鎘脅迫對(duì)巴西蘑菇鎘亞細(xì)胞分布和非蛋白巰基的影響

周宇，張聰慧，翁伯琦，陳華，劉朋虎

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福州 350013；3. 福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福州 350002）

巴西蘑菇（）又稱姬松茸、小松口蘑、巴氏蘑菇等，屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌科、蘑菇屬，是一種中溫偏高的腐生菌。由于其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。鎘（Cd）具有生物毒性強(qiáng)、遷移速度快、易被菌絲體吸收富集的特點(diǎn)，是食用菌重金屬污染的重要類型之一。相對(duì)于其他食用菌，巴西蘑菇對(duì)鎘具有更強(qiáng)的富集性，鎘超標(biāo)時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響巴西蘑菇的食用價(jià)值和出口創(chuàng)匯。因此，采取措施保障巴西蘑菇綠色安全生產(chǎn)已成為目前研究熱點(diǎn)之一。前人對(duì)食用菌鎘耐性和鎘解毒機(jī)制開展了較多研究，已在低鎘積累菌株篩選、鎘富集機(jī)制、鎘解毒機(jī)制、抑制消減雜交技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組等方面取得一定成果，對(duì)食用菌鎘污染防控提供了借鑒，但目前巴西蘑菇鎘富集機(jī)制研究仍不全面。

食用菌對(duì)鎘的富集過(guò)程主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是生物吸附作用，即細(xì)胞外多聚物和細(xì)胞壁上多糖等有機(jī)物，通過(guò)共價(jià)、靜電或分子引力的作用將Cd吸附在菌絲表面；二是主動(dòng)吸收作用，Cd進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后與氨基酸、金屬硫蛋白、含巰基小分子等物質(zhì)結(jié)合，形成特殊的鎘螯合物，減輕鎘對(duì)細(xì)胞的毒害作用。李三暑等通過(guò)酶解法和差速離心法對(duì)巴西蘑菇細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁對(duì)鎘具有較強(qiáng)的截留作用，阻礙大部分鎘進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)。劉高翔的研究也表明，巴西蘑菇子實(shí)體中細(xì)胞壁是鎘主要的富集場(chǎng)所，巴西蘑菇還可作為一種新型的生物吸附劑，用以吸附水溶液中Cd。據(jù)研究，巴西蘑菇不同菌株對(duì)鎘的吸收積累存在很大差異。不同菌株及外源鎘濃度是否影響鎘的亞細(xì)胞分布還未見報(bào)道。

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、植物螯合肽（Phytochelatins，PCs）和半胱氨酸（Cysteine，Cys）等小分子化合物，作為植物體內(nèi)的非蛋白巰基（Non-protein thiols，NPT）化合物能與Cd螯合，形成PC-Cd、GSHCd 和CdS 微晶體等復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)或運(yùn)輸?shù)揭号葜校瑥亩鴾p緩鎘對(duì)植物體的毒害或增強(qiáng)植物對(duì)鎘的耐性。此外，與GSH 代謝密切相關(guān)的解毒酶——谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSHPx）在鎘解毒過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。GSH 在GST 的催化下可與細(xì)胞內(nèi)的Cd絡(luò)合形成復(fù)合物，將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)移到液泡內(nèi)，以達(dá)到緩解鎘毒害的作用。WANG 等研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下巴西蘑菇菌絲體的GST 和GSH-Px 與所有其他抗氧化酶一樣，在誘導(dǎo)金屬硫蛋白合成之前起到保護(hù)作用，提供對(duì)鎘脅迫的第一道防線。然而，目前尚不清楚巴西蘑菇菌絲體鎘的吸收積累是否與小分子巰基化合物有關(guān)。

課題組前期以巴西蘑菇主栽品種J1 為出發(fā)菌株，采用Co誘變技術(shù)獲得鎘富集顯著降低的低鎘菌株J77。本研究利用低鎘菌株J77 及對(duì)照菌株J1 作為試驗(yàn)材料，對(duì)不同濃度鎘脅迫下2個(gè)菌株菌絲中鎘亞細(xì)胞分布，以及鎘螯合相關(guān)的小分子非蛋白巰基化合物含量變化進(jìn)行研究，從細(xì)胞水平和相關(guān)酶活指標(biāo)探討不同濃度鎘脅迫下2個(gè)菌株的響應(yīng)差異，以期為巴西蘑菇耐鎘機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為低鎘巴西蘑菇新品種選育奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為巴西蘑菇J1 和J77，菌株保藏于國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心菌種保種室。

