高效液相色譜法測定山梨酸、苯甲酸含量

字琴江，楊 沖，王 瑾，左李美，趙 芳，羅桂槐

（1.洱源縣檢驗檢測院，云南洱源 671200；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650031；3.昆明市城市排水監(jiān)測站，云南昆明 650118）

近年來，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，食品添加劑已被廣泛應(yīng)用于食品加工、儲存中，防腐劑能抑制微生物繁殖，延長食品的保質(zhì)期，防止食物變質(zhì)、腐敗，防腐劑的出現(xiàn)給人們生活帶來極大便利[1]。苯甲酸和山梨酸是人工合成防腐劑中造價最便宜、性能最穩(wěn)定、毒性最低的，因此被廣泛使用。但過量使用防腐劑會對人體健康造成一定影響。例如，山梨酸會改變細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的滲透壓，使生物體內(nèi)的代謝物逸出細(xì)胞導(dǎo)致其失活[2]。苯甲酸會對細(xì)胞原生質(zhì)部分遺傳物質(zhì)產(chǎn)生效益，長期使用可能誘發(fā)哮喘、蕁麻疹等過敏反應(yīng)[3]。各國對食品中添加山梨酸、苯甲酸的量都有嚴(yán)格的要求，均制定了限量標(biāo)準(zhǔn)，不允許超限量使用。因此，建立一種山梨酸、苯甲酸快速、靈敏、高效及適用范圍廣的檢測方法非常 重要。

為了準(zhǔn)確測定山梨酸、苯甲酸的含量，科研工作者研發(fā)了很多定量分析方法，并將其應(yīng)用于山梨酸、苯甲酸的檢測。例如，毛細(xì)管電泳法[4]、紫外分光光度法[5-6]、氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8-10]及離子色譜法[11]等，其中高效液相色譜法具有選擇性高、分離效能高、檢測靈敏度高以及分析速度快等優(yōu)點，在食品分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自制橙汁（樣品來自于云南省市場監(jiān)督管理局2021年能力驗證考核樣）。甲醇（色譜純），美國賽默菲飛世爾科技公司；食品防腐劑山梨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1000 mg/L），食品防腐劑苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （1000 mg/L），中國計量科學(xué)研究院；實驗所用的其他試劑均為分析純，實驗室所用水均為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（LC-2040C 3D），配二極管檢測器，島津儀器有限公司；離心機(jī)，鹽城市凱特實驗儀器有限公司；分析天平，島津儀器有限公司；渦旋振蕩器，常州華奧儀器制造有限公司；超聲波發(fā)生器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 操作方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將苯甲酸、山梨酸分別配制為濃度0.5 mg/L、 1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0 mg/L及20.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取橙汁約2.0 g（精確到0.0001 g）試樣于50 mL具塞離心管中，加水約25 mL，混勻，超聲20 min（水溫50 ℃），冷卻至室溫，離心5 min（轉(zhuǎn)速6000 r/min），將水相轉(zhuǎn)移至容量瓶中，殘渣中加入20 mL純凈水，混勻后繼續(xù)超聲5 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速6000 r/min），將水相轉(zhuǎn)移到同一容量瓶中，定容至刻度，混勻，取上清液過0.22 μm濾膜，放入進(jìn)樣品中，待液相色譜儀測定。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 mm， 3.5 μm）；流動相：乙酸銨溶液∶甲醇=95∶5；流速：1 mL/min；柱溫恒溫：30 ℃；檢測器：二極管；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

在最佳實驗條件下，對山梨酸、苯甲酸進(jìn)行檢測，隨著苯甲酸、山梨酸濃度進(jìn)一步增加，在230 nm處的特征吸收峰逐漸增強(qiáng)，苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=33750.5X-5639.2，山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=63772.0X-9682.0，r均為0.9996，表明山梨酸、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)濃度在0.5～20.0 mg/L與響應(yīng)強(qiáng)度的線性關(guān)系良好。苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖1和圖2所示。

圖1 苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 回收率和精密度試驗

在樣品中進(jìn)行方法準(zhǔn)確度驗證，在橙汁中添加苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗驗證。取2.0 g（精確至0.0001 g）橙汁3份，分別在A1～A3樣品中加入濃度為100 mg/L的苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL，B1～B3樣品中加入濃度為 100 mg/L的苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，定容成 50.0 mL，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，苯甲酸加標(biāo)回收率在94.15%～95.90%，山梨酸加標(biāo)回收率在93.60%～94.40%，符合加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)要求。

表1 樣品中苯甲酸、山梨酸檢測回收率

選擇苯甲酸、山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法精密度實驗，將3.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣14次，對比色譜圖并記錄各防腐劑的保留時間、峰面積以及峰高的RSD，結(jié)果如表2所示。保留時間、峰面積以及峰高的相對偏差分別小于1.96 %、1.61%、1.89%，結(jié)果顯示RSD均小于1.96%，說明該方法以及儀器條件均滿足苯甲酸、山梨酸的檢測。

表2 方法的重復(fù)性試驗（n=14）

3 結(jié)論

本文對橙汁中苯甲酸、山梨酸的含量進(jìn)行測定，前處理方法簡單，簡便易操作，在0.5～20 mg/L呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9996，苯甲酸加標(biāo)回收率在94.15%～95.90%，山梨酸加標(biāo)回收率在93.60%～94.40%，RSD在0.97%～1.96%，檢測結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。結(jié)果顯示該方法測定山梨酸、苯甲酸含量準(zhǔn)確有效，可廣泛被用于食品中苯甲酸、山梨酸的檢測。