水力空化對大豆分離蛋白谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶促凝膠行為的影響

李曉惠，任仙娥*，楊 鋒，黃永春，黃承都，張昆明，劉純友

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是從低溫脫脂豆粕中除去碳水化合物和灰分等，得到的蛋白質(zhì)量分數(shù)大于90%（干基）的全價蛋白。具有來源廣泛、價格低廉、營養(yǎng)價值高等特點，是一種應(yīng)用廣泛的食品基料。SPI具有良好的凝膠性、乳化性和持水性等功能特性，尤其凝膠性受到廣泛關(guān)注，利用這一特性可以改善豆腐、豆干和豆腐腦等傳統(tǒng)豆制品的感官和質(zhì)構(gòu)，將其應(yīng)用到火腿腸和香腸等肉制品中，能夠起到保水和穩(wěn)定脂肪的重要作用。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）是一種細胞外催化轉(zhuǎn)移酶，可催化蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的谷氨酰胺和賴氨酸殘基發(fā)生催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)、脫酰胺反應(yīng)和交聯(lián)聚合反應(yīng)。酶促反應(yīng)可使食品中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改善凝膠性能，提高凝膠強度。酶促反應(yīng)條件溫和，還可以通過誘導(dǎo)含有互補限制性氨基酸結(jié)構(gòu)的異源蛋白間的交聯(lián)來生產(chǎn)具有更高營養(yǎng)價值的蛋白產(chǎn)品。

空化技術(shù)作為新興的物理改性技術(shù)，受到了國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注，主要方式為超聲空化和水力空化兩種。相比較于超聲空化，水力空化的能量利用率更高，產(chǎn)生的空化場更均勻，更具有工業(yè)化優(yōu)勢。在空化過程中空化泡的潰滅產(chǎn)生瞬時的局部高溫高壓，并伴隨著高速剪切力、強沖擊波、高速湍流等，可以促進一些化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。白銀等研究發(fā)現(xiàn)隨射流空化處理時間的延長，SPI溶解性、乳化性、持油性以及表面疏水性均顯著提高。Li等研究發(fā)現(xiàn)水力空化處理可以使?jié)饪s乳蛋白的流變性質(zhì)得到改善，降低濃縮乳蛋白的黏度，提高乳粉噴霧干燥的效率。Meletharayil等研究發(fā)現(xiàn)水力空化可改善希臘酸奶的流變特性和微觀結(jié)構(gòu)。課題組前期研究結(jié)果表明，水力空化處理能改變SPI的理化和結(jié)構(gòu)性質(zhì)，如溶解性增加、表面疏水性增加，還會改變其二級結(jié)構(gòu)。這些理化和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變可能會使其凝膠行為發(fā)生改變，但是關(guān)于水力空化對蛋白質(zhì)凝膠行為的影響研究還鮮有報道。基于此，本實驗采用基于渦流的水力空化來處理SPI，再在TG的催化作用下制備凝膠，分析SPI經(jīng)水力空化處理后其酶促凝膠行為的變化規(guī)律和機理，為有效調(diào)控大豆蛋白凝膠制品的品質(zhì)提供理論依據(jù)，同時為將水力空化應(yīng)用到食品工業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（蛋白質(zhì)量分數(shù)≥90%） 山東禹王生態(tài)食品有限公司；TG（酶活力為100 U/g） 江蘇泰興市東圣生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JXN-26冷凍高速離心機 美國貝克曼庫爾特股份有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；MCR 72流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；GSL-1010全自動激光顆粒分布測量儀 遼寧儀表研究所有有限責(zé)任公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；AE2204電子分析天平 湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；HY-4調(diào)速振蕩器長沙創(chuàng)滿電子科技有限公司；AlpHal-4LDpus真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司；Phenom ProX掃描電子顯微鏡上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司；iS10紅外光譜儀 美國尼力高儀器公司；水力（渦流）空化裝置 實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 水力空化處理SPI

用去離子水配制質(zhì)量濃度分別為60、80、100 g/L的SPI分散液，磁力攪拌2 h使其充分溶解。將不同質(zhì)量濃度的SPI分散液倒入水力（渦流）空化裝置的分散液貯箱中，開啟冷凝水，控制整個處理過程中SPI分散液的溫度不超過40 ℃，開啟渦流泵，調(diào)節(jié)壓力為0.4 MPa，分別處理10、20、30、60 min后取樣測定其粒徑、黏度并進行酶促凝膠制備。