1.2 培養(yǎng)基

復(fù)壯培養(yǎng)基：馬鈴薯230 g、蔗糖20 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂0.5 g、VB10 mg、瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 L，pH值為7。

液體培養(yǎng)基：不加瓊脂，其他同復(fù)壯培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：同復(fù)壯培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)0、2、4、6、8、10 mg·kg6個(gè)梯度處理；將含鎘母液（500 mg·L）配制好備用，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將不同濃度鎘溶液加入培養(yǎng)基中。供試藥品為分析純氯化鎘（CdCl·2.5HO）。

1.4 鎘脅迫下巴西蘑菇菌絲培養(yǎng)

固體培養(yǎng)基（平板）培養(yǎng)：將配制好的鎘母液按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加到固體培養(yǎng)基中，在超凈臺(tái)里將J1和J77 菌種接到固體培養(yǎng)基中，利用打孔器打孔接種，每一個(gè)平板接1 塊大小均一的菌絲體，各處理組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)5 次，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d備用。

液體培養(yǎng)基（靜置）培養(yǎng)：將配制好的鎘母液，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入規(guī)格為250 mL 的錐形瓶中，每瓶液體培養(yǎng)基為100 mL，取一塊復(fù)壯好的平板，利用打孔器打孔接種，每一個(gè)培養(yǎng)瓶接3 塊大小均一的菌絲體，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)10 次，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20 d，滅菌水逐一清洗后，過(guò)濾和收集菌絲，用液氮速凍保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分析測(cè)定項(xiàng)目

1.5.1 測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度

利用十字交叉法測(cè)定10 d 菌絲生長(zhǎng)速度，觀察菌絲形態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)，并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲色澤情況。

1.5.2 菌絲體亞細(xì)胞組分分離

每個(gè)處理稱取5 g新鮮菌絲體進(jìn)行亞細(xì)胞組分分離，取適量溶壁酶（lywallzyme，購(gòu)于廣東省微生物研究所）配制成20 g·L酶液。按1∶10（∶）往菌絲體加入酶液，30 ℃、80 r·min酶解3 h。將酶解后的溶液轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，采用差速離心法進(jìn)行細(xì)胞壁、細(xì)胞器和細(xì)胞液的分離。首先在4 ℃、1 600 r·min離心15 min，所得沉淀為細(xì)胞壁組分（F1），上層液備用；此后在4 ℃、18 000 r·min離心 45 min，上層液為細(xì)胞液組分（F3），所得沉淀為細(xì)胞器組分（F2）。

1.5.3 菌絲體鎘含量測(cè)定

將分離好的細(xì)胞組分置于50 mL 小錐形瓶中，加入10 mL HNO-HClO（9∶1）混合溶液，封口膜封口過(guò)夜，每個(gè)處理重復(fù)3 次。第2 天置于石墨烯電熱板上加熱，緩慢升溫至215 ℃繼續(xù)消煮。直到錐形瓶中的液體由渾濁變?yōu)榍宄和该?，消煮結(jié)束。將消煮好的液體淋洗到10 mL 離心管內(nèi)保存。用型號(hào)為PinAAcle 900T 的火焰原子吸收光譜儀進(jìn)行鎘含量測(cè)定。

1.5.4 理化指標(biāo)測(cè)定

使用雙抗體夾心法測(cè)定GST活性、GSH-Px活性、NPT 含量和GSH 含量，試劑盒購(gòu)于上海通蔚生物科技有限公司。利用差減法計(jì)算PCs 的含量，即PCs=NPT-GSH。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 19.0 軟件中Duncan 多重性方法比較分析同一菌株不同處理間的差異性，皮爾遜方法進(jìn)行相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；采用Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對(duì)J1和J77菌絲生長(zhǎng)情況的影響

