基于乙酰膽堿酯酶和氧化應激研究海膽酮對阿爾茨海默癥的作用機制

張 濤，陳艷紅,2,3,4,*，常高萍，楊遠帆,2,3,4，杜希萍,2,3,4,*，姜澤東,2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021；4.廈門南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021）

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種以記憶力喪失、認知能力下降為主要特征，并伴有不可逆轉的神經(jīng)元喪失的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于65歲以上老人。2020年全球AD患者5 200萬以上，預計2050年AD患者將增至1.52億。因此，AD已經(jīng)是全球嚴重的公共衛(wèi)生問題，不僅給患者及其家庭帶來巨大精神負擔，也給社會造成巨大的經(jīng)濟壓力。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）作為生物神經(jīng)傳導中的關鍵酶，能催化神經(jīng)遞質乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，從而阻斷神經(jīng)信號的傳遞。所以AChE活力升高會導致乙酰膽堿水平降低，而乙酰膽堿水平降低是AD的關鍵病因，因此抑制AChE活力、提高乙酰膽堿水平是治療AD的重要方法。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療AD的乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholinesterase inhibitor，AChEI）主要有他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏。除加蘭他敏外，大多數(shù)為合成藥物，雖然有一定的治療效果，但具有頭暈、失眠、惡心、輕度腹瀉等不同程度的副作用，不適于患者長期使用。因此，尋求高效低毒、適宜患者長期使用的天然來源AChEI對治療AD具有重要的意義。

研究表明，氧化應激是AD病理機理的一個組成部分，減輕氧化應激對預防AD至關重要，因此具有抗氧化和AChE抑制活性的天然化合物對于預防和治療AD起著舉足輕重的作用。海膽酮（-胡蘿卜素-4-酮）是一種酮式類胡蘿卜素，由4個異戊二烯單元以共軛雙鍵的形式連接，首尾兩端則各連接一個紫羅蘭酮環(huán)，其中一個紫羅蘭酮環(huán)上的氫被酮基取代，主要從海膽及藻類等海洋生物中提取。Miller等報道海膽酮具有很強的抗氧化能力，對2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽離子自由基的清除能力強于角黃素和蝦青素。課題組前期從法夫酵母中提取得到海膽酮，本實驗應用Ellman法研究海膽酮對AChE的抑制作用，并進一步通過抑制動力學分析其對AChE的抑制類型，利用熒光光譜和圓二色光譜研究其對AChE構象變化的影響，采用分子對接分析其結合位點，初步闡明海膽酮對AChE的抑制機理，并應用淀粉樣β蛋白片段25～35（amyloid beta-peptide 25-35，Aβ）誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞）損傷，以不同質量濃度海膽酮干預，研究海膽酮對AD細胞模型氧化應激的影響，闡明海膽酮對AD的潛在作用機制，為海膽酮在功能食品、生物醫(yī)藥等領域的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海膽酮 實驗室自制；AChE（E.C.3.1.1.7，來源于電鰻魚，500 U/mg）、碘代硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide，ATCI）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（純度98%）、甲醇（色譜級）、100×雙抗（100 IU/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素）溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma-Aldrich公司；加蘭他敏（純度≥98%）、Aβ上海源葉生物科技有限公司；PC12細胞、馬血清（horse serum，HS）、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- diphenyl-2-tetrazolium bromide，MTT） 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Thermo Fisher Scientific公司；R/MINI 1640培養(yǎng)基美國Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）總蛋白含量測定試劑盒、AChE、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒 南京建城生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Mettler Toledo電子天平 順迪嘉奧有限公司；SPECTROstar Omega全波長自動多功能酶標儀微孔板檢測儀德國BMG Labtech公司；7200可見分光光度計 美國Unico公司；CALR2y Ecliose熒光光譜儀 美國Varian公司；JASCO J-810圓二色光譜儀 日本Jasco公司；Avanti J26XP高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；DL-CJ-2NDI型超凈工作臺 中國北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Galaxy 170R型CO培養(yǎng)箱 中國上海百賽生物技術有限公司；Cytation-5細胞成像多功能酶標儀美國伯騰儀器有限公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙酰膽堿酯酶抑制率測定

