達(dá)沙替尼白蛋白膠束的制備與表征

汪文蝶，周繼源，唐麗丹，殷婷婕**

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，常州 213000；2中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，南京 211198）

達(dá)沙替尼（dasatinib，DAS）作為第二代酪氨酸激酶抑制劑，是一種非常有效的抑制白血病融合基因BCR-ABL 的分子靶向藥物，對于治療慢性骨髓性白血?。–ML）和費城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血?。≒h+ALL）治療效果顯著［1］。近年來，DAS 相關(guān)臨床實驗研究表明，DAS 具有抑制多種實體瘤的增殖、防止腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［2］，但其進入機體后不能特異性蓄積于腫瘤組織，因此在抗腫瘤的同時產(chǎn)生嚴(yán)重系統(tǒng)（如胃腸道、造血系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)）不良反應(yīng)。已有報道DAS 與非疾病相關(guān)的細(xì)胞相互作用而引起嚴(yán)重的血液學(xué)和非血液學(xué)不良反應(yīng)［3］，導(dǎo)致臨床上劑量減少或治療中斷，限制其在實體瘤治療領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。

為了提高DAS 的實體瘤靶向利用率，研究人員探索開發(fā)DAS 的新型納米制劑，以期達(dá)到增效減毒的目的。但目前DAS 新制劑的相關(guān)報道較少，僅有納米粒、脂質(zhì)體、嵌段共聚物、聚合物前藥，且前述已報道的新制劑均存在載藥量低（均小于5%）的缺陷，限制了DAS 高效納米制劑的研發(fā)進程［4-6］。

白蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性；同時有研究發(fā)現(xiàn)，DAS 與白蛋白具有一定的親和力［7］，提示基于白蛋白的納米載體有荷載DAS的潛力。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）由重復(fù)的氧乙烯基組成，其具有高度的親水性。PEG 化的納米制劑，可以降低膠束在體內(nèi)遞送藥物過程中與血液蛋白質(zhì)的結(jié)合率，能夠有效避免載藥膠束被體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬而清除［8］，從而提升修飾型白蛋白納米制劑的血循環(huán)時間，提高藥物半衰期及其在腫瘤部位的蓄積。

本研究基于已設(shè)計合成的烷基化白蛋白［8］，對其進行PEG 化修飾形成PEG-DSA，并評價其作為DAS 新型高效膠束載體的潛力。以圓二色譜、核磁共振氫譜、元素分析法、紅外光譜等方法對載體進行了表征；同時采用單因素考察對PEG-DSA/DAS 膠束的制備工藝篩選優(yōu)化，制得高載藥量的目標(biāo)制劑，并對其體外穩(wěn)定性和釋放行為進行了研究。

1 材 料

1.1 試 劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、十二醛、達(dá)沙替尼（上海阿拉丁生物科技有限公司）；甲氧基-聚乙二醇3400-氨基琥珀酰亞胺琥珀酸酯（CH3O-PEG3400-NHS，上海芃碩生物科技有限公司）；硼氫化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；吐溫80（南京威爾化工有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

PHS-3BW pH 計（南京晚晴儀器有限公司）；LGJ-10A-50 冷凍干燥機、Beidi-ⅡYJ 超聲波細(xì)胞粉碎機（南京貝蒂實驗儀器有限公司）；Perkin Elmer 2400 Ⅱ型有機元素分析儀（美國珀金-埃爾默公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Zetasizer Nano ZS 納米粒度儀、絕對分子量分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Advance 500 型核磁共振波譜、TENSOR 27 型紅外光譜儀（瑞士Bruker公司）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0 和Origin 2019 對數(shù)據(jù)進行分析處理，統(tǒng)計結(jié)果以xˉ± s表示，組間比較采用t檢驗。P ＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 方 法