不同濃度的外源鎘脅迫對(duì)巴西蘑菇菌絲生長(zhǎng)影響如表1所示，隨著鎘濃度的增加，J1和J77菌絲生長(zhǎng)均受到抑制，由粗壯稀疏逐漸變?yōu)槔w細(xì)濃密，出現(xiàn)氣生菌絲，且J77 氣生菌絲均多于J1（圖1）。當(dāng)鎘濃度為8～10 mg·kg時(shí)，J77 菌絲生長(zhǎng)速度高于 J1。隨外源施加鎘濃度增加，菌絲與培養(yǎng)基的接觸面減小，這可能是菌絲抵御鎘脅迫帶來(lái)的毒害所產(chǎn)生的一種應(yīng)激反應(yīng)。從菌絲色澤來(lái)看，隨外源施加鎘濃度增加，J1 和J77 菌絲均由潔白變?yōu)槲ⅫS（培養(yǎng)10 d 統(tǒng)計(jì)的結(jié)果），待鎘脅迫下菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面時(shí)，菌絲均由微黃色轉(zhuǎn)為黑色直至死亡。

圖1 鎘脅迫對(duì)J1和J77菌絲生長(zhǎng)的影響Figure 1 The effect of Cd stress on the growth of J1 and J77 hyphae

表1 鎘脅迫對(duì)J1和J77菌絲生長(zhǎng)的影響Table 1 The effect of Cd stress on the growth of J1 and J77 hyphae

2.2 鎘脅迫下J1和J77菌絲體中Cd的亞細(xì)胞分布

不同濃度的鎘脅迫下J1 和J77 菌絲體內(nèi)鎘的亞細(xì)胞分布結(jié)果如表2 所示。相同鎘脅迫水平下，J1 和J77 亞細(xì)胞鎘積累量均表現(xiàn)出細(xì)胞壁＞細(xì)胞液＞細(xì)胞器的規(guī)律，細(xì)胞壁鎘含量均顯著高于各細(xì)胞器和細(xì)胞液，大量鎘積累在細(xì)胞壁。隨著外源施加鎘濃度的增加，J1 和J77 菌株各細(xì)胞器組分中的鎘含量均呈上升趨勢(shì)。當(dāng)外源施加鎘濃度達(dá)到10 mg·kg時(shí)，J1 細(xì)胞壁、細(xì)胞器和細(xì)胞液鎘含量分別是J77 菌株的2.6、1.7倍和2.2 倍，說(shuō)明J1 和J77 鎘積累量具有一定的差異性。從各細(xì)胞器組分分配率上看（圖2），隨著鎘脅迫濃度增加，2個(gè)菌株細(xì)胞壁鎘含量占比均表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)；2個(gè)菌株細(xì)胞器鎘含量占比均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，2個(gè)菌株對(duì)照組均顯著高于各處理組；而2個(gè)菌株細(xì)胞液中鎘含量占比表現(xiàn)較為穩(wěn)定，J1 和J77 菌株分別占總量的30%～42% 和29%～36%。此外，從分配率來(lái)看亞細(xì)胞鎘積累量也表現(xiàn)為細(xì)胞壁＞細(xì)胞液＞細(xì)胞器。因此，我們可以推測(cè)細(xì)胞壁具有固持Cd的作用，這可能是巴西蘑菇菌絲體抵御鎘毒害的重要機(jī)制之一。

圖2 巴西蘑菇J1和J77菌絲中Cd的亞細(xì)胞組分分配比例Figure 2 The distribution ratio of Cd subcellular components in the hyphae of A. brasiliensis J1 and J77

表2 巴西蘑菇J1和J77菌絲中鎘的亞細(xì)胞分布Table 2 The subcellular distribution of Cd in the hyphae of A. brasiliensis J1 and J77

2.3 鎘脅迫對(duì) J1 和 J77 菌絲體 GST 和 GSH-Px 活性的影響

鎘脅迫對(duì)J1 和J77 菌株GST 活性的影響見圖3。隨著外源施加鎘濃度的增加，J1 和J77 菌株GST 活性整體波動(dòng)不明顯，J77 菌株GST 活性均高于J1 菌株。J77 菌株在 2～10 mg·kg之間 GST 活性整體低于對(duì)照組。J77 菌株在鎘0、2、4、6、8、10 mg·kg與J1 對(duì)應(yīng)濃度相比，GST活性分別增加了41.64%、17.73%、31.40%、24.03%、28.30%、23.78%。因此，可以推測(cè)出低鎘菌株J77會(huì)產(chǎn)生更多GST，以此來(lái)抵御鎘毒害。