參照文獻[10]的方法測定海膽酮的AChE抑制率。在96 孔酶標板中依次加入80 μL buffer D（含0.1%（質量分數(shù)）牛血清白蛋白的pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl）、20 μL AChE（0.4 U/mL）、20 μL不同質量濃度（5、10、30、40、50 μg/mL）海膽酮溶液（溶劑為甲醇，后同），分別37 ℃溫育15 min，加入40 μL底物（0.6 mmol/L ATCI）和40 μL顯色劑（0.6 mmol/L DTNB），37 ℃溫育15 min后測定405 nm波長處吸光度。以等體積不同質量濃度（5、10、30、40、50 μg/mL）加蘭他敏作為陽性對照，3 次平行實驗，根據(jù)公式（1）計算AChE抑制率。

式中：為添加海膽酮、AChE時的吸光度；為添加海膽酮、用等體積buffer D代替AChE時的吸光度；為用等體積甲醇替代海膽酮、加入AChE時的吸光度；為用等體積buffer D代替AChE、等體積甲醇替代海膽酮時的吸光度。

1.3.2 乙酰膽堿酯酶抑制類型的測定

參照文獻[11]的方法，固定底物ATCI濃度為0.6 mmol/L，加入量為40 μL，分別添加20 μL不同質量濃度（0、5、10、20 μg/mL）海膽酮溶液，測定不同AChE濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/mL）下的酶促反應速率（以每分鐘吸光度的變化（Δ）表示，下同）（），以AChE濃度為橫坐標，以反應酶促反應速率為縱坐標作圖，根據(jù)所得線性擬合曲線是否通過坐標原點判斷AChE的抑制類型。

如果上述抑制類型為可逆抑制，固定AChE濃度為0.4 U/mL，在不同底物ATCI濃度（0.5、1、2、4、8 mmol/L）下測定不同質量濃度（0、5、10、20 μg/mL）海膽酮的酶促反應速率，以底物濃度的倒數(shù)（1/[]）為橫坐標、酶促反應速率的倒數(shù)（1/）為縱坐標繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線。根據(jù)米氏常數(shù)（）和最大反應速率（）的變化判斷抑制類型，以海膽酮質量濃度為橫坐標，雙倒數(shù)曲線各質量濃度直線的斜率為縱坐標作二級曲線圖，曲線與橫軸的截距為抑制常數(shù)。

1.3.3 熒光光譜分析

將50 μL AChE溶液（50 U/mL）和25 μL不同質量濃度（0、5、10、20、30 μg/mL）海膽酮溶液混合均勻后加入1 cm石英試管中用熒光光譜儀記錄熒光強度變化。掃描條件：溫度為25 ℃，波長為290～490 nm，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm。

1.3.4 圓二色光譜分析

利用圓二色光譜研究海膽酮對AChE二級構象的影響。將0.2 mL AChE溶液（50 U/mL）與20 μL不同質量濃度（0、10、20 μg/mL）海膽酮溶液混合均勻后加入到1 cm的石英樣品池中用JASCO J-810圓二色光譜儀進行測定。掃描條件：波長范圍190～290 nm；掃描速率100 nm/s；分辨時間0.5 s；響應時間1 s；帶寬2 nm。

1.3.5 分子對接分析

從蛋白質數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）下載AChE和多奈哌齊復合物（PDB ID：1EVE）的晶體結構。從PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得底物ATCI和抑制劑海膽酮的2D結構，并使用Discovery Studio 2.5軟件轉換為3D結構，應用Discovery Studio 2.5軟件進行分子對接。用Autodock 4.2軟件測定抑制劑海膽酮、底物ATCI與AChE相互作用的結合能。

1.3.6 細胞培養(yǎng)

PC12細胞復蘇后，用含5% FBS、10% HS、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）的R/MINI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期PC12細胞，用R/MINI 1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液（濃度為1h10個/mL）進行后續(xù)細胞實驗。

