HPLC檢測(cè)糕點(diǎn)中阿斯巴甜含量的不確定度評(píng)定

唐璐子，張 洋

（安徽國(guó)科檢測(cè)科技有限公司，安徽合肥 230041）

近年來(lái)，隨著人們對(duì)食品中含糖量的關(guān)注，諸多甜味劑頻繁出現(xiàn)在大眾的視野中。甜度高、熱量低的特點(diǎn)使這些甜味劑被用來(lái)代替膳食中的糖。其中人工合成的阿斯巴甜一直遭受質(zhì)疑，因?yàn)榘⑺拱吞鹪趹?yīng)用中存在諸多隱患，如致癌、誘發(fā)腦瘤等，苯丙酮尿癥患者應(yīng)避免使用，過(guò)量使用可能會(huì)影響人們的生命安全?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中規(guī)定，糕點(diǎn)中天門冬酰苯丙氨酸甲酯（又名阿斯巴甜）所允許最大使用量為1.7 g/kg[1]。

在檢測(cè)工作中，檢測(cè)結(jié)論的準(zhǔn)確性和質(zhì)量也被提出了更高的要求，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)論的不確定度評(píng)定工作倍受重視。食品中測(cè)定不確定度的常用方法是A類、B類評(píng)定法。A類是對(duì)重復(fù)性測(cè)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，B類評(píng)定不同于A類評(píng)定的方法，是分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在的導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確的因素，對(duì)每個(gè)因素造成的誤差進(jìn)行分析計(jì)算。

目前，針對(duì)食品中阿斯巴甜的檢測(cè)的有關(guān)研究中，雖沒(méi)有詳細(xì)資料表明糕點(diǎn)中阿斯巴甜測(cè)定的不確定度評(píng)定過(guò)程，但在全國(guó)各地監(jiān)督抽查和第三方檢測(cè)公司委托檢驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在糕點(diǎn)中對(duì)阿斯巴甜的應(yīng)用較多[2-4]。本文基于《測(cè)量不確定度的要求》（CNAS—CL 01—G 003：2019）[5]、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL 006：2019）[6]、《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》（JJF 1135—2005）[7]、《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[8]和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測(cè)定》（GB 5009.263—2016）[9]中的技術(shù)規(guī)范，對(duì)阿斯巴甜在糕點(diǎn)中含量的不確定度進(jìn)行分析計(jì)算，找到影響檢測(cè)結(jié)果的主要原因，為實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制和檢測(cè)結(jié)論的準(zhǔn)確度，提出了科學(xué)、可信的 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制符合GB/T 6682—2008規(guī)定）；阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；糕點(diǎn)來(lái)自市場(chǎng)抽查隨機(jī)樣本。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀（Agilent）；ATX224電子天平（島津）；AUW120D電子天平（島津）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測(cè)定》（GB 5009.263—2016）中焙烤食品的方法處理試樣，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線。

數(shù)學(xué)模型如下式：

式中：C0為樣品中阿斯巴甜的濃度，g/kg；A0為試樣溶液的色譜峰高與保留時(shí)間的積分值（即峰面積）；A1為標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰高與保留時(shí)間的積分值（即峰面積）；C1為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，g/kg；m為試樣質(zhì)量，g；V為樣品最后定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來(lái)源分析

在隨機(jī)或系統(tǒng)影響下引入不確定度分量，就可以判斷出由試樣稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、定容和擬和標(biāo)準(zhǔn)曲線等所帶入的不確定度[10-13]。如圖1所示。

圖1 不確定度來(lái)源圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品的證書(shū)給出純度及不確定度，但是在檢驗(yàn)中有可能同時(shí)用到多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制工作曲線，則需要計(jì)算多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的均方根。例如，由阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)樣品說(shuō)明書(shū)可知其純度大于98%，其區(qū)間的半寬度即純度（99±1）%。屬于B類不確定度，采用均勻分布，可以算出對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品純度所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品稱量所用的天平感量為十萬(wàn)分之一，按照檢定規(guī)程中給出的最大允許誤差計(jì)算得，a=0.0005 g，根據(jù)均勻分布，不確定度為，由于標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際稱取為0.10025 g，因此相對(duì)不確定度為u2rel=0.00029/0.10025 =2.9 ×10-3。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度

玻璃器皿的不確定度主要來(lái)源是玻璃器皿的示值偏差和玻璃器皿受環(huán)境溫度改變導(dǎo)致收縮或膨脹引起溶液體積變化。

玻璃器皿的示值偏差按照國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范 JJG 196—2006中給出的最大允許差d以及均勻分布進(jìn)行計(jì)算，不確定度為。

玻璃器皿出廠時(shí)已在20 ℃恒溫下校正。計(jì)算其在室溫下對(duì)溶液體積改變的不確定度，重點(diǎn)是要判斷其在溶液配制和使用時(shí)的室溫下是否有變化。如果配制和使用溶液時(shí)是在相同室溫下，則不需要再考慮液體體積改變的影響。本實(shí)驗(yàn)中操作溫度為17～23 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，在95%置信區(qū)間下，k=1.96，玻璃器皿體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。如果在實(shí)際測(cè)量中溫度波動(dòng)較小或溶劑膨脹系數(shù)較小，該項(xiàng)產(chǎn)生的影響相對(duì)較小可忽略。