圖3 鎘脅迫對(duì)GST活性的影響Figure 3 The effect of Cd stress on GST activity

圖 4 是 J1 和 J77 菌株 GSH-Px 活性的變化趨勢(shì)，J1 菌株隨著外源施加鎘濃度的增加，GSH-Px 活性呈上升趨勢(shì)。J77 菌株在 0～10 mg·kg范圍內(nèi) GSH-Px活性稍有波動(dòng)，但總體趨于平穩(wěn)，在10 mg·kg時(shí)GSH-Px活性最大，達(dá)262.91 IU·L。在4 mg·kg時(shí)，J77菌株GSH-Px活性與J1菌株相比，增加了34.91%。整體而言，J77菌株GSH-Px活性均高于J1菌株。

圖4 鎘脅迫對(duì)GSH-Px活性的影響Figure 4 The effect of Cd stress on GSH-Px activity

2.4 鎘脅迫對(duì) J1 和 J77 菌絲體 NPT、GSH 和 PCs 含量的影響

鎘脅迫下J1 和J77 菌株NPT 含量變化見圖5，隨外源施加鎘濃度的提高，J1 和J77 的NPT 含量出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。2 菌株NPT 含量均在鎘濃度為2 mg·kg時(shí)達(dá)到最大值，與其對(duì)照相比，J1 菌株和J77 菌株的NPT含量分別增加了17.27%和44.86%。在鎘濃度高于 2 mg·kg時(shí)，J1 菌株和 J77 菌株的 NPT 含量均呈下降趨勢(shì)，且J77菌株的NPT含量均高于J1菌株。

圖5 鎘脅迫對(duì)NPT含量的影響Figure 5 The effect of Cd stress on NPT content

由圖6 所示，隨著外源施加鎘濃度的增加，J1 和J77 中 GSH 含量降低。J1 菌株在鎘濃度為 4 mg·kg時(shí)，GSH 含量最低，對(duì)照組GSH 含量相比下降了20.84%；而 J77 菌株在鎘濃度為 2 mg·kg時(shí)，GSH 含量最低，與對(duì)照組相比下降了11.19%。添加鎘濃度為 0 mg·kg時(shí)，菌株 J1 GSH 含量高于J77，這可能是J1 生長(zhǎng)狀況優(yōu)于 J77 的原因；鎘濃度為 2～10 mg·kg時(shí)，各處理間J77 GSH 含量始終高于菌株J1，說(shuō)明J77菌株在鎘脅迫下產(chǎn)生更多GSH以減少鎘毒害。

圖6 鎘脅迫對(duì)GSH含量的影響Figure 6 The effect of Cd stress on GSH content

由圖 7 所示 ，J1 和 J77 菌株 PCs 含量的變化 與NPT 含量的變化趨勢(shì)一致，均出現(xiàn)先升后降的規(guī)律。J1 菌株和 J77 菌株的 NPT 含量在 2 mg·kg時(shí)達(dá)到最大值，分別為36.05 ng·g和40.51 ng·g，相比于對(duì)照組分別提高了1.1 倍和2.6 倍。在2 mg·kg后，巴西蘑菇J1 菌株和J77 菌株的PCs 含量均顯著下降，最后趨于平穩(wěn)。隨著外源施加鎘濃度的增加，菌株J1 和J77 菌絲體內(nèi)PCs 含量的增加伴隨著GSH 含量的減少，說(shuō)明鎘脅迫下會(huì)使GSH 與PCs 的生物合成受阻，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂。