2.1 PEG-DSA載體的合成及表征

2.1.1 合 成 十二烷基白蛋白（DSA）載體按已報道的方法［8］合成。稱取BSA 200 mg，溶于去離子水10 mL 中，緩慢滴入十二醛163 μL，室溫攪拌反應(yīng)0.5 h 后，滴加10%硼氫化鈉（NaBH4）水溶液140 μL，繼續(xù)攪拌12 h，稀鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH至中性，14 000 r/min冷凍離心20 min，0.8 μm濾膜過濾，除去不溶于水的十二醛和十二醇，將濾液置于透析袋中，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）透析48 h，去離子水透析24 h，真空冷凍干燥制得白色固體DSA。隨后取DSA 45 mg 溶于PBS（pH 7.4）5 mL中，向其中加入CH3O-PEG3400-NHS 15 mg，避光反應(yīng)12 h，去離子水透析24 h后冷凍干燥。

2.1.2 圓二色譜測量（CD） 使用長度為1 cm 的1 mL 石英比色皿，在190 nm 至260 nm 的波長范圍內(nèi)，設(shè)置分辨率為0.2 nm，帶寬為1.0 nm，掃描速度為100 nm/min，記錄CD測量值。以nm為單位報告光譜，并計算α-螺旋（α-hexil）的百分比。通常測量蛋白質(zhì)于208 nm 與220 nm 波長處CD 譜的變化，它的大小一般用平均殘基摩爾橢圓率（MRE）來表示，可以通過公式（1）計算：

式中，n是氨基酸殘基數(shù)目，l是杯子的路徑長度，cp是摩爾濃度。

根據(jù)公式（2），通過計算208 nm 處的MRE 可以得到α-hexil的含量：

式中，MRE208是在208 nm 處觀察到的MRE，4 000是208 nm 處無規(guī)卷曲和β 折疊的MRE；33 000 是208 nm處α-hexil的MRE。

2.1.3 核磁共振氫譜（1H NMR） 分別稱取適量BSA、DSA、PEG-DSA 溶于D2O 中，利用核磁共振儀測定樣品的1H NMR譜圖。

2.1.4 紅外光譜（FT-IR） 分別稱取適量BSA、DSA、PEG-DSA，于紅外燈下與適量KBr粉末混合，研磨，壓片，并進行紅外檢測，記錄FT-IR譜圖。

2.1.5 元素分析 采用元素分析法分別測定BSA 和DSA 中C、H、N 3 種元素的摩爾分?jǐn)?shù)，按照公式（3）計算DSA中十二烷基的取代度［8］：

式中，（C/N）BSA與（C/N）DSA分別表示BSA 與DSA 中碳原子氮原子的物質(zhì)的量之比；13.36 是指BSA 分子中可反應(yīng)氮原子（61）與總氮原子（815）物質(zhì)的量之比［9］。

2.2 DSA/DAS，PEG-DSA/DAS 膠束的制備及處方優(yōu)化

分別稱取載體18 mg，溶于去離子水3 mL，另取DAS，溶于一定體積的有機溶劑中，并緩慢滴加至上述載體水溶液中，以800 r/min 轉(zhuǎn)速攪拌10 min，以200 W 功率探頭超聲處理20 min，隨后置于透析袋（相對截留分子質(zhì)量為7 000），每隔4 小時更換去離子水2 L，共透析12 h，9 000 r/min離心10 min 后收集上清液即得載藥膠束溶液。為制備最優(yōu)的DSA/DAS，PEG-DSA/DAS載藥制劑，采用單因素考察法比較達(dá)沙替尼的不同溶媒、載體和藥物投料比以及載藥濃度對上述兩個載體載藥量的影響。

2.2.1 溶 媒 固定載藥溶媒的體積為100 μL，DAS 的投料量為5 mg，考察溶媒分別為二甲基亞砜（DMSO）和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）時載體對DAS的荷載情況。

2.2.2 載體和藥物投料比 固定載體的投料量為18 mg，分別考察DSA、PEG-DSA 與DAS 的質(zhì)量比為8∶1，5∶1，4.5∶1，4∶1，3.6∶1，3∶1 時載體對DAS的荷載情況。