配制阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液所用的是100 mL 的A級(jí)容量瓶，根據(jù)上述內(nèi)容可以測(cè)算出阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的相對(duì)不確定度為= 0.000588。

2.2.4 配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液過(guò)程中玻璃量器產(chǎn)生的不確定度

配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液過(guò)程中使用了一系列玻璃量器，需要注意的是這里使用不同的25 mL移液管。評(píng)定方法同2.2.3，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1中數(shù)據(jù)可知，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液過(guò)程中玻璃量器產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為u2rel(V)=0.0051。

表1 移液管和容量瓶的不確定度

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度分量的合成

合成2.2.1～2.2.4步驟標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程中的不確定度分量，則標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度=0.00778。

2.3 樣品制備過(guò)程引入的不確定度

2.3.1 樣品稱量過(guò)程的不確定度

樣品稱量過(guò)程的不確定度主要來(lái)源于稱量過(guò)程的變動(dòng)性以及天平的準(zhǔn)確性。天平的準(zhǔn)確性由天平分辨力的不確定度以及天平線性的不確定度合成。檢定證書(shū)提供天平線性為0.15 mg，并假設(shè)其均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3=0.15/=0.087 mg，天平的分辨率為0.1 mg，區(qū)間半寬度a=0.1/2=0.05，則u4=0.05/=0.029 mg；稱量過(guò)程的變動(dòng)性也可通過(guò)多次稱量獲得，因此稱量時(shí)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，稱樣量為10.0785 g，所以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.3.2 樣品定容過(guò)程引入的不確定度

定容過(guò)程使用的容量瓶是容量為50 mL的A級(jí)容量瓶，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，其最大允許誤差d為±0.05 mL，按照2.2.3計(jì)算后，在此過(guò)程帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u3rel(V)=0.000661。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程不確定度

用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制500.0 μg/mL、250.0 μg/mL、125.0 μg/mL、50.0 μg/mL和25.0 μg/mL的5種濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用高效液相色譜儀測(cè)定，每一濃度測(cè)定3次，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。橫軸是濃度C，縱軸是峰面積S，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)學(xué)模型為S=aC+b，計(jì)算線性方程的斜率為S=2279×C+6817（a=2279，b=6817），相關(guān)系數(shù)為R=0.9999。

表2 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積測(cè)定結(jié)果

按（2）式（貝塞爾公式）計(jì)算S殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按（3）式計(jì)算阿斯巴甜待測(cè)液的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

式中：C0為根據(jù)線性方程計(jì)算的待測(cè)液的質(zhì)量濃度，C0=161 μg/mL；p=6，為C0的測(cè)量次數(shù)；Si為各測(cè)量結(jié)果值；Sj為線性方程計(jì)算值，Sj= 2279×Cj+6817；n為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)量次數(shù)，n=15；Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL。

根據(jù)表2數(shù)據(jù)可以計(jì)算得u(C0)=0.393，曲線擬合的過(guò)程帶入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u6rel=0.00246。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)過(guò)程中引入的不確定度

根據(jù)1.3進(jìn)行前處理的樣品，對(duì)糕點(diǎn)中的阿斯巴甜重復(fù)進(jìn)行了6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果分別為 0.802 g/kg、0.794 g/kg、0.832 g/kg、0.810 g/kg、 0.798 g/kg和0.803g/kg。根據(jù)貝塞爾公式（1）計(jì)算重復(fù)性引起的不確定度u(c—)，計(jì)算公式如下：

式中：c為6次重復(fù)測(cè)試值的平均值；n為測(cè)定次數(shù)，n=6；c為待測(cè)液中阿斯巴甜的濃度，g/kg。

2.6 總合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的確定

總合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u0rel== 0.0207。

2.7 擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度

置信水平p=95%，包含因子k=2，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度= 0.0207 × 0.806 = 0.0167。

相對(duì)擴(kuò)展不確定度U=K×uc=0.033。

2.8 測(cè)量不確定度報(bào)告

用GB 5009.263—2016方法重復(fù)6次測(cè)定糕點(diǎn)中阿斯巴甜平均含量為（0.806±0.033）g/kg，k=2。

3 結(jié)論

本文主要從配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線、試樣稱量、試樣定容、重復(fù)性測(cè)試6個(gè)方面對(duì)糕點(diǎn)中阿斯巴甜測(cè)定過(guò)程中的不確定度進(jìn)行分析，根據(jù)GB 5009.263—2016檢測(cè)糕點(diǎn)中阿斯巴甜時(shí)，應(yīng)注意，測(cè)量重復(fù)性、試樣稱量和定容過(guò)程、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，從而計(jì)算不確定度以確保檢測(cè)結(jié)論的準(zhǔn)確性。