圖7 鎘脅迫對(duì)PCs含量的影響Figure 7 The effect of Cd stress on PCs content

2.5 鎘脅迫與小分子巰基含量及代謝酶活的相關(guān)性

如表3 所示，對(duì)菌株J1 進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，GST 活性與PCs 含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01）；NPT 含量與PCs 含量也呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01）；鎘脅迫與GSH-Px 活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.05）；鎘脅迫與GST 活性呈正相關(guān)關(guān)系，而與NPT、GSH 和PCs含量之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性均不顯著（＞0.05）。對(duì)菌株J77 進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NPT含量與PCs 含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01）；鎘脅迫與GSH-Px 活性呈正相關(guān)關(guān)系；鎘脅迫與GST 活性及NPT、GSH 和PCs 含量之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性均不顯著（＞0.05）。

表3 不同指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of different indicators

3 討論

巴西蘑菇菌絲對(duì)鎘有很強(qiáng)的富集能力，但其作用機(jī)制仍不清楚。本研究基于課題組前期對(duì)巴西蘑菇富鎘機(jī)制的研究，即在不同濃度鎘脅迫下，分別探究了鎘對(duì)巴西蘑菇菌絲生長(zhǎng)特性、礦物質(zhì)元素吸收以及幾種重要的抗氧化酶活力的影響，初步揭示了巴西蘑菇鎘富集的作用機(jī)制。解析重金屬在細(xì)胞不同部位的積累，對(duì)深入研究富集機(jī)制和金屬耐性機(jī)制至關(guān)重要。本研究對(duì)不同濃度鎘脅迫下J1 和J77 菌絲開展了亞細(xì)胞分布研究，有助于確定重金屬鎘對(duì)不同細(xì)胞部位的富集影響。本研究發(fā)現(xiàn)，J1 和J77 中鎘亞細(xì)胞積累規(guī)律為細(xì)胞壁＞細(xì)胞液＞細(xì)胞器，細(xì)胞壁是主要的儲(chǔ)存場(chǎng)所，在2個(gè)菌株中所占相對(duì)比例約為39%～56%。這與李三暑等以巴西蘑菇為試驗(yàn)材料進(jìn)行亞細(xì)胞分布試驗(yàn)結(jié)果一致，即鎘主要富集在細(xì)胞壁。此外，有研究表明，雙孢蘑菇子實(shí)體中細(xì)胞質(zhì)是大多數(shù)重金屬的主要貯存部位，雙孢蘑菇子實(shí)體中鎘在細(xì)胞質(zhì)占比為44%～93%，在細(xì)胞壁中占比為6.1%～47%，而在混合膜組分中最低。本研究表明，不同食用菌菌株之間亞細(xì)胞鎘積累具有一定差異性，且細(xì)胞壁對(duì)鎘的吸附作用可降低鎘對(duì)菌絲體的毒害。

不同濃度鎘脅迫時(shí)，GST 活性和GSH-Px 活性均表現(xiàn)出菌株J77 高于J1，這可能是造成兩種菌株鎘富集差異顯著的原因之一。李冬琴等發(fā)現(xiàn)，隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻鎘高富集品種欣榮優(yōu)2045 和鎘低富集品種優(yōu)I2009 GST 活性均出現(xiàn)先升后降的規(guī)律。而在本研究中GST活性受鎘脅迫影響不明顯，但鎘低富集菌株J77 GST 活性始終高于菌株J1，說(shuō)明鎘脅迫下不同菌株間和不同抗性材料間GST 活性差異較大，從而表現(xiàn)出巴西蘑菇抗氧化能力的強(qiáng)弱。GSH-Px 是抗氧化酶體系中的重要成員，可催化谷胱甘肽（GSH）轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），將有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，同時(shí)也可以促進(jìn)HO的分解，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受損害。張亞茹等利用鎘脅迫大球蓋菇菌絲體，發(fā)現(xiàn)隨著外源施加鎘濃度的提高，GSH-Px 活性呈現(xiàn)出先升后降的規(guī)律。劉賽等報(bào)道茶樹GSH-Px編碼基因?qū)Ψ巧锩{迫具有一定的抵抗能力。而在本研究中，GSH-Px 活性在兩個(gè)不同抗性的菌株中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的波動(dòng)性。通過(guò)比較鎘脅迫下兩個(gè)菌株的GST 和GSH-Px 活性發(fā)現(xiàn)，同一濃度脅迫下J77 菌株高于J1 菌株，說(shuō)明不同鎘積累型菌株對(duì)鎘脅迫的應(yīng)答機(jī)制存在一定的基因型差異，這可能與兩個(gè)品種GST 酶和GSH -Px 酶的組成、表達(dá)和功能不同有關(guān)。