1.3.2 SPI分散液粒徑的測定

參考文獻[13]的方法，使用GSL-1010全自動激光顆粒分布測量儀測定SPI樣品的粒徑。SPI樣品的折射率和吸收參數(shù)分別為1.450和0.001。將SPI樣品加入去離子水中，調(diào)整遮光率為20%～25%，測量樣品的粒徑分布情況和體積平均粒徑（）。

1.3.3 SPI分散液黏度的測定

參考文獻[14]的方法，使用MCR 72流變儀進行SPI黏度的測定，選擇直徑50 mm的平板進行SPI樣品剪切速率掃描。設(shè)定剪切速率范圍為10～1 000 s，記錄黏度隨剪切速率的變化情況。

1.3.4 酶促凝膠的制備

參考文獻[15]的方法向1.3.1節(jié)制得的樣品以及未經(jīng)過水力空化處理的SPI樣品中加入TG（添加量為3 g/L），于37 ℃水浴中保溫2 h后，取出置于4 ℃冰箱中，靜置8～12 h，測定樣品的凝膠性質(zhì)。

1.3.5 凝膠強度的測定

參考文獻[16]的方法，使用質(zhì)構(gòu)分析儀對1.3.4節(jié)制得的凝膠樣品進行凝膠強度的測定。使用P/0.5探頭，設(shè)定測前速度為5 mm/s，穿刺和測后速度為1 mm/s，壓縮距離為10 mm，觸發(fā)力為5.0 g。凝膠強度為下壓至10 mm時的最大力。

1.3.6 凝膠持水性的測定

參考文獻[17]的測定方法，分別準確稱取5 g 1.3.4節(jié)制得的凝膠樣品于離心管中，記錄離心管和凝膠樣品的總質(zhì)量，8 000 r/min離心20 min，取出離心管，將其倒置使水分排干，用濾紙擦干離心管內(nèi)外的殘留液體，記錄此時的總質(zhì)量，按下式計算持水性。

1.3.7 凝膠形成過程的流變學(xué)特性測定

參考文獻[18]的方法并稍作修改。使用流變儀進行模擬凝膠形成實驗，選擇直徑為50 mm的平板，設(shè)置間隙為1 mm，應(yīng)變?yōu)?.5%，角頻率為1 Hz。平板間充滿樣品后刮去多余的樣品，為了防止水分蒸發(fā)，在樣品周圍滴2～3 滴植物油。實驗中的溫度掃描由加熱階段、恒溫階段和降溫階段組成，即由2 ℃/min的速率從25 ℃升溫至37 ℃并保溫2 h，再以2 ℃/min的速率從37 ℃降溫至25 ℃，測定儲能模量（′）和損耗模量（″）隨溫度和時間的變化。

1.3.8 凝膠分子間作用力的測定

參照文獻[19-20]的方法，通過不同溶劑破壞SPI凝膠形成過程中的分子作用力，NaCl溶液（0.6 mol/L）可破壞離子鍵，低濃度（1.5 mol/L）尿素可破壞氫鍵，高濃度（8 mol/L）尿素可破壞疏水相互作用，而-巰基乙醇（0.5 mol/L）會破壞二硫鍵。將1.3.4節(jié)制得的凝膠樣品用大蒜壓制器壓碎后，采用逐級溶解法測定4種不同溶劑（S1：0.6 mol/L NaCl；S2：1.5 mol/L尿素＋0.6 mol/L NaCl；S3：8 mol/L尿素＋0.6 mol/L NaCl；S4：0.5 mol/L-巰基乙醇＋8 mol/L尿素＋0.6 mol/L NaCl）中溶解的凝膠的蛋白質(zhì)含量，分別以溶解于S1～S4的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例來表征凝膠中離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的相對含量，經(jīng)S4提取后最終所得沉淀的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例表示非二硫共價鍵的相對含量。具體操作步驟和計算方法參考文獻[12]。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

參考文獻[21]的方法，將1.3.4節(jié)制得的80 g/L SPI酶促凝膠樣品冷凍干燥后進行噴金，電壓為10 kV，用Phenom ProX掃描電子顯微鏡進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜分析

