抗氧化和降膽固醇雙活性大麥若葉代餐羊酵乳的研制

白璐，王爽，秦鑫瑩，祝子翔，鄭可欣*，岳喜慶*

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院（沈陽(yáng) 110866）

人體內(nèi)由自由基或活性氧引起的過(guò)氧化反應(yīng)雖然具有抗病等必要功能，但是當(dāng)它超出限度或在不當(dāng)部位發(fā)生時(shí)即成為某些疾病的致病因子[1-3]，同樣，人體內(nèi)的膽固醇是維持人體機(jī)能的必要組分，但是過(guò)高的膽固醇含量將引起動(dòng)脈硬化和血栓等疾病[4-5]。因此，兩者都需要適當(dāng)控制，而通過(guò)飲食控制機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)和膽固醇含量是最理想的方式。

大麥若葉為大麥生長(zhǎng)到15～30 cm的幼苗[6]，富含微量元素、葉綠素、類(lèi)黃酮、維生素、膳食纖維、多糖、蛋白質(zhì)及抗氧化酶等多種功能營(yíng)養(yǎng)成分[7-9]。近年來(lái)的研究表明，大麥若葉青汁不僅具有潤(rùn)腸通便的功效，還具有較強(qiáng)的抗氧化和降膽固醇能力[8-9]，是新興的健康食材。

羊乳中乳清蛋白與酪蛋白的比例顯著高于牛乳，在胃內(nèi)形成結(jié)構(gòu)細(xì)小且松散的絮狀軟凝塊，易于被消化吸收，且羊乳含有少量的乳糖，與牛乳制品相比更適于乳糖酶缺乏的人群，顯著降低乳糖不耐受癥狀[10-11]。大量研究還表明，羊乳中的乳清蛋白及其降解形成的生物活性肽具有良好的調(diào)節(jié)血糖功能[12]。以羊乳為原料制成發(fā)酵乳，既能保留羊乳的營(yíng)養(yǎng)成分，又增強(qiáng)其易被消化吸收的能力，更適宜乳糖不耐受人群[13-14]和2型糖尿病患者[12]。

研究以羊酵乳和大麥若葉粉為主，添加大麥若葉多糖、青稞、木薯粉、木糖醇和甜菊苷，制備具有抗氧化和降膽固醇的雙功能新型代餐羊酵乳。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純山羊奶（弗里生天津乳制品有限公司）；大麥種子（壽禾種業(yè)）；木糖醇（鄭州市偉豐生物科技有限公司）；甜菊苷（鄭州市偉豐生物科技有限公司）；青稞（陜西北三禾食品有限公司）；木薯粉（海寧楓園食品有限公司）；酸奶發(fā)酵劑（尚川，10株菌型，廣東順德尚川科技有限公司）；無(wú)水乙醇（國(guó)藥，Cat#10009218）；正丁醇（西隴科學(xué)，Cat#71-36-3）；氯仿（阿拉丁，Cat# 865-49-6）；PBS磷酸鹽緩沖液（Solarbio，Cat#P1010）；鄰苯二甲醛（阿拉丁，Cat#643-79-8）；冰乙酸（國(guó)藥，Cat#64-19-7）；濃硫酸（國(guó)藥，Cat#7664-93-9）；新鮮雞蛋黃、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（Merck，Cat#57-88-5）；考馬斯亮藍(lán)法蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Mbchem，Cat#M2031）；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（碧云天，Cat#S0119）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（島津AUW220D）；超凈工作臺(tái)（Thermo ScientificTMHeraguardTMECO 51029704）；低溫干燥機(jī)（雙嘉SJIA-10N-50C）；粉碎機(jī)（康和機(jī)械WF130）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（比朗BILON-1200Y）；恒溫水浴鍋（聚創(chuàng)世紀(jì)HH-6）；離心機(jī)（Thermo ScientificTMSorvall ST8R）；電磁爐（美的WH2202）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏DNP-9272）；pH計(jì)（上海雷磁PHS-3E）；冰箱（美菱YC-395L）；紫外分光光度計(jì)（Thermo Varioskan LUX）。