2.2.3 有機溶媒體積 固定DSA、PEG-DSA 與DAS 的投料比，考察有機溶媒體積分別為30，50，75，100 μL時兩載體對DAS的荷載情況。

2.3 粒徑分布及Zeta電位

分別取DAS 含量為1 mg/mL 的DSA/DAS 和PEG-DSA/DAS，25 ℃下測定兩載藥膠束的粒徑，PDI及Zeta電位。

2.4 載藥量和包封率

鑒于DAS 在水相介質(zhì)中的溶解度極低，因此載藥膠束溶液中游離的DAS 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于載入膠束疏水內(nèi)核的量，故可忽略不計。取適量制備的載藥膠束溶液，加入大量DMF 稀釋至一定濃度，超聲5 min 以破壞膠束結(jié)構(gòu)，3 000 r/min 離心后收集上清液，紫外分光光度計測量其在323 nm 處的吸收度。計算包封率（EE，%）=載入膠束的DAS 量/DAS 投藥量×100，以及載藥量（DL，%）=載入膠束的DAS量/（載入膠束的DAS量+載體質(zhì)量）×100。

2.5 體外穩(wěn)定性評價

將DAS 含量為0.5 mg/mL 的DSA/DAS、PEGDSA/DAS 200 μL分別置于去離子水和含有10%胎牛血清（FBS）的PBS（pH 7.4）10 mL 中，在25 ℃下分別于1，2，4，6，10，12，16 h 取樣并考察其粒徑變化。

2.6 體外釋放動力學(xué)

采用pH 為7.4 和5.0 兩 種不同的PBS 作為釋放介質(zhì)以模擬機體生理環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體環(huán)境，探究制劑體外釋放行為。精密量取PEGDSA/DAS和DSA/DAS的10%FBS溶液（DAS濃度均為0.5 mg/mL）1 mL于相對截留分子質(zhì)量為7 000的透析袋中，并置于含0.3%吐溫80 的PBS（pH 7.4及pH 5.0）釋放介質(zhì)250 mL 中，溫度設(shè)定為37 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min。在預(yù)設(shè)時間點1，2，3，4，6，8，10，12 h 時取出釋放介質(zhì)1 mL，并補充相同體積的新鮮釋放介質(zhì)。采用紫外分光光度計測量在323 nm處的吸收度，從而檢測DAS的釋放百分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 PEG-DSA載體的表征

3.1.1 CD解析 如圖1所示，DSA和PEG-DSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)在222 和208 nm 處有負(fù)科頓（Cotton）效應(yīng)，表現(xiàn)出兩個負(fù)的肩峰譜帶，在靠近192 nm 有一正的譜帶。β 折疊的CD 譜在216 nm 有一負(fù)譜帶，而在195 ～200 nm 有一正譜帶，表明兩個載體均保留了α-螺旋和β-折疊。通過“2.1.2”項中公式計算得出：BSA 的α-螺旋為39.8%，DSA 的α-螺旋為12.4%，PEG-DSA 的α-螺旋為13.5%。DSA與PEG-DSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)的百分比雖然較BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)的百分比低，但從圖中可以看出，其α-螺旋結(jié)構(gòu)仍占主導(dǎo)，保留了BSA一定的生理活性。

Figure 1 Circular dichroism（CD）diagrams of BSA, DSA and PEGDSABSA: Bovine serum albumin; PEG: Polyethylene glycol; DSA: Dodecyl serum albumin

3.1.21H NMR 解析 如圖2 所示，DSA 中的δ 1.24 和δ 0.84 處的峰分別歸屬于亞甲基氫和甲基氫［10］。PEG-DSA 中的δ 3.65 處為PEG 的亞甲基峰，在δ 1.24 和δ 0.84 其具有和DSA 同樣的亞甲基氫和甲基氫。表明MAL-PEG3400-NHS 被成功引入，由此推斷PEG-DSA已成功合成。

