基于LC-QTOF-MS代謝組學(xué)研究甲基苯丙胺臨床戒毒分期

王敬淇，王 葉，張 藝，梁軍成，鄧艷萍，杭太俊*，宋 敏**

（1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009；2國家禁毒委員會(huì)辦公室中國藥科大學(xué)禁毒關(guān)鍵技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3北京大學(xué)中國藥物依賴性研究所，北京 100191）

甲基苯丙胺的濫用是全球公共衛(wèi)生安全的一大隱患［1］。甲基苯丙胺作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮劑，能增加兒茶酚胺類物質(zhì)的釋放，并部分阻斷其再攝?。?］，從而間接產(chǎn)生多種中樞和外周效應(yīng)，如精神運(yùn)動(dòng)的激活、欣快感和食欲下降等［3］。長期或過量使用將產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)包括情緒躁動(dòng)，焦慮憤怒，精神病［4-5］，胃腸道、內(nèi)分泌并發(fā)癥和心血管疾病等［6］。甲基苯丙胺的高復(fù)吸率和嚴(yán)重濫用，不僅給成癮者的身體及精神帶來損傷，還對(duì)其家庭生活和社會(huì)安全帶來嚴(yán)重影響［7］。

生物標(biāo)志物已廣泛運(yùn)用于臨床醫(yī)學(xué)中，可通過對(duì)生物標(biāo)志物的分析來對(duì)疾病進(jìn)行分期，也可以作為疾病預(yù)后的指標(biāo)和監(jiān)測(cè)疾病對(duì)治療的反應(yīng)［8］。因此可根據(jù)甲基苯丙胺成癮者和戒毒康復(fù)者體內(nèi)相關(guān)生物標(biāo)志物的變化對(duì)甲基苯丙胺成癮及戒毒階段進(jìn)行科學(xué)判斷。雖然在甲基苯丙胺成癮的研究中生物標(biāo)志物的研究日益增多，生物標(biāo)志物的檢測(cè)技術(shù)也越來越多樣化，但用于臨床輔助診斷的數(shù)目還很有限［7］。一方面，國內(nèi)外甲基苯丙胺成癮生物標(biāo)志物的研究主要基于動(dòng)物模型進(jìn)行探索，通過研究藥物成癮的動(dòng)物尿樣或血樣的代謝輪廓，觀察成癮引起的代謝特征［9-11］。而動(dòng)物與人體的代謝物存在一定差異，動(dòng)物研究中提出的甲基苯丙胺相關(guān)潛在生物標(biāo)志物需要在臨床實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證；另一方面，進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段的生物標(biāo)志物大多基于基因組學(xué)或蛋白組學(xué)進(jìn)行探究，研究表明，甲基苯丙胺成癮者血漿中的micro-RNA［12］、多種血清蛋白質(zhì)［13］和補(bǔ)體因子H［14］水平與健康人相比有所變化。與其他組學(xué)相比，人類代謝組學(xué)研究將更為直接，2019年Lin等［15］首次對(duì)甲基苯丙胺成癮者血清代謝輪廓進(jìn)行了研究，但目前在甲基苯丙胺成癮方面的人類代謝組學(xué)研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

代謝組學(xué)通過檢測(cè)細(xì)胞［16-18］、組織［19］、器官或體液中的數(shù)千個(gè)小分子來觀察整個(gè)機(jī)體的生化變化，隨后采用信息學(xué)技術(shù)定義代謝組學(xué)特征［11］。代謝組學(xué)是描述由疾病或異常狀況引起的代謝系統(tǒng)紊亂的有力工具，并已成功應(yīng)用于疾病診斷［20］、生物標(biāo)志物篩選［21-22］和代謝途徑表征［23］等許多領(lǐng)域。本研究基于代謝組學(xué)，采用了高靈敏、高通量的液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（LCQTOF-MS）分析技術(shù)，分別對(duì)甲基苯丙胺成癮者、戒毒康復(fù)者和健康人的血漿、血清和尿液進(jìn)行分析，尋找代謝物與代謝途徑之間的聯(lián)系，旨在發(fā)現(xiàn)能用于甲基苯丙胺臨床戒毒分期的潛在生物標(biāo)志物，為甲基苯丙胺成癮的科學(xué)判斷提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 試劑與儀器

乙腈（HPLC 級(jí)，德國默克公司）；丙酮、甲酸（AR 級(jí)，南京化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（中國屈臣氏公司）；LCMS-9030四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（日本島津公司）。