參考文獻[22]的方法，將1.3.4節(jié)制得的80 g/L SPI凝膠樣品冷凍干燥，與KBr粉末混合研磨，將混合粉末壓制成薄片，使用紅外光譜儀進行全波段掃描，設(shè)置分辨率為4 cm，掃描次數(shù)32 次，測量范圍為4 000～400 cm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設(shè)置3個平行，結(jié)果以平均值±標準差表示。使用SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析確定統(tǒng)計學(xué)差異，采用Duncan多重比較進行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水力空化對SPI粒徑的影響

水力空化對不同質(zhì)量濃度SPI分散液粒徑分布的影響如圖1所示，未經(jīng)水力空化處理的SPI樣品顯示出相對較寬的粒徑分布范圍，且具有更多更大尺寸的粒子。經(jīng)過水力空化處理后的SPI粒徑分布明顯變窄，且分布峰向較小粒徑方向移動較大。由圖2可知，水力空化處理使SPI的體積平均粒徑顯著降低（＜0.05），并且在處理30 min內(nèi)，平均粒徑隨著處理時間的延長而不斷降低。這說明空化過程中產(chǎn)生的剪切力或沖擊波等空化效應(yīng)能破壞蛋白分子間的相互作用，使大的聚集體解聚，粒徑降低。但是當(dāng)處理時間延長至60 min后，粒徑又有所增加，這可能是因為長時間空化處理促進蛋白發(fā)生了聚合。胡昊采用超聲波處理SPI時也觀察到類似現(xiàn)象。

圖1 水力空化對SPI分散液粒徑分布的影響Fig.1 Effect of HC on particle size distribution of SPI

圖2 水力空化對SPI粒徑的影響Fig.2 Effect of HC on particle sizes of SPI

2.2 水力空化對SPI分散液黏度的影響

由圖3可知，在10～1 000 s的剪切范圍內(nèi)，所有樣品的黏度都隨著剪切速率的增加而不斷降低，表現(xiàn)出典型剪切變稀的非牛頓流體特征。在相同剪切速率下，經(jīng)水力空化處理后的SPI黏度均比未處理的低，并且在空化處理30 min內(nèi)，黏度隨著處理時間的延長而降低，這主要是因為空化過程中產(chǎn)生的局部高溫、高壓、剪切或沖擊波等空化效應(yīng)使SPI中的聚集體解聚，粒徑降低，黏度減小。當(dāng)空化處理時間延長至60 min后，SPI的黏度又有所增加，這可能是因為長時間的空化處理引起了蛋白顆粒的重新聚集，使其粒徑增大，黏度增加。劉冉等使用超聲波處理SPI分散液時也發(fā)現(xiàn)超聲波能使SPI粒徑減小，黏度降低，但是SPI黏度并沒有隨著超聲功率的增加而一直降低，當(dāng)使用較大功率（400、600 W）處理時SPI重聚集，黏度反而增大。

圖3 水力空化對SPI分散液黏度的影響Fig.3 Effect of HC on the viscosity of SPI dispersion

2.3 水力空化對SPI酶促凝膠強度的影響

水力空化處理對不同質(zhì)量濃度SPI酶促凝膠強度的影響如圖4所示。在相同處理時間下，凝膠強度隨著SPI質(zhì)量濃度的增加而顯著增強（＜0.05），這與臧學(xué)麗等的研究結(jié)果一致。這是因為隨著蛋白質(zhì)量濃度增加，SPI與TG作用的機率增加，更多的SPI分子在TG的作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，促進了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。另外，蛋白質(zhì)量濃度的增加也促進了蛋白分子之間的相互作用，也有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。由圖4可知，水力空化處理能增加SPI酶促凝膠的強度。這是因為一方面，SPI經(jīng)水力空化處理后黏度下降，TG能更好地分散到SPI分散液中，有利于TG與蛋白分子的充分接觸，促進蛋白分子中賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生；另一方面，前期研究結(jié)果表明，SPI經(jīng)水力空化處理后粒徑減小，溶解性增大，表面疏水性增加，蛋白分子的結(jié)構(gòu)變得更加松散，這就使得原本埋藏在分子內(nèi)部的賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基暴露出來，增加了TG的作用位點，二者在TG的作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Hu Hao等研究發(fā)現(xiàn)SPI經(jīng)超聲處理后，其粒徑減小、表面疏水性和游離巰基含量增加，形成的凝膠強度明顯增加。另外，當(dāng)水力空化處理時間延長至60 min時，SPI所形成的凝膠強度相比30 min有所降低，這可能是過長時間的處理使得SPI重聚集，分散液的黏度又開始增大引起的。

