不同軟糖基質(zhì)中甲鈷胺含量的檢測(cè)

余 斐，李偉佳，張敬鍇，林岱濱，李欣純

（廣東億超生物科技有限公司，廣東汕頭 515000）

維生素B12又稱鈷胺素，是唯一的一種需要腸道內(nèi)分泌物（內(nèi)因子）幫助才能吸收的維生素，其家族成員主要包括氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺[1]。甲鈷胺作為維生素B12在體內(nèi)的活性形式之一，其對(duì)外神經(jīng)組織具有良好的傳遞性，可促進(jìn)核酸-蛋白-脂肪的代謝，可修復(fù)損傷的神經(jīng)組織[2]。維生素B12是人體必需且不能自身合成的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可從食物中獲取。貧血和脊髓亞急性聯(lián)合變性是維生素B12缺乏引起的典型表現(xiàn)，維生素B12缺乏也可引起不自主運(yùn)動(dòng)、視力下降、癲癇、認(rèn)知情感障礙、自主神經(jīng)功能障礙及皮膚色素沉著等不典型表現(xiàn)[3]。

甲鈷胺作為維生素B12來(lái)源添加到軟糖膳食補(bǔ)充劑中的研究較少。軟糖目前主流的基質(zhì)有明膠和果膠兩種，現(xiàn)采用HPLC法測(cè)定不同軟糖基質(zhì)中甲鈷胺含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀；甲鈷胺對(duì)照品（93.9%），中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100692-202006；磷酸二氫鉀（色譜純），科密歐，含量≥99.50%；氫氧化鈉（分析純），光華科技，含量≥85.0%；磷酸（色譜純），美國(guó)天地，含量≥85.0%；乙腈（色譜純），美國(guó)天地，含量≥99.90%。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：月 旭UItimate AQ-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液 （用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液或磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）-乙腈（84∶16）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：342 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 供試品溶液的制備

稱取5.0 g供試品于50 mL具塞塑料離心管中，60 ℃水浴溶解，回室溫后加水定容至50 mL， 10000 r/min離心2 min。上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液，即為供試品溶液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取100 mg甲鈷胺標(biāo)準(zhǔn)品加水溶解定容，配制成濃度為2.0 mg/mL的甲鈷胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，棕色瓶保存。分別吸取一定體積的甲鈷胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，加水稀釋，制備一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液濃度為4 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、 80 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，按上述色譜條件采用高效液相色譜儀分析，以濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 測(cè)定方法

將供試品溶液按上述色譜條件進(jìn)高效液相色譜儀測(cè)定，采用外標(biāo)法通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性的考察

取甲鈷胺陰性樣品，依上述方法制備處理、檢測(cè)，測(cè)定圖譜如圖1、圖2所示。由圖可知，不存在基質(zhì)干擾情況，色譜條件可行。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 甲鈷胺陰性樣品色譜圖

2.2 溶液穩(wěn)定性考察

將濃度為40 μg/mL的甲鈷胺對(duì)照溶液按1.2色譜條件進(jìn)行0 h、4 h、6 h和10 h溶液穩(wěn)定性考察，通過(guò)峰面積的變化考察溶液穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，4 h、6 h、10 h的溶液對(duì)0 h溶液的偏差分別為1.2%、0.3%、0.3%，符合溶液穩(wěn)定性≤5%的要求。說(shuō)明甲鈷胺對(duì)照溶液在10 h內(nèi)是穩(wěn)定的，見(jiàn)表1。

表1 溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.3 線性范圍與檢測(cè)限、定量限的測(cè)定

依1.4測(cè)定數(shù)據(jù)，擬合獲得回歸方程為y= 0.8907x-2.3952，R2=0.9997，表示在4～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，有良好線性。分別取甲鈷胺明膠基質(zhì)陰性樣品和果膠基質(zhì)陰性樣品，加標(biāo)，MDL方式測(cè)定，結(jié)果顯示在供試品稱樣量為5 g，稀釋倍數(shù)為50 mL時(shí)，測(cè)得甲鈷胺在軟糖明膠基質(zhì)中檢出限0.53 mg/kg，定量限1.77 mg/kg；甲鈷胺在軟糖果膠基質(zhì)中檢出限0.22 mg/kg，定量限0.74 mg/kg。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定

取甲鈷胺明膠基質(zhì)陰性樣品，分別加入一定量的甲鈷胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3步驟操作，使之成為理論濃度分別約為5 μg/mL、45 μg/mL、110 μg/mL的樣品，每個(gè)濃度平行操作6份，按照1.2的色譜條件上機(jī)測(cè)定，計(jì)算各組樣品含量的RSD，結(jié)果如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，明膠基質(zhì)陰性樣品3個(gè)濃度水平的準(zhǔn)確度分別為3.4%、2.6%、1.7%，回收率分別為93.51%～106.50%，均達(dá)到可接受標(biāo)準(zhǔn)。

表2 測(cè)定甲鈷胺明膠基質(zhì)陰性樣品精密度和準(zhǔn)確度

取甲鈷胺果膠基質(zhì)陰性樣品分別加入一定量的甲鈷胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3步驟操作，使之成為理論濃度分別加入濃度為7 μg/mL、48 μg/mL和 120 μg/mL的樣品，每個(gè)濃度平行操作6份，按照1.2的色譜條件上機(jī)測(cè)定，計(jì)算各組樣品含量的RSD，結(jié)果如表3所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，果膠基質(zhì)陰性樣品3個(gè)濃度水平的準(zhǔn)確度分別為1.2%、1.1%、0.8%，回收率101%～105%，均達(dá)到可接受標(biāo)準(zhǔn)。

表3 測(cè)定甲鈷胺果膠基質(zhì)陰性樣品精密度和準(zhǔn)確度

2.5 光照對(duì)軟糖中甲鈷胺含量的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的研究，甲鈷胺對(duì)光不穩(wěn)定[4-5]。因此，將標(biāo)示含量為500 μg/2.5 g的甲鈷在普通日光燈條件下，光照1 h、2 h、3 h，考察光照對(duì)軟糖中甲鈷胺含量的影響，甲鈷胺降解率見(jiàn)表4。由表中數(shù)據(jù)可知，添加了甲鈷胺的軟糖，光照3 h后，降解率高達(dá)70.4%。

表4 甲鈷胺軟糖光照實(shí)驗(yàn)降解率統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論

精密度測(cè)定結(jié)果顯示，甲鈷胺明膠基質(zhì)陰性樣品3個(gè)濃度RSD在1.7%～3.4%，甲鈷胺果膠基質(zhì)陰性樣品3個(gè)濃度RSD在0.8%～1.2%，能滿足精密度≤5%的要求。準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果顯示，甲鈷胺明膠基質(zhì)陰性樣品3個(gè)濃度回收率在93.51%～106.50%，甲鈷胺果膠基質(zhì)陰性樣品3個(gè)濃度回收率在101%～105%，能滿足回收率80%～110%的要求。光照實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，針對(duì)添加了甲鈷胺的軟糖，需要選擇具有遮光材質(zhì)的包材，避免光照對(duì)甲鈷胺含量的影響。