1.3.7 海膽酮對PC12細胞活性的影響

參考文獻[15]的方法應用MTT比色法檢測PC12細胞活力。將100 μL PC12細胞（1h10個/mL）接種于96 孔板中，37 ℃下孵育24 h。孵育結束后，吸棄培養(yǎng)液，加入100 μL含不同質量濃度（0（即對照組）、1、5、10、20 μg/mL）海膽酮的R/MINI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃繼續(xù)孵育24 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔中加入100 μL質量濃度5 mg/mL的MTT溶液（溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4、0.01 mol/L，后同）），37 ℃繼續(xù)孵育30 min。之后用磷酸鹽緩沖液輕輕洗滌細胞2 次，每孔加入100 μL DMSO，振蕩20 min，于570 nm處用酶標儀測量其吸光度，以100 μL DMSO為空白組。根據(jù)公式（2）計算細胞活力。

式中：、和分別表示為樣品處理組、對照組和空白組的吸光度。

1.3.8 海膽酮對Aβ誘導PC12細胞活性的影響

將100 μL PC12細胞（1h10個/mL）接種到96 孔板中培養(yǎng)24 h。待其貼壁后分為3 組：空白組：不作任何處理，用培養(yǎng)基孵育48 h；模型組：用培養(yǎng)基孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含20 μmol/L Aβ培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h；實驗組：用含不同質量濃度（5、10、20 μg/mL）海膽酮的培養(yǎng)基孵育24 h，吸棄培養(yǎng)液，用含20 μmol/L Aβ培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。3 組細胞孵育結束后，用磷酸鹽緩沖液輕輕洗滌細胞2 次，加入100 μL質量濃度5 mg/mL的MTT，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振蕩20 min，用酶標儀于570 nm波長處測定其光密度值OD。Aβ孵育的模型組與海膽酮孵育的實驗組統(tǒng)稱為處理組，根據(jù)公式（3）計算細胞活力。

1.3.9 PC12細胞中MDA含量及AChE、SOD、CAT和GSH-Px活力測定

PC12細胞培養(yǎng)及分組加樣參照1.3.8節(jié)，孵育結束后，利用細胞刮刀收集細胞，冰浴中用超聲細胞破碎儀破碎細胞（80 W、20 kHz），2 min后4 ℃下1 200 r/min離心10 min，收集上清液。上清液中的MDA含量及酶活力的測定分別按照MDA、SOD、CAT和GSH-Px試劑盒說明書進行操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設置3個平行，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)后作圖，采用SPSS 2017軟件進行單因素方差分析，采用Tukey’s檢驗進行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 海膽酮對乙酰膽堿酯酶的抑制作用

由圖1可知，在實驗質量濃度范圍內，隨著海膽酮質量濃度的升高，對AChE的抑制作用顯著增強（＜0.05），表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。通過線性擬合計算海膽酮、加蘭他敏的半抑制質量濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC）分別為（16.29f0.97）、（23.20f1.08）μg/mL，由此可知，海膽酮對AChE的抑制作用強于加蘭他敏。此外，據(jù)報道海膽酮是一種可食用的橙色素，抗氧化劑和VA原，具有較強的自由基清除能力。因此，海膽酮具有抗氧化和抑制AChE的雙重功效，且食用安全性高，有望用于預防和治療AD。

圖1 海膽酮和加蘭他敏對AChE的抑制作用Fig.1 AChE inhibitory effects of echinenone and galanthamine

2.2 海膽酮對乙酰膽堿酯酶抑制類型分析結果

由圖2A可知，不同質量濃度海膽酮作用下的酶濃度-酶促反應速率的線性擬合曲線均通過原點，且線性擬合曲線的斜率隨著海膽酮質量濃度的增加而降低，說明加入海膽酮抑制酶促反應速率，表明海膽酮可逆抑制AChE，海膽酮與AChE通過非共價鍵結合，從而導致AChE活力降低或喪失，并未引起AChE分子構象的永久變化，可通過物理方法使AChE活力恢復。

圖2 海膽酮對AChE抑制類型分析結果Fig.2 Analysis of the type of inhibition of echinenone on AChE