圖4 水力空化對SPI酶促凝膠強度的影響Fig.4 Effect of HC on gel strength of transglutaminase-catalyzed SPI gel

2.4 水力空化對SPI酶促凝膠持水性的影響

由圖5可知，未經(jīng)水力空化處理的SPI形成的酶促凝膠持水性隨SPI質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)SPI質(zhì)量濃度分別為60、80、100 g/L時，凝膠的持水性分別為（42.15±0.87）%、（58.49±1.39）%、（70.26±1.21）%，表現(xiàn)為凝膠經(jīng)離心后均有不同量的水滲出。水力空化處理使SPI酶促凝膠的持水性顯著增加（＜0.05）。經(jīng)水力空化處理20 min后的SPI酶促凝膠經(jīng)離心后基本沒有水滲出，持水性接近100%。這可能是因為經(jīng)過水力空化處理后的SPI形成的酶促凝膠強度增加，空間結(jié)構(gòu)更加致密、均一，能將水分子更好地束縛在凝膠內(nèi)部。Zhang Peipei等也發(fā)現(xiàn)超聲空化可以提高SPI酶促凝膠的持水性，超聲空化可以有助于形成更均勻、更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，可以緊密結(jié)合更多的水，因此導(dǎo)致持水性增加。

圖5 水力空化對SPI酶促凝膠持水性的影響Fig.5 Effect of HC on water-holding capacity of transglutaminasecatalyzed SPI gel

2.5 水力空化對SPI酶促凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響

儲能模量（’）又稱為彈性模量，代表黏彈行為的彈性部分，描述的是樣品的固態(tài)特性；損耗模量（”）又稱黏性模量，代表黏彈行為的黏性部分，描述的是樣品的液態(tài)特性?！綠”說明樣品表現(xiàn)出黏彈性固體的特性，’＜”則說明樣品表現(xiàn)黏彈性流體的特性。SPI質(zhì)量濃度為60 g/L時的凝膠曲線如圖6A所示。未經(jīng)水力空化處理和經(jīng)水力空化處理10 min的SPI在整個過程中，’一直小于”，表現(xiàn)出黏彈性流體的特性，說明凝膠未形成。經(jīng)空化處理20、30、60 min的SPI分別在7 603、4 615、4 399 s時’＝”，說明凝膠網(wǎng)絡(luò)開始形成，之后’和”繼續(xù)增加，表明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在加強，整個過程結(jié)束后，最終形成凝膠的’分別達到2.81、11.52、7.12 Pa。SPI質(zhì)量濃度為80 g/L和100 g/L的凝膠曲線分別如圖6B、C所示，這兩個質(zhì)量濃度下未處理的SPI由于黏度大，一開始’就大于”，表現(xiàn)出黏彈性固體的特性，但是在整個過程中，’和”都沒有隨著溫度的變化和時間的延長而明顯增加。80 g/L的SPI經(jīng)水力空化處理不同時間后，黏度降低，一開始’＜”，表現(xiàn)出黏彈性液體的特性，在升溫和保溫過程中’和”一直隨著溫度的變化和時間的延長而逐漸增加，經(jīng)空化處理10、20、30、60 min的SPI分別在6 847、2 383、727.5、871.5 s時’＝”，說明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)開始形成，此后’和”繼續(xù)增加，在整個過程結(jié)束后，最終形成的凝膠的’值分別為24.76、82.28、1 384.70、726.23 Pa，其中經(jīng)水力空化處理30 min的SPI形成凝膠的’值高于未處理的’值。100 g/L的SPI經(jīng)水力空化處理后凝膠形成過程中的流變學(xué)性質(zhì)與80 g/L的類似，經(jīng)空化處理10、20、30、60 min的SPI分別在1 592、1 543、205.5、439.5 s時’＝”，最終形成的凝膠的’值分別為96.14、128.90、14 304.00、3 394.90 Pa，其中經(jīng)水力空化處理30 min和60 min的SPI形成凝膠的’值均高于未處理的’值。由此可見，SPI經(jīng)水力空化處理后的成膠的蛋白質(zhì)量濃度降低，成膠時間隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而提前，并且各個質(zhì)量濃度的SPI經(jīng)水力空化處理30 min后，所形成凝膠的’相比未處理的均明顯增加。Shen Xue等研究發(fā)現(xiàn)相對未處理樣品，超聲處理（20 KHz，20 min）的乳清蛋白在流變模擬凝膠形成過程中’和”顯著增大。Gregersen等的研究結(jié)果表明，超聲處理牛奶后導(dǎo)致開始形成酸促凝膠時間顯著縮短，還引起最終’的顯著增大。