1.2 樣品收集

采用病例對(duì)照研究的方法，進(jìn)行甲基苯丙胺成癮、戒毒康復(fù)者與健康人對(duì)照的代謝組學(xué)研究。試驗(yàn)組選擇確診的甲基苯丙胺成癮者，分為兩組，試驗(yàn)Ⅰ組（急性期組）為新入院甲基苯丙胺成癮者，試驗(yàn)Ⅱ組（康復(fù)期組）為甲基苯丙胺成癮戒毒康復(fù)者；對(duì)照組（健康組）為健康志愿者。試驗(yàn)組甲基苯丙胺成癮者近6個(gè)月每周使用甲基苯丙胺不少于3次，濫用時(shí)間在2年以上（康復(fù)者指戒斷前狀況），試驗(yàn)Ⅰ組要求末次使用甲基苯丙胺時(shí)間不大于24 h，尿液檢測(cè)甲基苯丙胺陽性；試驗(yàn)Ⅱ組要求甲基苯丙胺成癮者戒毒康復(fù)6 ～7 個(gè)月（180 d ～210 d）；對(duì)照組要求性別年齡與試驗(yàn)組受試者相匹配，同性別、年齡相差不超過3歲，來源于醫(yī)院體檢或招募的無藥物濫用史的健康受試者。收集樣本信息見表1。

本研究經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審閱并獲批準(zhǔn)，參加試驗(yàn)患者均簽署了知情同意書，同意參加本試驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

將血清、尿液或血漿樣品在4 ℃下解凍并渦旋10 s。

血清：取冷卻至4 ℃的甲醇-丙酮（9∶1）300 μL加入血清樣本100 μL中，劇烈渦旋3 min，并在4 ℃下，以14 000 r/min 離心15 min。取上清液100 μL在真空離心濃縮儀中揮干，并在-80 ℃下保存。用水-乙腈（9∶1）100 μL 復(fù)溶殘?jiān)?，渦旋3 min，在4 ℃下，以14 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)樣。

血漿：取冷卻至4 ℃的甲醇-丙酮（9∶1）150 μL加入血漿樣本50 μL 中，劇烈渦旋3 min，后續(xù)前處理方法同血清樣品。

尿液：取冷卻至4 ℃的甲醇-水（1∶1）100 μL 加入尿液樣品50 μL 中，渦旋振蕩3 min，在4 ℃下以14 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)樣。

QC：血清、血漿和尿液樣品各取40 μL，分別混合后等份分裝，處理方法同樣品，制備成血清、血漿和尿液QC樣品。

2.2 LC-QTOF-MS分析

2.2.1 色譜條件 采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為水-乙腈-甲酸（95∶5∶0.1），B 相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。尿液線性梯度洗脫（A∶B）：0 min（95∶5）→2 min（95∶5）→23 min（70∶30）→37 min（10∶90）→42 min（10∶90）→43 min（95∶5）→50 min（95∶5）。血漿和血清線性洗脫條件（A∶B）：0 min（95∶5）→2 min（95∶5）→30 min（10∶90）→35 min（10∶90）→36 min（95∶5）→44 min（95∶5），流 速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，尿液和血漿樣品進(jìn)樣量為10 μL，血清樣品進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離（ESI）源在正電離和負(fù)電離模式下運(yùn)行。質(zhì)譜參數(shù)如下：正電離模式噴霧電壓4.0 kV，負(fù)電離模式噴霧電壓-3.0 kV，霧化氣體流量為3.0 L/min，干燥氣體流量為10.0 L/min，加熱氣體流量10.0 L/min，接口溫度300 ℃。使用氬氣進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)（CID）。MS 數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）模式進(jìn)行記錄。在開始分析批次之前，將QC 樣品連續(xù)測(cè)定5 次，批次間每測(cè)定6 個(gè)樣本后分析1次QC樣品。

2.3 數(shù)據(jù)處理

將采集得到的LC-QTOF-MS 數(shù)據(jù)用數(shù)據(jù)處理軟件（SignpostTMMS 2.1.3）進(jìn)行前處理，去噪音、峰對(duì)齊、峰合并和歸一化提取峰信息。按照80%規(guī)則對(duì)導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行共有峰篩選和缺少值填補(bǔ)。經(jīng)預(yù)處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量（t 檢驗(yàn)）和多變量分析（PLS-DA 和OPLS-DA），多變量分析后的模型需經(jīng)過200 次置換檢驗(yàn)，左側(cè)所有的Q2和R2均需小于右側(cè)的原始值，則證明模型有效，未過度擬合。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)LC-QTOF-MS（ESI+）數(shù)據(jù)，PLS-DA的二維得分圖如圖1 所示。血漿（圖1-A），血清（圖1-B）和尿液（圖1-C）的PLS-DA 得分圖可以清楚地將甲基苯丙胺急性期組、康復(fù)期組和健康組3組分開。

