]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著浸提時(shí)間的增加白藜蘆醇得率也會(huì)隨之下降，分析原因?yàn)榘邹继J醇對(duì)光不穩(wěn)定，易被光氧化所致。