圖6 水力空化對SPI酶促凝膠G’和G”的影響Fig.6 Effect of HC on G’ and G” of transglutaminase-catalyzed SPI gel

此外，需要說明的是，流變學(xué)測試結(jié)果與凝膠強度結(jié)果基本一致，但不是一一對應(yīng)的，如80 g/L的SPI經(jīng)水力空化處理20 min和60 min后的凝膠強度顯著高于未處理組（＜0.05），但是其’值卻小于未處理組。這可能是在測定流變特性和凝膠強度時施加在樣品上的力的類型不同造成的?！凳峭ㄟ^流變儀在保證形變的線性范圍內(nèi)給予蛋白質(zhì)樣品的剪切壓力，它對樣品的結(jié)構(gòu)沒有破壞。而凝膠強度是使用測試儀的探針對樣品進行的穿刺破壞性測試，它涉及探針與樣品之間的壓縮力和剪切力，還與蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中的填充物有關(guān)，因此’并不總是代表凝膠強度。

2.6 水力空化對SPI酶促凝膠分子間作用力的影響

由于水力空化對60、80、100 g/L SPI形成的酶促凝膠的強度、持水性和流變特性的影響趨勢大致相同，因此選取了中間質(zhì)量濃度80 g/L的SPI酶促凝膠來繼續(xù)研究凝膠的分子間作用力、微觀結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的變化，從而探討水力空化對SPI酶促凝膠行為的影響機制。由表1可知，未經(jīng)空化處理的SPI形成的酶促凝膠中分子間作用力以非二硫共價鍵和離子鍵為主，疏水相互作用和二硫鍵次之，氫鍵所占比例較小。經(jīng)過空化處理后的SPI形成的酶促凝膠中，二硫鍵和非二硫共價鍵相對含量顯著增加（＜0.05），成為凝膠形成的主要分子間作用力，而離子鍵、氫鍵和疏水相互作用相對含量均顯著降低（＜0.05）。前期研究結(jié)果表明，SPI經(jīng)水力空化處理后粒徑減小，溶解性增大，表面疏水性增加，蛋白分子的結(jié)構(gòu)變得更加松散，這就使得更多的賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基暴露出來，二者在TG的作用下交聯(lián)形成-(-谷氨?；?-賴氨酸共價結(jié)合鍵，使凝膠中非二硫共價鍵的相對含量增加，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。此外，前期研究結(jié)果還表明，水力空化處理能使SPI中的二硫鍵斷裂，蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，游離巰基含量增多，這就導(dǎo)致在TG誘導(dǎo)蛋白分子交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的同時，巰基互相靠近再形成二硫鍵，使凝膠中二硫鍵的相對含量增加，進一步促進凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。金楊等研究發(fā)現(xiàn)隨著凝固溫度的升高，填充豆腐的二硫鍵相對含量增多，與填充豆腐的硬度和彈性顯著正相關(guān)。Jia Dan等研究發(fā)現(xiàn)通過添加TG，鯉魚肌動球蛋白凝膠中非二硫鍵含量大大提高，凝膠強度、持水性及’顯著增大。結(jié)合前面凝膠強度和持水性的結(jié)果來看，經(jīng)水力空化處理后的SPI形成的酶促凝膠強度和持水性增加，這與凝膠中二硫鍵和非二硫共價鍵相對含量的增加有關(guān)。

表1 水力空化對80 g/L SPI酶促凝膠分子間作用力的影響Table 1 Effect of HC on intermolecular forces of transglutaminasecatalyzed gel from 80 g/L SPI