根據(jù)LC-QTOF-MS（ESI-）數(shù)據(jù)，PLS-DA 的二維得分圖和三維得分圖如圖2 所示。血清的PLS-DA的二維得分圖可以清楚地區(qū)分3組，血漿和尿液的PLS-DA 的二維得分圖無法將3 組完全分開，但是三維得分圖可以清楚地將甲基苯丙胺急性期組、康復(fù)期組和健康組3組分開。

2.5 潛在生物標(biāo)志物篩選

為了篩選出更加可靠的潛在生物標(biāo)志物，將單變量分析和多變量分析相結(jié)合。潛在的生物標(biāo)志物需滿足以下條件：（1）根據(jù)OPLS-DA 模型中投影變量重要性VIP（變量VIP ＞1 被認(rèn)為對(duì)分組具有重要貢獻(xiàn)）篩選出差異物；（2）通過S-plot（|p（corr）|＞0.5，|p|＞0.1，ESI+和ESI-模式下結(jié)果分別見表2、表3）檢驗(yàn)上述差異物的可靠性；（3）最后通過t 檢驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證（P ＜0.05 被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖3）。

2.6 生物標(biāo)志物的鑒定

根據(jù)篩選出的潛在生物標(biāo)志物的離子特征，選擇質(zhì)子化的分子和/或其他豐度最高的加合物離子作為前體離子進(jìn)行MS/MS 分析。將得到的MS/MS 譜圖與人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）中的參考標(biāo)準(zhǔn)比較。在LC-QTOF-MS（ESI+）模式下，分別從血漿、尿液和血清中鑒定出11，4 和2 個(gè)差異代謝物（表2），LC-QTOF-MS（ESI?）模式下，分別從血漿、尿液和血清中鑒定出7，2 和1 個(gè)差異代謝物（表3）。

Figure 1 PLS-DA score plots of plasma(A),serum(B)and urine(C)detected by LC-QTOF-MS(ESI+)A:R2X=0.401,R2Y=0.852,Q2=0.721;B:R2X=0.416,R2Y=0.828,Q2=0.624;C:R2X=0.204,R2Y=0.708,Q2=0.386

與健康組相比，甲基苯丙胺急性期組血漿中溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）（20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）/0∶0），LysoPC（18∶2（9Z，12Z）/0∶0），LysoPC（16∶0）/0∶0），LysoPC（18∶1（9Z）/0∶0），尿中3-羥基-3-（4-羥基苯基）丙酸水平升高；血漿中鞘磷脂（SM）（d18∶1/16∶0），三氟乙酸和溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）（20∶2（11Z，14Z）/0∶0），血清中反式-S-（1-丙烯基）-L-半胱氨酸，LysoPC（18∶2（9Z，12Z）/0∶0），尿中3-羥基壬酰基肉堿水平降低。與健康組比較，甲基苯丙胺康復(fù)期組血漿中L-肉堿，尿中硫酸鹽水平升高；血漿中LysoPE（20∶2（11Z，14Z）/0∶0），LysoPE（20∶0/0∶0），LysoPE（18∶0/0∶0），三氟乙酸，3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸，尿液中孕二醇在水平降低。

與康復(fù)期組相比，甲基苯丙胺急性期組血清中LysoPE（22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z）/0∶0），血漿中LysoPC（18∶1（9Z）/0∶0）、LysoPC（16∶0/0∶0）、LysoPC（18∶2（9Z，12Z）/0∶0）、血小板激活因子和LysoPC（20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）/0∶0），尿中3-羥基壬酰基肉堿水平升高；尿中雌酮水平降低。

2.7 代謝通路分析

根據(jù)表2 和表3 所示的潛在生物標(biāo)志物，應(yīng)用MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行代謝物富集分析，篩選出了可能受到影響的相關(guān)代謝途徑（見圖4、圖5）。甲基苯丙胺急性期組血漿中的SM（d18∶1/16∶0）水平降低，LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）水平上調(diào)，提示脂質(zhì)代謝紊亂；康復(fù)期組L-肉堿合成增強(qiáng)，脂肪酸代謝增強(qiáng)，提示能量代謝異常；硫酸鹽水平顯著升高，硫酸鹽/亞硫酸鹽代謝異常；尿中孕二醇水平降低，性激素代謝異常。