3.1.3 FT-IR 解析 在BSA 的紅外圖譜中（圖3），可以觀察到3 305 cm-1處的--OH 伸縮振動峰，2 960 cm-1處的甲基C-H 伸縮振動峰，2 937 cm-1處的亞甲基C--H 伸縮振動峰，1 658 cm-1處的酰胺Ⅰ帶，1 537 cm-1處的酰胺Ⅱ帶。DSA 為BSA 接上十二醛并還原后的結(jié)構(gòu)，接枝上的基團為--CH2，--CH3，該結(jié)構(gòu)在BSA 中已存在，所以其紅外峰與BSA 基本一致。在PEG-DSA 的圖譜中，1 107 cm-1處可見PEG 中--C--O--C--的對稱伸縮振動峰，表明CH3O--PEG3400-NHS 的成功接入，結(jié)合核磁共振氫譜的數(shù)據(jù)，輔助證明PEG-DSA的成功合成。

Figure 2 1H NMR spectrum of BSA,DSA and PEG-DSA

Figure 3 FT-IR spectrum of BSA,DSA and PEG-DSA

3.1.4 元素分析 如表1 所示，元素分析實驗結(jié)果表明，DSA 結(jié)構(gòu)中氨基上的十二烷基取代度為29.63%。

Table 1 Elemental composition of BSA and DSA

3.2 DSA/DAS，PEG-DSA/DAS 膠束的制備及處方優(yōu)化

3.2.1 溶 媒 如表2、表3 所示，使用DMSO 或DMF所制得的DSA/DAS和PEG-DSA/DAS的載藥量和包封率無顯著性差異（P ＞0.05）。因此，兩載體皆選擇DMF為藥物的溶媒進行下述的工藝優(yōu)化。

Table 2 Effect of the organic solvents on loading capacity of DSA micelles for dasatinib(DAS)(xˉ± s,n = 3)

Table 3 Effect of organic solvents on loading capacity of PEG-DSA micelles for DAS(xˉ± s,n = 3)

3.2.2 載體和藥物投料比 如表4、表5 所示，分別對DSA 和PEG-DSA 的載藥工藝進行篩選，當(dāng)載體和藥物投料比為8∶1 ～4∶1 時，載藥量和包封率隨著載體和藥物投料比的降低而升高，而當(dāng)載體和藥物投料比降低至3.6∶1 ～3∶1 時，載藥量和包封率卻呈下降趨勢，這表明此時載體對DAS 的包載已達(dá)到飽和。綜合考慮，確定DSA 與DAS 最佳投料比為3.6∶1，DSA 與PEG-DAS 最佳投料比為4∶1。該處方工藝下，載藥量和包封率均最高，且載藥量均超過10%，改善了DAS 載藥量低的難題。

Table 4 Effect of feed mass ratio of DAS to DSA on loading capacity of micelles for DAS (xˉ± s,n = 3)

Table 5 Effect of feed mass ratio of PEG-DAS to DSA on loading capacity of micelles for DAS(xˉ± s,n = 3)

3.2.3 有機溶劑體積 如表6、表7 所示，當(dāng)有機溶劑體積為30 μL 時，兩載體對DAS 的荷載能力差，且粒徑最大；當(dāng)有機溶劑體積為50 μL，對DAS的荷載能力最強，粒徑及PDI較為理想。故選擇使用有機溶劑50 μL進行兩載體載藥的制備。

綜上所述，篩選的最佳載藥工藝如下：稱取DSA 或PEG-DSA 18 mg，加去離子水3 mL 溶解形成膠束溶液；另取DAS 5 mg 或4.5 mg，超聲，渦旋溶解于DMF 50 μL 中，并緩慢滴加至上述膠束溶液中，劇烈攪拌10 min，冰浴下探頭超聲20 min，去離子水透析12 h，9 000 r/min 離心10 min，分別制得DSA/DAS或PEG-DSA/DAS。

Table 6 Effect of volume of DMF on loading capacity of DSA micelles for DAS (xˉ± s,n = 3)

Table 7 Effect of volume of DMF on loading capacity of PEG-DSA micelles for DAS(xˉ± s,n = 3)