1.3 方法

1.3.1 大麥若葉代餐羊酵乳制作的工藝流程

市售生羊乳經(jīng)巴氏殺菌后發(fā)酵獲得發(fā)酵乳，加入大麥若葉粉、大麥若葉多糖、木糖醇、甜菊苷和青稞木薯圓子，得到大麥若葉代餐羊酵乳產(chǎn)品，制備工藝流程如圖1所示。青稞木薯圓子由青稞搭配木薯粉和大麥若葉粉制備，用以提升產(chǎn)品咀嚼感和飽腹感。

圖1 大麥若葉代餐羊酵乳制作的工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

1) 大麥若葉粉制備：大麥種子在40 ℃溫水中浸泡24 h，挑除壞種后，均勻平鋪在加密盤(pán)上，覆蓋一張濕潤(rùn)的育苗紙，放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件：白天溫度（27±1）℃，晚上溫度（18±1）℃，光照時(shí)間16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 Lx，濕度70%。保持每日噴水4～6次，等到種子長(zhǎng)出1 cm的綠芽后揭開(kāi)育苗紙，并在加密盤(pán)底部倒入蒸餾水，水位保持（3±0.1）cm。待麥苗長(zhǎng)到20～30 cm進(jìn)行收割，選取上端的大麥嫩葉，剔除蟲(chóng)病害及污染的部分，用純凈水浸泡4～6 min，沖洗3次以上，去除灰塵及其他雜物，切成短桿狀（2 cm），用棉紙吸除表面水；稱(chēng)取300 g大麥苗，以2 ℃/min的速度快速冷凍至-20 ℃，冷凍干燥微波功率設(shè)定為400 W，壓力設(shè)定為50 Pa，保持冷阱溫度在-40 ℃，干燥時(shí)間60 min。將冷凍的大麥苗用粉碎機(jī)粉碎（10 kW，10 min），經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩網(wǎng)超細(xì)過(guò)濾得0.013 mm大麥若葉粉。

2) 大麥若葉多糖提取：稱(chēng)取5.00 g大麥若葉粉，按照料液比1∶30 g/mL加入蒸餾水，超聲粉碎30 min，于70 ℃水浴加熱2 h，離心取上層清液，按照體積比3∶16加入乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%），冷藏12 h進(jìn)行醇沉。采用Sevage法（V正丁醇∶V氯仿=4∶1）除蛋白，透析凍干得大麥若葉多糖。

3) 青稞木薯圓子制備：將青稞粒用純凈水浸泡5 h，在100 ℃沸水中煮4 h，冷卻至室溫后備用。取30 g木糖醇溶于清水（質(zhì)量比為1∶5），熬煮至黏稠狀糖漿；取20 g大麥若葉粉、100 g木薯粉（可酌情適量增減）加入糖漿中，充分?jǐn)嚢枞啻瓿擅鎴F(tuán)，切分并壓成薄皮（0.3 g/個(gè)），每皮包裹一粒熟青稞，揉圓（直徑約7 mm）；于-18 ℃冷藏保存；制備成品前取青稞木薯圓子于沸水中煮15～20 min。

4) 羊酵乳的制備：生羊乳經(jīng)巴氏殺菌并冷卻至室溫后，加入酸奶發(fā)酵劑（質(zhì)量比為1∶500），充分?jǐn)嚢?，?2 ℃恒溫發(fā)酵10 h，室溫自然冷卻至10 ℃，放入4 ℃冰箱后熟12 h。

5) 大麥若葉代餐羊酵乳成品的制備：向羊酵乳中加入大麥若葉粉、大麥若葉多糖、木糖醇和甜菊苷后，充分?jǐn)嚢?，加入青稞木薯圓子即得到成品。

1.3.3 大麥若葉代餐羊酵乳組分的單因素試驗(yàn)

用單因素試驗(yàn)確定大麥若葉代餐羊酵乳的5個(gè)組分（因素），即大麥若葉粉、大麥若葉多糖、發(fā)酵菌接種量、木糖醇、青稞木薯圓子的適當(dāng)添加數(shù)量，評(píng)價(jià)的方法為感官評(píng)定。