流行病學(xué)研究表明，精神癥狀的發(fā)作可能與性激素的分泌變化有關(guān)［24-25］。孕二醇是孕激素的主要代謝產(chǎn)物，首次被報(bào)道為精神分裂癥的生物標(biāo)志物［26］。甲基苯丙胺誘發(fā)的精神癥狀通常與精神分裂癥患者的急性精神病發(fā)作的臨床癥狀難以區(qū)分，可能有共同的發(fā)病機(jī)制［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，甲基苯丙胺康復(fù)期組尿中孕二醇水平下調(diào)，與康復(fù)期組相比，急性期組雌酮水平上調(diào)，這一現(xiàn)象可能與甲基苯丙胺成癮引起的精神癥狀有關(guān)，分析原因?yàn)榧谆奖烽L期作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，進(jìn)而誘發(fā)了精神癥狀，未來可通過研究該潛在生物標(biāo)志物具體的作用機(jī)制，明確甲基苯丙胺成癮與精神分裂癥之間的關(guān)系。

Figure 2 PLS-DA score plots of plasma(A),urine(B)and serum(C)detected by LC-QTOF-MS(ESI-)A:R2X=0.323,R2Y=0.931,Q2=0.732;B:R2X=0.252,R2Y=0.297,Q2=0.101;C:R2X=0.355,R2Y=0.69,Q2=0.539

脂質(zhì)代謝紊亂可能與精神分裂癥有關(guān)，另外其在心血管疾病和糖尿病的發(fā)病機(jī)制中也起著至關(guān)重要的作用，脂質(zhì)可能是連接精神分裂癥和代謝綜合征的重要生物標(biāo)志物［26］。SM 是一類存在于細(xì)胞膜內(nèi)的脂質(zhì)，參與許多細(xì)胞過程的調(diào)控，包括細(xì)胞凋亡［28］，SM 代謝的紊亂對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)系統(tǒng)具有重要影響。LysoPC 主要由磷脂酶A2 催化磷脂酰膽堿而來，與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病之間都存在有密切的聯(lián)系，如精神分裂癥、阿爾茨海默病和糖尿病等［29］。血小板激活因子是一種磷脂炎癥因子，其在血漿中水平的上升與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷之間存在密切聯(lián)系［30］。本研究中，相比于健康組，甲基苯丙胺康復(fù)期組血漿中SM（d18∶1/16∶0）下調(diào)，急性期組LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）上調(diào)；相比于康復(fù)期組，急性期組血小板激活因子、LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）上調(diào)。此外，上述4 種LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）在甲基苯丙胺康復(fù)期組與健康組之間沒有顯著差異，這表明上述LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）在甲基苯丙胺康復(fù)期可能已恢復(fù)到正常水平。這些脂類物質(zhì)的改變，表明機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂。這些物質(zhì)可能與甲基苯丙胺成癮引起的精神癥狀和心血管等疾病有關(guān)，但甲基苯丙胺誘發(fā)這些疾病的具體機(jī)制還不清楚，后續(xù)可通過作用機(jī)制的研究，找到甲基苯丙胺成癮與這些疾病的關(guān)系。

Table 2 Identified metabolites detected by LC-QTOF-MS(ESI+)

Table 3 Identified metabolites detected by LC-QTOF-MS(ESI?)

3 結(jié) 論

本研究采用LC-QTOF-MS 技術(shù)對(duì)甲基苯丙胺成癮者、戒毒康復(fù)者和健康人的血漿、血清和尿液進(jìn)行分析，觀察其代謝輪廓，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的生物標(biāo)志物?？偟膩碚f，上述潛在生物標(biāo)志物暗示了甲基苯丙胺成癮者的脂質(zhì)代謝紊亂以及甲基苯丙胺戒毒康復(fù)者硫酸鹽/亞硫酸鹽代謝、脂質(zhì)代謝和性激素代謝紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺康復(fù)期孕二醇和甲基苯丙胺急性期LysoPC 水平異常，可能與甲基苯丙胺成癮引起的精神癥狀有關(guān)。本研究為甲基苯丙胺臨床戒毒分期的科學(xué)判斷提供了可能性，但由于樣本量較小，而潛在標(biāo)志物可能會(huì)受到許多因素的影響，有必要對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并對(duì)其潛在機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

Figure 3 Column bar graphs (mean with SD)for significantly changed metabolites detected by LC-QTOF-MS in plasma (A)and serum (B)and urine(C)Significance level is indicated with asterisks*P＜0.05; **P＜0.01;***P＜0.001; ****P ＜0.0001

Figure 4 Metabolite set enrichment analysis of potential biomarkersA:Metabolite set enrichment analysis of potential biomarkers between MAMP recovery group and healthy group;B:Metabolite set enrichment analysis of potential biomarkers between MAMP acute group and recovery group. P-value (more than expected by chance within the given compound list); Enrichment Ratio=Observed hits/Expected hits.

Figure 5 Summary of metabolic pathways related to potential biomarkers. Box indicates the potential biomarkers. Orange-colored symbols indicate up-regulations of metabolites in acute group or recovery group compared with healthy group and acute group compared with recovery group,while bluecolored symbols indicate down-regulations