固定AChE濃度為0.4 U/mL，由圖2B可知，不同質量濃度海膽酮作用下的擬合曲線相交于縱軸一點，縱軸截距為1/，說明添加不同質量濃度的海膽酮，1/不變。隨著海膽酮質量濃度的增大，擬合直線的斜率增大，說明米氏常數(shù)隨著抑制劑濃度的增大而增大。以圖2B的直線斜率為縱坐標、AChE濃度為橫坐標作圖2C，計算得到AChE的為3.82 μg/mL。由以上分析可知，海膽酮對AChE的抑制類型為競爭性抑制，說明海膽酮與底物ATCI競爭AChE的催化位點，降低底物與酶的親和力從而抑制酶的活力。該抑制類型與二氫小檗堿和黃芩苷對AChE的抑制類型一致。

2.3 海膽酮對AChE熒光光譜的影響

由圖3可知，隨著海膽酮質量濃度的增加，AChE的熒光強度降低，表明海膽酮對AChE有熒光猝滅作用；但AChE最大發(fā)射波長334 nm沒有改變，表明AChE色氨酸微環(huán)境沒有改變。推測AChE與海膽酮通過次級鍵（如氫鍵和疏水作用）結合，該結合并未改變色氨酸所處的溶劑環(huán)境，而改變AChE內除色氨酸外其他熒光性質氨基酸的微環(huán)境產(chǎn)生熒光猝滅，導致酶活力降低。Tang Hongjin等報道丹酚酸C與AChE結合形成新的丹酚酸C-AChE復合物，誘導酶的三級結構發(fā)生變化，導致熒光猝滅。

圖3 海膽酮對AChE熒光光譜的影響Fig.3 Fluorescence spectra of AChE in the presence of echinenone

2.4 海膽酮對AChE圓二色光譜的影響

圓二色光譜技術廣泛用于分析酶二級結構的變化，蛋白質的圓二色光譜中-螺旋在208、222 nm處呈負峰，在192 nm附近有一個正峰。-折疊在215 nm處呈現(xiàn)負峰，在198 nm處有一個正峰。由圖4可知，隨著加入海膽酮質量濃度的增加，-螺旋相對含量從15.7%下降到7.6%，-折疊相對含量從25.3%下降到16.3%，無規(guī)卷曲相對含量從32.2%下降到20.6%，而-轉角相對含量從31.2%上升到55.5%。表明海膽酮與AChE結合引起AChE二級結構發(fā)生改變，破壞酶的氫鍵網(wǎng)絡，從而導致AChE活力下降。

圖4 海膽酮對AChE圓二色光譜的影響Fig.4 Circular dichroism spectra of AChE in the presence of echinenone

2.5 分子對接分析海膽酮與AChE的相互作用

采用分子對接技術進一步闡明海膽酮、底物ATCI與AChE的結合方式（圖5）。AChE在球形分子結構的表面有一向內凹陷的又深又窄的活性中心“峽谷”，中間狹窄，兩端開闊，由3個主要區(qū)域組成：位于峽谷底部由Ser200、Glu327和His440組成的催化三聯(lián)體，催化底物乙酰膽堿的乙?；?；位于峽谷中部由Trp84、Phe330、Tyr442和Glul99組成的陰離子活性位點，此位點氨基酸主要通過陽離子-π或π-π電子的堆積與底物結合；位于峽谷入口以Trp279為中心的外周陰離子位點，為變構調節(jié)劑和抑制劑提供結合位點。從圖5B可以看出，海膽酮和底物ATCI均可與AChE的活性中心結合。底物ATCI與AChE的催化三聯(lián)體位點Ser200形成氫鍵，與His440通過范德華力相互作用；與陰離子活性位點Trp84、Phe330以陽離子-π鍵相互作用；與外周陰離子Tyr121形成碳氫鍵（圖5A）。當加入海膽酮時結合的氨基酸和作用力發(fā)生改變（圖5 B）。海膽酮與AChE的催化三聯(lián)體位點Ser200形成碳氫鍵，與His440形成疏水作用力；與陰離子活性位點Trp84形成π-σ鍵；與外周陰離子位點Tyr121以范德華力相互作用，與Tyr334、Trp279以疏水作用力相互作用。可見，海膽酮和底物ATCI與AChE有共同的活性中心氨基酸作用位點：Ser200、His440、Trp84和Tyr121。通過分子對接計算可知海膽酮、ATCI與AChE的結合能分別為－10.9 kcal/mol和－4.9 kcal/mol。結合能越低，表明與受體蛋白的親和力越高。由于海膽酮與AChE的結合能更低，更容易與AChE結合且結合狀態(tài)更穩(wěn)定，因而阻礙底物ATCI與活性中心氨基酸結合，從而引起酶活力降低，抑制乙酰膽堿水解，使患者腦內ACh水平提高。海膽酮對AChE有更強的抑制作用可能與海膽酮的化學結構有關。海膽酮的長碳鏈一端可以作用于AChE活性中心峽谷底部的催化位點，另一端可作用于活性中心峽谷入口處外周陰離子位點。中間碳鏈可以滿足兩個位點之間的距離，使海膽酮很好的契合在AChE的整個活性中心峽谷，與底物競爭AChE的活性中心，從而降低酶活力。此結果也與抑制動力學結果一致，進一步表明海膽酮是一種競爭性抑制劑。