1) 大麥若葉粉添加量試驗(yàn)：大麥若葉粉添加量分別為0.6，0.8，1.0和1.2 g/100 mL。不變組分為大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL、發(fā)酵菌接種量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量15%。

2) 大麥若葉多糖添加量試驗(yàn)：大麥若葉多糖添加量分別為0.3，0.5，0.7和0.9 mg/mL。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL、發(fā)酵菌接種量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量15%。

3) 發(fā)酵菌接種量試驗(yàn)：發(fā)酵菌接種量分別為0.15，0.20，0.25和0.30 g/100 mL。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量15%。

4) 木糖醇添加量試驗(yàn)：木糖醇添加量分別為3.0，3.2，3.4和3.6 g/100 mL。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL，大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL，發(fā)酵菌接種量0.2 g/100 mL，青稞木薯圓子添加量15%。

5) 青稞木薯圓子添加量試驗(yàn)：青稞木薯圓子添加量分別為5%，10%，15%和20%。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL、發(fā)酵菌接種量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL。

1.3.4 大麥若葉代餐羊酵乳組分的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的大麥若葉代餐羊酵乳5個(gè)組分的數(shù)量范圍，進(jìn)行大麥若葉粉添加量（A）、大麥若葉多糖添加量（B）、發(fā)酵菌接種量（C）、木糖醇添加量（D）、青稞木薯圓子添加量（E）這5個(gè)因素4個(gè)水平的正交試驗(yàn)，即按L16(45)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)（表1），通過(guò)感官評(píng)價(jià)，進(jìn)行產(chǎn)品配方的優(yōu)化。

表1 大麥若葉代餐羊酵乳組分優(yōu)化正交試驗(yàn)的因素和水平

1.3.5 產(chǎn)品的感官評(píng)定

選擇40名（男20名，女20名）評(píng)審人員組成感官評(píng)定小組，全部人員無(wú)不良生活習(xí)慣，無(wú)消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，一個(gè)月內(nèi)沒(méi)有節(jié)食減肥及服用任何藥物。評(píng)審人員禁食5 h后飲用250 mL產(chǎn)品，15 min內(nèi)進(jìn)食完畢，分別從色澤、氣味、組織狀態(tài)、口感、飽腹感程度五個(gè)方面對(duì)大麥若葉代餐羊酵乳進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 感官評(píng)分指標(biāo)

1.3.6 pH測(cè)定

用pH計(jì)測(cè)定產(chǎn)品pH。

1.3.7 抗氧化活性測(cè)定

以羊酵乳和純化大麥若葉多糖為對(duì)照組，以最優(yōu)配方產(chǎn)品為試驗(yàn)組，分別取1 mL溶于等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）作為原液，依次進(jìn)行2，4，8，16和32倍稀釋?zhuān)每偪寡趸芰υ噭┖校ˋBTS法）進(jìn)行抗氧化能力檢測(cè)。

1.3.8 降膽固醇活性測(cè)定

以羊酵乳為對(duì)照組，以最優(yōu)配方產(chǎn)品為試驗(yàn)組，分別取2 mL，調(diào)節(jié)pH至2.0，于4 000 r/min離心20 min，取0.04 mL上清液，利用鄰苯二甲醛吸附法測(cè)定膽固醇吸附量。計(jì)算公式：膽固醇吸附量（mg/g）=（吸附前蛋黃液中膽固醇含量-吸附后蛋黃液中膽固醇含量）/樣品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥若葉代餐羊酵乳組分含量變化對(duì)感官評(píng)定的影響

2.1.1 大麥若葉粉添加量的影響

大麥若葉粉添加量對(duì)產(chǎn)品色澤、氣味和口感有較大影響。如圖2所示：當(dāng)大麥若葉粉添加量為0.60 g/100 mL時(shí)，大麥若葉氣味淺淡，產(chǎn)品呈乳白色；添加量為0.80 g/100 mL時(shí)產(chǎn)品感官評(píng)分最高，產(chǎn)品呈淺綠色且色澤均勻，具有清新的大麥若葉香氣，口感細(xì)膩；而當(dāng)添加量為1.00 g/100 mL時(shí)，大麥若葉氣味較濃且掩蓋住奶香味，口感略粗糙；當(dāng)添加量為1.20 g/100 mL時(shí)產(chǎn)品整體呈墨綠色，出現(xiàn)沉淀，口味略苦。結(jié)果表明，當(dāng)大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、發(fā)酵菌接種量為0.2 g/100 mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時(shí)，大麥若葉粉最適添加量為0.80 g/100 mL。