COLLIN-HANSEN 等通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜儀首次證實(shí)了牛肝菌中含有植物螯合肽物質(zhì)，研究還發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的PCs 物質(zhì)與GSH 含量降低有關(guān)。PCs 和GSH 均含巰基物質(zhì)（—SH），會(huì)與Cd形成螯合物，減少了細(xì)胞質(zhì)中游離Cd的濃度，這些螯合物在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，或?qū)⑵溥\(yùn)輸?shù)揭号葜袇^(qū)室化隔離。有研究表明，在鎘和鋅脅迫下，叢枝菌根真菌通過(guò)增加總NPT 的產(chǎn)生量來(lái)緩解氧化應(yīng)激。HUANG 等的研究也表明叢枝菌根真菌產(chǎn)生的NPT具有防御鎘的毒害作用。此外，在甘蔗、水稻、棉花等植物上也表現(xiàn)出NPT、GSH 和PCs 能提高植物對(duì)鎘的耐受能力，通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解鎘帶來(lái)的毒害作用。而在本研究中，NPT、GSH 和PCs 含量均表現(xiàn)一定的規(guī)律性，隨著施加鎘濃度的增加，NPT 和PCs 含量在兩個(gè)菌株中表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，GSH含量隨鎘濃度提高均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且含量都低于對(duì)照，表明鎘脅迫下巴西蘑菇不同鎘抗性品種巰基物質(zhì)變化不盡相同。

眾多研究表明，鎘螯合與小分子非蛋白巰基化合物含量以及小分子非蛋白巰基化合物代謝酶活性有直接關(guān)系。通過(guò)對(duì)鎘脅迫下細(xì)胞內(nèi)鎘螯合相關(guān)的小分子非蛋白巰基化合物含量變化以及小分子非蛋白巰基化合物代謝酶活力變化的相關(guān)性分析，研究結(jié)果表明，鎘脅迫下菌株J1與GSH-Px 活性呈顯著正相關(guān)，菌株 J77 與 GSH-Px 活性呈正相關(guān)；菌株 J1 與GST活性呈正相關(guān)，菌株J77與GST活性呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在抵御巴西蘑菇鎘毒害中GSH-Px 活性比GST 活性作用明顯。兩種菌株NPT 含量與PCs 含量均呈極顯著正相關(guān)，孫偉華研究表明，隨著鎘脅迫濃度的增加，水稻根部PCs 含量隨之提高，說(shuō)明PCs 在抵抗鎘毒害時(shí)發(fā)揮重要作用。由于與鎘脅迫接觸最密切的菌絲會(huì)以更高的NPT 含量來(lái)消耗GSH，產(chǎn)生大量的PCs。因此在菌絲體內(nèi)對(duì)鎘具有更高耐受性可歸因于PCs對(duì)鎘的螯合能力增強(qiáng)?？梢姡诎臀髂⒐降慕舛緳C(jī)制中PCs發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié)論

（1）在鎘脅迫下，巴西蘑菇2個(gè)菌株鎘富集能力表現(xiàn)出J1 為高富集菌株，J77 為低富集菌株，不同鎘積累菌株間鎘亞細(xì)胞分布均表現(xiàn)為細(xì)胞壁＞細(xì)胞液＞細(xì)胞器，說(shuō)明細(xì)胞壁是菌絲體主要儲(chǔ)存鎘的場(chǎng)所。

（2）在鎘脅迫下，通過(guò)對(duì)菌株J77 和J1 中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性以及相關(guān)性進(jìn)行分析，GSH-Px 在菌株J1 中反應(yīng)更強(qiáng)烈，可能是由于不同菌株間鎘耐性不同導(dǎo)致。

（3）在鎘脅迫下，菌株J77 和J1 中非蛋白巰基（NPT）和植物螯合肽（PCs）含量變化趨勢(shì)一致，呈現(xiàn)出“低促高抑”趨勢(shì)，相關(guān)性分析表明PCs在巴西蘑菇的解毒機(jī)制中發(fā)揮重要作用。