圖5 ATCI、海膽酮與AChE的分子對接Fig.5 Molecular docking interaction of echinenone and ATCI with AChE

此外，AChE的外周陰離子結構域在誘發(fā)Aβ聚集中發(fā)揮重要作用，促進寡聚體及斑塊形成。海膽酮與AChE的催化三聯(lián)體和外周陰離子活性位點同時作用，不僅可以抑制AChE活力而且可以干擾Aβ聚集，從而發(fā)揮雙重治療AD的作用。

2.6 海膽酮對PC12細胞活力的影響

由圖6可知，在質量濃度0～20 μg/mL范圍內，海膽酮對PC12細胞活力均無顯著影響（＞0.05），細胞活力均接近100%，表明海膽酮在質量濃度0～20 μg/mL范圍內對PC12細胞沒有毒性作用。因此，后續(xù)實驗采用20 μg/mL海膽酮作為實驗上限質量濃度。

圖6 海膽酮對PC12細胞活力的影響Fig.6 Effects of echinenone on the viability of PC12 cells

2.7 海膽酮對Aβ25-35誘導PC12細胞活力的影響

由圖7可知，模型組的PC12細胞在Aβ誘導后細胞活力為（65.19f2.58）%，顯著低于空白組，說明Aβ成功誘導PC12細胞損傷。經(jīng)5、10、20 μg/mL海膽酮處理的Aβ誘導PC12細胞的活力分別為（75.61f2.54）%、（79.12%f2.11）%、（84.50f2.44）%；與模型組相比，海膽酮顯著提高PC12細胞的活力（＜0.05），并呈劑量依賴性，對Aβ誘導的PC12細胞損傷具有保護作用。

圖7 海膽酮對Aβ25-35誘導PC12細胞活力的影響Fig.7 Effect of echinenone on the viability of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.8 海膽酮對Aβ25-35誘導PC12細胞中AChE活力的影響

由圖8可知，與空白組相比，模型組中AChE的活力顯著升高（＜0.05），表明Aβ成功誘導PC12細胞膽堿能系統(tǒng)損傷。與模型組相比，不同質量濃度的海膽酮預處理PC12細胞后，Aβ誘導的PC12細胞中AChE的活力隨著海膽酮質量濃度的增加顯著降低（＜0.05），具有劑量依賴性，表明海膽酮能有效抑制PC12細胞中AChE的活力。

圖8 海膽酮對PC12細胞AChE活力的影響Fig.8 Effect of echinenone on the activity of AChE in PC12 cells

2.9 海膽酮對Aβ25-35誘導PC12細胞中MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活力的影響