2.7 水力空化對SPI酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

采用電子掃描顯微鏡放大300 倍觀察80 g/L的SPI在水力空化處理前后所形成的酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化。如圖7所示，經(jīng)過水力空化處理后的SPI形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)與未處理組有明顯差異。未處理的SPI形成了松散、孔洞大小不一、無規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，經(jīng)水力空化處理20 min后的SPI形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對緊湊，經(jīng)水力空化30 min和60 min后形成的SPI凝膠網(wǎng)絡(luò)，結(jié)構(gòu)變得更加致密、孔洞較小而且均勻。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于水力空化顯著降低了蛋白粒徑，增加了暴露于蛋白表面的活性基團，促進TG交聯(lián)反應(yīng)形成更加均勻致密的凝膠結(jié)構(gòu)。致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加有利于水分的截留，提高持水性，這與前面持水性的研究結(jié)果一致。Zhang Peipei等發(fā)現(xiàn)通過高強度超聲空化處理SPI形成的TG酶促凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得致密、均勻，并顯著提高了SPI酶促凝膠的凝膠強度、保水能力。

圖7 水力空化對80 g/L SPI酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of HC on microstructure of transglutaminase-catalyzed gel from 80 g/L SPI

2.8 水力空化對SPI酶促凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響

SPI酶促凝膠樣品在4 000～400 cm范圍內(nèi)的傅里葉變換紅外光譜如圖8所示。SPI酶促凝膠的酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)光譜圖如圖9所示。采用Omnic 8.3和 Peakfit 4.12 軟件進行分析，包括在酰胺I帶（1 700～1 600 cm）范圍內(nèi)進行兩點基線校正、平滑處理、去卷積、作二階導(dǎo)數(shù)，同時采用Gaussian法進行多次曲線擬合，最后將擬合出的子峰歸屬給蛋白的4種二級結(jié)構(gòu)，并通過計算各子峰面積百分比推導(dǎo)蛋白樣品的二級結(jié)構(gòu)組成。各子峰與二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系：1 600～1 640cm為-折疊，1 650～1 660 cm為-螺旋，1 640～1 650 cm為無規(guī)卷曲，1 660～1 700 cm為-轉(zhuǎn)角。不同處理80 g/L SPI酶促凝膠二級結(jié)構(gòu)的相對含量如表2所示。

圖8 80 g/L SPI酶促凝膠的傅里葉變換紅外光譜Fig.8 Fourier transform infrared spectra of transglutaminasecatalyzed gel from 80 g/L SPI

圖9 80 g/L SPI酶促凝膠的酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig.9 Second-derivative amide I spectra of transglutaminase-catalyzed gel from 80 g/L SPI

表2 水力空化對80 g/L SPI酶促凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of HC on secondary structure of transglutaminasecatalyzed gel from 80 g/L SPI

由表2可知，經(jīng)過水力空化處理后的SPI酶促凝膠二級結(jié)構(gòu)中的各個組成的含量發(fā)生明顯變化。與未處理的樣品相比，經(jīng)過水力空化處理后的SPI酶促凝膠-折疊、-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量顯著增加，-螺旋、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量顯著降低，表明-螺旋、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成-折疊、-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量減少一般伴隨著氫鍵相對含量的降低，-折疊相對含量升高表明蛋白質(zhì)疏水相互作用降低，這與前文分子間作用力測定結(jié)果一致。無規(guī)卷曲相對含量的降低，說明凝膠二級結(jié)構(gòu)從無序向有序轉(zhuǎn)變，這與凝膠的微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果相印證。Herrero等研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)-折疊和-轉(zhuǎn)角的相對含量與形成的凝膠強度顯著正相關(guān)，可見經(jīng)水力空化處理后的SPI酶促凝膠強度的增加還與凝膠二級結(jié)構(gòu)中-折疊和-轉(zhuǎn)角相對含量的增加有關(guān)。

3 結(jié) 論

SPI經(jīng)水力空化處理后形成的酶促凝膠微觀結(jié)構(gòu)更加致密均勻；二級結(jié)構(gòu)中-螺旋、無規(guī)卷曲相對含量降低，-折疊、-轉(zhuǎn)角相對含量增加；凝膠形成過程中的分子間作用力也發(fā)生變化，二硫鍵和非二硫共價鍵的相對含量增加，成為凝膠形成的主要分子間作用力，而離子鍵、氫鍵相對含量和疏水相互作用均降低。這些凝膠結(jié)構(gòu)和分子間作用力的變化，使得經(jīng)水力空化處理后的SPI形成的酶促凝膠持水性、凝膠強度和最終的’增大，其中以處理30 min后形成的酶促凝膠最大。結(jié)果表明，一定時間的水力空化處理可以改善SPI酶促凝膠的性能，可為預(yù)測和控制大豆蛋白凝膠的性能和工藝優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。