圖2 大麥若葉粉添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響

2.1.2 大麥若葉多糖添加量的影響

大麥若葉多糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定略有影響。如圖3所示：當(dāng)大麥若葉多糖添加量為0.70 mg/mL時(shí)，產(chǎn)品感官評(píng)分最高，此時(shí)產(chǎn)品色澤均一，質(zhì)地均勻濃稠；當(dāng)添加量高于0.70 mg/mL時(shí)，產(chǎn)品與多糖溶解度下降，出現(xiàn)結(jié)塊和分層現(xiàn)象，感官評(píng)分降低。結(jié)果表明，當(dāng)大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、發(fā)酵菌接種量為0.2 g/100 mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時(shí)，大麥若葉多糖最適添加量為0.7 mg/mL。

圖3 大麥若葉多糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響

2.1.3 發(fā)酵菌接種量的影響

發(fā)酵菌接種量對(duì)產(chǎn)品組織狀態(tài)、氣味和口感有較大影響。如圖4所示：發(fā)酵菌接種量為0.20 g/100 mL時(shí)，產(chǎn)品感官評(píng)分最高，此時(shí)產(chǎn)品質(zhì)地均勻，細(xì)膩黏稠，無(wú)分層結(jié)塊和乳清析出，酸度適宜；當(dāng)接種量低于0.20 g/100 mL時(shí)，產(chǎn)品發(fā)酵不完全，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，口感較差；當(dāng)接種量高于0.20 g/100 mL時(shí)，產(chǎn)品乳清析出量明顯增多且有絮狀物生成，酸度增加，感官評(píng)分降低。結(jié)果表明，當(dāng)大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時(shí)，發(fā)酵菌最適接種量為0.20 g/100 mL。

圖4 發(fā)酵菌接種量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響

2.1.4 木糖醇添加量的影響

木糖醇添加量對(duì)產(chǎn)品口感有較大影響。如圖5所示：木糖醇添加量為3.40 g/100 mL時(shí)產(chǎn)品甜度適宜；隨著木糖醇添加量降低，產(chǎn)品酸度提升，口感下降；隨著木糖醇添加量逐漸提高，產(chǎn)品甜度急劇上升，甜膩感嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)。結(jié)果表明，當(dāng)大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、發(fā)酵菌接種量為0.2 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時(shí)，木糖醇最適添加量為3.40 g/100 mL。

圖5 木糖醇添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響

2.1.5 青稞木薯圓子添加量的影響

青稞木薯圓子添加量對(duì)產(chǎn)品飽腹感有較大影響。如圖6所示：當(dāng)青稞木薯圓子添加量為15%時(shí)，產(chǎn)品飽腹感最強(qiáng)且飽腹程度適宜，該比例對(duì)酸奶本身口感無(wú)影響，但較強(qiáng)地增加了評(píng)價(jià)者的咀嚼感及飲用趣味；隨添加量降低，評(píng)價(jià)者飽腹感程度呈明顯下降趨勢(shì)；當(dāng)添加量大于15%時(shí)，部分評(píng)價(jià)者開(kāi)始出現(xiàn)咀嚼困難和胃部飽脹的情況。結(jié)果表明，當(dāng)大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、發(fā)酵菌接種量為0.2 g/100 mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL時(shí)，青稞木薯圓子最適添加量為15%。