由表1可知，與空白組相比，模型組脂質過氧化終產(chǎn)物MDA含量顯著增多（＜0.05），抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力顯著下降（＜0.05）。表明Aβ誘導PC12細胞產(chǎn)生氧化應激。與模型組相比，實驗組的MDA含量顯著減少（＜0.05），并且當海膽酮質量濃度為20 μg/mL時，MDA含量與空白組無顯著差異（＞0.05）。表明經(jīng)海膽酮處理的Aβ誘導PC12細胞可以降低氧化應激。當海膽酮質量濃度為5 μg/mL時，SOD活力與模型組無顯著差異（＞0.05），隨著加入海膽酮質量濃度的增大，SOD活力顯著升高（＜0.05），并且當海膽酮質量濃度為20 μg/mL時，SOD活力為（77.44f7.92）U/mg，顯著高于空白組（＜0.05）。隨著海膽酮質量濃度的增加，CAT活力和GSH-Px活力均顯著升高（＜0.05），呈明顯的劑量依賴性；并且當海膽酮質量濃度為10 μg/mL時，CAT活力已顯著高于空白組（＜0.05）。綜上所述，添加海膽酮可以引起MDA含量顯著減少，SOD、CAT和GSH-Px活力顯著升高，表明給予海膽酮預保護可以明顯減輕Aβ誘導AD細胞模型的氧化應激損傷。

表1 海膽酮對Aβ25-35誘導PC12細胞中MDA含量和抗氧化酶系活力的影響Table 1 Effect of echinenone on MDA content and antioxidant enzyme activity in PC12 cells induced by Aβ25-35

3 討 論

AD是多因素復雜疾病，膽堿能系統(tǒng)損傷和氧化應激反應是導致AD的兩大重要機制。膽堿能損傷的主要表現(xiàn)為AChE活力升高，乙酰膽堿缺失。氧化應激是過氧化物和抗氧化劑之間的動態(tài)不穩(wěn)定狀態(tài)。其特征是機體內活性氧類、活性氮類等自由基含量顯著增加，超過機體本身的清除能力，造成氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致氧化損傷的產(chǎn)生，最終影響細胞中蛋白質表達和DNA/RNA的翻譯后修飾，造成細胞損傷或凋亡。脂質過氧化物MDA含量增加、抗氧化物酶如SOD、CAT和GSH-Px等活性下降是AD氧化應激反應的重要表現(xiàn)。PC12細胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，是常用的神經(jīng)元細胞模型。Aβ具有神經(jīng)毒性作用，會損傷膽堿能神經(jīng)元，引起神經(jīng)細胞凋亡，產(chǎn)生氧化應激反應，進而導致AD，Aβ的主要毒性片段為Aβ。本實驗研究海膽酮對AChE的抑制機理，并通過Aβ誘導PC12細胞建立AD細胞模型，進一步研究海膽酮對Aβ誘導AD細胞模型氧化應激的影響。結果表明，海膽酮對AChE具有很強的抑制作用，可引起AChE二級結構的改變，與底物競爭AChE的結合位點，從而降低酶活力。Aβ誘導AD細胞模型結果顯示，細胞活性降低，MDA水平顯著升高，SOD、CAT和GSH-Px活力顯著降低，表明Aβ誘導PC12細胞氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生了氧化應激。海膽酮處理后細胞活性升高，MDA含量降低，SOD、CAT和GSH-Px活力升高；表明海膽酮通過提高SOD、CAT和GSH-Px的活力，以及防止脂質過氧化作用，從而減少脂質過氧化終產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，減輕Aβ誘導細胞的氧化應激損傷。綜上，海膽酮通過抑制AChE活力減輕膽堿能損傷；海膽酮通過提高細胞抗氧化酶SOD、CAT和GSHPx的活力，降低脂質過氧化終產(chǎn)物MDA的含量，從而減輕細胞氧化應激損傷，具有潛在的預防和輔助治療AD的功效。

4 結 論

本研究基于AChE活力和氧化應激研究了海膽酮對AD的作用機制，結果表明，海膽酮可通過競爭性抑制降低AChE活力減輕膽堿能損傷，降低乙酰膽堿的水解速率，維持乙酰膽堿水平，保證神經(jīng)信號的正常傳遞；此外，海膽酮可通過提高抗氧化酶的活力降低脂質過氧化終產(chǎn)物MDA含量，對細胞氧化應激損傷起到保護作用。本實驗為海膽酮用于預防和治療AD提供了參考，同時為海膽酮在功能食品、生物醫(yī)藥等領域的應用提供了理論支持和科學依據(jù)。