3.3 粒徑分布及Zeta電位

最佳工藝下制備的DSA/DAS 膠束粒徑為（29.98 ± 1.07）nm，PDI 為0.29 ± 0.02，Zeta 電位為（-18.27 ± 0.21）mV。最佳工藝的PEG-DSA/DAS 膠束粒徑為（37.21 ± 0.21）nm，PDI 為0.24 ±0.04，Zeta電位為（-15.68±0.19）mV。

3.4 載藥量和包封率

按照“2.4”項中的公式計算可得，DSA/DAS 最優(yōu)處方的制劑載藥量為（15.03± 2.16）%，包封率為（63.38 ± 1.34）%。PEG-DSA/DAS 最優(yōu)處方的載藥量為（10.22 ± 0.34）%，包封率為（42.73 ±1.15）%。兩載體載藥量均超過10%并遠(yuǎn)高于文獻報道水平。PEG-DSA/DAS 的載藥量和包封率低于DSA/DAS 的原因可能是由于PEG 的接枝，使得DSA載體的水化面積增大，導(dǎo)致DAS的負(fù)載減少。

3.5 體外穩(wěn)定性評價

為了研究膠束的穩(wěn)定性，考察了純水環(huán)境以及模擬生理條件下，膠束粒徑隨時間的變化規(guī)律。如圖4所示，膠束在16 h內(nèi)粒徑?jīng)]有顯著變化。但在含血清條件下DSA/DAS 膠束穩(wěn)定性略低于PEG-DSA/DAS，可能是由于缺乏PEG 對生物成分的抗干擾作用，進一步的PEG 修飾有利于藥物經(jīng)體內(nèi)運輸至腫瘤部位從而發(fā)揮藥效。

3.6 體外釋放動力學(xué)

如圖5所示，在pH 7.4生理環(huán)境下，PEG-DSA/DAS 中DAS 在前4 h 釋放較為緩慢，在8 h 后進入平臺期，12 h 累積釋藥百分率為75.63%；而在pH 5.0 細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體環(huán)境下釋放加快，8 h 后進入平臺期，12 h累積釋藥百分率92.91%，推測可能是由于酸性條件DAS 釋放加快，DAS 的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在-NH-氨基官能團，在低pH 條件下質(zhì)子化，從而降低其疏水性，提高親水性。PEG-DSA/DAS在pH 7.4和5.0條件下藥物釋放速率均低于DSA/DAS，DSA/DAS 組在8 h 處幾乎完全釋放，這表明PEG 可在生理條件下一定程度提高制劑穩(wěn)定性，尤其可降低藥物在循環(huán)過程中的突釋。

Figure 4 Time-dependent size changes of DSA/DAS and PEG-DSA/DAS in various medium(xˉ± s,n = 3)

4 討 論

本研究利用希夫堿反應(yīng)在BSA 的氨基上共價修飾十二醛并還原后制得十二烷基白蛋白，并對剩余的氨基進行酰胺化反應(yīng)接枝PEG，構(gòu)建兩親性蛋白偶聯(lián)物PEG-DSA。DAS 為疏水性藥物，并且和白蛋白有一定的親和力，能夠被包載于PEGDSA 膠束的疏水內(nèi)核中，形成載DAS 的納米膠束。相較于DSA/DAS，PEG-DSA/DAS 可通過PEG 的水化層進一步抵抗生物干擾，具有延長制劑血循環(huán)的潛能。

PEG-DSA 作為DAS 的遞送載體，既實現(xiàn)DAS的有效增溶，又有望提升DAS 在腫瘤部位的靶向蓄積；其合成工藝簡單，條件溫和，能夠保留白蛋白的部分生理學(xué)活性，具有出色的DAS 荷載能力（載藥量高達(dá)10.22%），且目標(biāo)載藥制劑粒徑及分布符合靜脈注射要求，穩(wěn)定性良好。本研究為DAS新型腫瘤靶向制劑的研制提供了依據(jù)。