圖6 青稞木薯圓子添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響

2.2 大麥若葉代餐羊酵乳配方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

大麥若葉粉添加量（A）、大麥若葉多糖添加量（B）、發(fā)酵菌接種量（C）、木糖醇添加量（D）和青稞木薯圓子添加量（E）的5個(gè)因素4個(gè)水平的正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。在5個(gè)因素中，影響大麥若葉代餐羊酵乳感官品質(zhì)的次序?yàn)榇篼溔羧~粉添加量（A）＞木糖醇添加量（D）＞發(fā)酵菌接種量（C）＞青稞木薯圓子添加量（E）＞大麥若葉多糖添加量（B）。產(chǎn)品最優(yōu)生產(chǎn)工藝為A2B3C2D3E3，即大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL，木糖醇添加量3.4 g/100 mL，發(fā)酵菌接種量0.2 g/100 mL，青稞木薯圓子添加量15%，大麥若葉多糖添加量0.70 mg/mL。按照最優(yōu)組合制備的大麥若葉代餐羊酵乳產(chǎn)品的感官評(píng)分95分，顯著高于其他組合。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 大麥若葉代餐羊酵乳的抗氧化活性

2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）在氧化劑作用下被氧化成綠色的ABTS+自由基，測(cè)定體系在734 nm處的吸光度；當(dāng)體系中存在抗氧化劑時(shí)，能夠抑制該氧化反應(yīng)的發(fā)生，并降低反應(yīng)體系在734 nm處的吸光度[15]。試驗(yàn)以Trolox（1 mmol/L）溶液為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，比對(duì)檢測(cè)純羊酵乳、大麥若葉多糖及大麥若葉代餐羊酵乳的抗氧化能力，結(jié)果如圖7所示。純羊酵乳抗氧化能力較低，僅為1.99±0.014 mmol/L Trolox，純化大麥若葉多糖抗氧化能力為2.475±0.035 mmol/L Trolox，顯著高于純羊酵乳（p＜0.005）。大麥若葉青汁代餐羊酵乳的抗氧化能力為2.41±0.014 mmol/L Trolox，與純化大麥若葉多糖相近，顯著高于純羊酵乳（p＜0.005）。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明大麥若葉代餐羊酵乳具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖7 大麥若葉代餐羊酵乳的抗氧化能力

2.4 大麥若葉代餐羊酵乳的降膽固醇活性

在濃硫酸的作用下，鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）上的醛基（—CHO）能與膽固醇的C3位上的羥基（—OH）相互吸附產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)，在波長(zhǎng)550 nm處有最大吸光度[16]，當(dāng)體系中存在膽固醇吸附物質(zhì)時(shí)，OPA與膽固醇形成的紫色物質(zhì)減少，降低在550 nm處的吸光度。因此，OPA可用于檢測(cè)反應(yīng)體系中的膽固醇含量。研究中，以新鮮雞蛋黃液為膽固醇供體，經(jīng)純羊酵乳和大麥若葉代餐羊酵乳分別吸附后，用OPA檢測(cè)體系中的膽固醇含量變化，結(jié)果如圖8所示。純羊酵乳對(duì)膽固醇吸附量較低，僅為1.35±0.212 mg/g，大麥若葉代餐羊酵乳的膽固醇吸附量為2.5±0.141 mg/g，顯著高于純羊酵乳（p＜0.000 5）。這個(gè)結(jié)果表明，大麥若葉代餐羊酵乳比純羊酵乳具有更強(qiáng)的膽固醇吸附能力。

圖8 大麥若葉代餐羊酵乳的降膽固醇活性

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果綜合分析得出，大麥若葉代餐羊酵乳最優(yōu)配方為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL，大麥若葉多糖添加量0.70 mg/mL，木糖醇添加量3.4 g/100 mL，甜菊苷添加量0.01 g/100 mL，混合發(fā)酵菌接種量0.2 g/100 mL，青稞木薯圓子添加量15%。原奶經(jīng)巴氏殺菌后發(fā)酵調(diào)配，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)10 h，加入其他組分后，乳酸菌數(shù)≥109CFU/mL，未檢出大腸桿菌，符合GB 19302—2010《發(fā)酵乳》[17]。該產(chǎn)品不僅含有豐富的乳蛋白，還具有抗氧化和降膽固醇的雙活性，且不影響產(chǎn)品的品質(zhì)。大麥若葉代餐羊酵乳的研制豐富了羊乳加工食品和代餐產(chǎn)品種類(lèi)，擴(kuò)展了大麥若葉的用途，同時(shí)為抗氧化和降膽固醇功能性食品的研發(fā)提供了新思路。