桃金娘果多糖的制備及其免疫增強(qiáng)作用研究

盧光強(qiáng)，劉 偉，曾雪顏，趙 武，姜源明，銀慧慧

(1.廣西隆安縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧 532799；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所,廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

植物多糖已被證實(shí)具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗糖尿病活性等生物活性，在生命科學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)中都得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。目前，抗生素的不規(guī)范使用以及抗生素殘留和抗藥性問題日趨嚴(yán)重，一些抗生素能夠通過動(dòng)物性食品轉(zhuǎn)移到人體中，對(duì)人類的健康造成了嚴(yán)重威脅。植物多糖與抗生素作用性質(zhì)相同，并且具有高效、低毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞飼料中添加一定量的黃芪多糖，能夠改善三黃肉雞的生長(zhǎng)性和其腸道微生物菌群系統(tǒng)[3-4]；在飼糧中添加復(fù)合益生菌和黃芪多糖能夠提高生長(zhǎng)育肥豬的免疫功能[5]；茯苓多糖和白術(shù)多糖能顯著提高仔豬生長(zhǎng)性能[6-7]；馬尾藻多糖可以促進(jìn)豬和雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖[8-9]。這些研究顯示，植物多糖作為一種綠色新型畜禽用飼料添加劑得到了廣泛關(guān)注。桃金娘Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.為桃金娘科桃金娘屬常綠多花小灌木，是我國(guó)南方地區(qū)民間傳統(tǒng)習(xí)用中草藥，自然分布在熱帶及亞熱帶，我國(guó)主要生長(zhǎng)在南部各省[10]。據(jù)《全國(guó)中草藥匯編》記載，桃金娘性味甘、澀、平，全株可供藥用，具有活血通絡(luò)、收斂止瀉、補(bǔ)虛止血功效。當(dāng)前對(duì)桃金娘的化學(xué)成分及生物活性有了比較深入的研究[11-12]，但對(duì)桃金娘多糖的作用機(jī)制研究較少。本研究通過制備桃金娘果多糖，初步探究桃金娘果多糖在小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用，為加大桃金娘的藥用開發(fā)力度，用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高動(dòng)物免疫力提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 桃金娘果(產(chǎn)地：廣西玉林，經(jīng)廣西獸醫(yī)研究所獸藥新技術(shù)開發(fā)中心鑒定為桃金娘果實(shí)，干燥后打粉，過四號(hào)篩)。小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、γ干擾素(IFN-γ)、過氧化物酶(POD)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶(LZM)試劑盒購自上海聯(lián)酶生物科技有限公司；生理鹽水購自江西御醫(yī)堂實(shí)業(yè)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技公司)；1260型液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Cary 50紫外分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)；分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；TECAN model Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)，恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 動(dòng)物和飼料 SPF級(jí)昆明小鼠80只，雌雄各半，體重(20±2)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物房溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，小鼠自由攝食及飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。SPF飼料由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 桃金娘果多糖的制備 采用水浴提取法，料液比1∶10，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間90 min，過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再按10∶1的比例加入5%的101果汁澄清劑，攪拌混勻室溫放置12 h后離心，上清液用95%乙醇醇沉，離心，沉淀揮干試劑，水復(fù)溶，用10 ku半透膜流動(dòng)純化水透析12 h，95%乙醇醇沉，干燥得桃金娘果多糖。

1.4.2 桃金娘果多糖的含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取桃金娘果多糖樣品3份， 溶解后采用苯酚-硫酸法[13]測(cè)定其吸光度，從回歸方程中求出桃金娘果多糖含量。多糖含量按照下式計(jì)算：

式中，m-多糖質(zhì)量(mg)；c-多糖溶液中糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；V-供試液的體積(mL)；D-多糖稀釋倍數(shù)；a%-桃金娘果粉末水分含量；0.9-葡萄糖對(duì)多糖的校正系數(shù)。

1.4.3 單糖組分分析 參照文獻(xiàn)方法[14]，分別取1 mL多糖溶液(4 mg/mL)于水解瓶中，加入1 mL 4 mol/L的三氟乙酸溶液，在110 ℃下孵育3 h，冷卻至室溫后氮?dú)獯蹈?，然后加? mL純水溶解得到水解樣品。在0.5 mL水解樣品中加入0.3 mol/L的NaOH溶液和0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液各0.5 mL，在70 ℃下避光孵育100 min，冷卻至室溫后加入0.5 mL 0.3 mol/L HCL溶液，混勻得到衍生化樣品。衍生化樣品用氯仿萃取除去PMP，水相離心后取上清液進(jìn)行測(cè)定。單糖混合對(duì)照品溶液同上進(jìn)行衍生化。

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH 6.7)=17∶83(體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速為1.0 mL/min。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 將80只昆明種小鼠隨機(jī)平均分成空白組、黃芪多糖組、桃金娘果多糖低、中、高劑量組共5組。黃芪多糖組每只小鼠按200 μg/(g·BW)劑量腹腔注射黃芪多糖混懸液，桃金娘果多糖低、中、高劑量組分別按50、100、200 μg/(g·BW)劑量腹腔注射桃金娘果多糖混懸液，空白組每只小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水0.02 mL/(g·BW)，1 次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.4.5 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重。眼球采血，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存待用；頸椎脫臼處死小鼠，取其胸腺、脾臟洗凈、吸干后稱量，按下式公式計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.4.6 小鼠血清細(xì)胞因子含量測(cè)定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重。眼球采血，分離血清，根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、(γ干擾素)IFN-γ、溶菌酶(LZM)、過氧化物酶(POD)指標(biāo)的含量。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以± s表示, 用SPSS17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和鄧肯氏多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃金娘果多糖含量測(cè)定及組分分析 按照1.4.2項(xiàng)測(cè)定不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到吸光度值y對(duì)濃度c的回歸方程為：y=0.0722x+0.0132(R2=0.9992)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～80.57 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。按照1.4.1項(xiàng)提取得到的桃金娘果多糖含量為65.83±1.40%。

隨后對(duì)桃金娘果多糖進(jìn)行組分分析，表明桃金娘果多糖至少由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成(圖1)，其物質(zhì)的量比為0.08∶0.01∶0.08∶1.00∶0.08∶0.01∶0.06。

A-混合單糖對(duì)照品；B-多糖水解單糖樣品1、甘露糖；2、鼠李糖；3、半乳糖醛酸；4、葡萄糖；5、半乳糖；6、木榶；7、阿拉伯糖。A- Mixed monosaccharide reference substance; B-Polysaccharide hydrolysis monosaccharide sample1. mannose; 2. rhamnose; 3. galacturonic acid; 4. Glucose; 5. Galactose; 6. xylose; 7. arabinose圖1 桃金娘果多糖中各單糖液相色譜圖Fig 1 Liquid chromatography diagram of monosaccharidesin Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide

2.2 桃金娘果多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 桃金娘果多糖對(duì)健康小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響見表1，桃金娘果多糖中、高劑量組的胸腺指數(shù)與空白組比較明顯下降，差異顯著(P<0.05)，桃金娘果多糖中、低劑量組和黃芪多糖組與空白組比較胸腺指數(shù)有所降低但無顯著差異(P>0.05)。與空白組比較，黃芪多糖組以及桃金娘低、中、高劑量組的脾臟指數(shù)顯著性增高(P<0.05)。

表1 桃金娘果多糖對(duì)健康小鼠免疫器官指數(shù)的影響Tab 1 Effect of Rhodomyrtus tomentosa polysaccharide on immune organ index of healthy mice

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)(下同)。

2.3 桃金娘果多糖對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子的影響 由表2看出，與空白組比較，桃金娘果多糖中、高劑量組顯著提高了IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ血清細(xì)胞因子的水平(P<0.05)；桃金娘果多糖低劑量組的IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ細(xì)胞因子與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組則顯著提高了IL-6血清細(xì)胞因子含量，差異顯著P值<0.05。

表2 桃金娘果多糖對(duì)健康小鼠細(xì)胞因子水平的影響Tab 2 Effect of Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide on cytokine levels in healthy mice

2.4 桃金娘果多糖對(duì)小鼠溶菌酶和過氧化物酶的活性影響 桃金娘果多糖對(duì)小鼠溶菌酶和過氧化物酶的活性影響見表3。由表3可知，與空白組比較，黃芪多糖組和桃金娘果多糖低、中劑量組均可顯著增加小鼠的POD活性(P<0.05)，桃金娘果多糖低、中、高劑量組小鼠的LZM含量得到了顯著提高(P<0.05)，黃芪多糖組與空白組比較LZM含量顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 桃金娘果多糖對(duì)健康小鼠POD和LZM活性的影響Table 3 Effect of Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide on the activity and content in healthy mice

3 討論與小結(jié)

桃金娘是一種食藥同源的野生藥用植物資源，富含多糖、黃酮類、酚類等多種生物活性成分。本研究提取得到的桃金娘果多糖含量為65.83%，主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成。作為重要的免疫器官，胸腺和脾臟重量的變化能夠直接反映藥物對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱。研究顯示[15-16]，多糖對(duì)小鼠的胸腺和脾臟具有一定的修復(fù)作用。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，桃金娘果多糖顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)，但桃金娘果多糖高劑量顯著降低了小鼠的胸腺指數(shù)，提示桃金娘果多糖對(duì)小鼠的免疫器官有一定的影響，濃度越高，影響越大。促炎細(xì)胞因子IL-1β主要參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)以及免疫性炎癥反應(yīng)等。IL-2細(xì)胞因子又稱T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有B細(xì)胞增殖、活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞功能等生物功能作用。IFN-γ是機(jī)體免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，是激活免疫細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)分子。IL-6具有B細(xì)胞分化生物功能，參與T細(xì)胞的早期激活。有研究顯示[17-18]，青蒿多糖和山藥多糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ水平，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌等。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，桃金娘果多糖中、高劑量組顯著提高了IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ血清細(xì)胞因子的水平，提示桃金娘果多糖可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平而對(duì)機(jī)體的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。

過氧化物酶POD能夠?qū)⒀趸€原反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)過氧化氫水解，并達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。溶菌酶LZM能夠發(fā)揮催化作用破壞某些細(xì)菌細(xì)胞壁，從而保護(hù)機(jī)體不受細(xì)菌的感染。有研究顯示[19-20]，黃芪多糖和山豆根多糖對(duì)POD和LZM具有調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，桃金娘果多糖低、中劑量組均可顯著增加小鼠的POD活性，桃金娘果多糖低、中、高劑量組小鼠的LZM含量得到了顯著提高。

桃金娘果多糖具有改善小鼠免疫功能的作用。在本試驗(yàn)條件下，桃金娘果多糖能夠顯著提高健康小鼠的脾臟指數(shù)、細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-2、POD和LZM的含量，但濃度過高會(huì)引起小鼠胸腺萎縮。這一研究結(jié)果為桃金娘在飼料添加劑、動(dòng)物保健及藥用資源的深度開發(fā)和應(yīng)用等方面提供一定的參考依據(jù)。