綠木霉與雙向伯克霍爾德氏菌離體互作機(jī)制

王俊凱　鄧勛　邵鵬　宋小雙　宋瑞清

摘要 木霉與根際促生細(xì)菌在土傳病害生物防治上具有巨大潛力。該試驗(yàn)在兼容性篩選基礎(chǔ)上，研究了綠木霉（Trichoderma virens）ZT05與雙向伯克霍爾德氏菌（Burkholderia ambifaria）ZB155在離體條件下，發(fā)酵液代謝產(chǎn)物對(duì)互相的生長、孢子萌發(fā)、生物膜形成及拮抗活性方面的影響，并進(jìn)行了離體共培養(yǎng)體系構(gòu)建的初步研究。結(jié)果表明：菌株ZT05與ZB155離體條件下具有良好的兼容性。在離體互作研究中，兩個(gè)菌株在對(duì)互相的生長、孢子萌發(fā)、生物膜形成及對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的拮抗作用中表現(xiàn)出良好的兼容性。在活體共培養(yǎng)中，對(duì)病原菌的抑制作用同單接種處理差異顯著，其中對(duì)峙培養(yǎng)抑制率為38.10%，發(fā)酵液抑制率為76.67%，優(yōu)勢(shì)明顯。因此，菌株ZT05與菌株ZB155互作在生防作用上具有巨大潛力。

關(guān)鍵詞 綠木霉;雙向伯克霍爾德氏菌;共培養(yǎng);互作機(jī)制

中圖分類號(hào)：S718.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2022.04.001

Interaction Mechanism Between Trichoderma virens and Burkholderia ambifaria in Vitro

Wang Junkai Deng Xun Shao Peng Song Xiaoshuang Song Ruiqing

（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang; 2. Heilongjiang Academy of Forestry Sciences，F(xiàn)orest Conservation Research Institute，Harbin 150040，Heilongjiang;3. Heilongjiang Key Laboratory of Forest Grassland Fire and Pest control，Harbin 150040，Heilongjiang）

AbstractTrichoderma and rhizosphere growth-promoting bacteria have great potential in the biological control of soil-borne diseases，but the mechanism of interaction between them is less studied. On the basis of previous compatibility screening，the effects of metabolites from the fermentation broth of Trichoderma Virens ZT05 and Burkholderia ambifaria ZB155 on mutual growth，spore germination，biofilm formation and antagonistic activity

in vitro were studied. A preliminary study on in vitro co-culture systems was also carried out. The results showed

that strain ZT05 had good compatibility with ZB155 in vitro. In the study of in vitro interaction，the two strains showed good compatibility to each other's growth，spore germination，biofilm formation and antagonism to Rhizoctonia solani. In the co-culture in vivo，the inhibition of pathogens was significantly different from that of single inoculation. The inhibition rate of confrontation culture was 38.10%，and that of fermentation liquid was 76.67%，showing obvious advantages. In conclusion，the interaction between strain ZT05 and strain ZB155 has great potential in biocontrol，and this study lays a foundation for further studies on the interaction of compound biocontrol bacteria，plant-pathogen.

Key wordsTrichoderma virens;Burkholderia ambifaria;co-culture;interaction mechanism

根際促生細(xì)菌（PGPRs，plant growth promoting rhizobacteria）是指定殖于植物根際并能夠促進(jìn)植物生長的細(xì)菌[1]。主要通過生物固氮作用、分泌激素、產(chǎn)生鐵螯合載體、解磷作用等提高植物根際養(yǎng)分吸收能力[2]來提高植物耐旱性、提高產(chǎn)量、促進(jìn)生長[3-5]。其中，伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）作為優(yōu)良的促生抗逆菌屬，其菌屬的大部分物種擁有許多對(duì)植物、環(huán)境有益的功能，如生物修復(fù)、固氮、促生、誘導(dǎo)植物抗性等[6]，具有多種抑制植物病原真菌活性的功能，能有效抑制黃瓜、胡椒、大豆、草莓和番茄中的尖孢鐮刀菌（ Fusariumo xysporum） 、終極腐霉菌（ Pythium ultimum） 、立枯絲核菌（ Rhi-zoctonia solani） 和齊整小核菌（ Sclerotium rolfsii） 等[7]土傳真菌。在生防作用上具有巨大潛力。因此，雙向伯克霍爾德氏菌屬越來越受到關(guān)注，并成為植物根際促生菌的一個(gè)研究熱點(diǎn)菌屬。BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

木霉（Trichoderma spp.）是一種廣為人知的土傳真菌，在土壤中很常見，能在植物表面和內(nèi)部定殖為內(nèi)生真菌[8]，無處不在且高度多樣化。研究表明，木霉可以通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)和空間，利用低濃度營養(yǎng)物質(zhì)來占領(lǐng)病原菌侵入點(diǎn)[9]，也可主動(dòng)識(shí)別病原菌，以重寄生方式殺死寄主[10]及揮發(fā)代謝產(chǎn)物來達(dá)到抗生作用[11]。其中，綠木霉（Trichoderma virens）作為木霉的一種，在樟子松促生、抗病方面具有巨大潛力[12，13]，通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)和空間、改變環(huán)境條件、促進(jìn)植物生長、形成植物防御機(jī)制和抗生作用，或直接通過真菌寄生等機(jī)制對(duì)真菌致病菌進(jìn)行生物防治[14]。

現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)的發(fā)展要求減少化學(xué)藥劑的使用，以多種有益微生物復(fù)合使用，同時(shí)發(fā)揮促生抗逆和土壤修復(fù)功能的復(fù)合生物菌劑逐漸取代單一菌劑成為未來生物菌劑研究發(fā)展的方向，同時(shí)復(fù)合菌劑的使用可以保障益生菌在多樣的土壤和環(huán)境條件下保持高效率、可靠性和一致性[15]。而不同益生菌的兼容性是對(duì)植物促生抗病協(xié)同增效作用的關(guān)鍵因素[16]。Velmourougane等[17]通過調(diào)節(jié)細(xì)菌-木霉共培養(yǎng)體系條件下培養(yǎng)基比例與接種順序，成功證明了細(xì)菌-木霉共培養(yǎng)體系在提升生物量、生物膜形成、拮抗能力及胞外多糖方面的能力。證明了木霉-細(xì)菌共培養(yǎng)體系作為一種多功能植物生長促進(jìn)劑和土壤肥力促進(jìn)劑在土壤肥力研究中的應(yīng)用。然而，建立共培養(yǎng)體系的微生物之間存在直接或間接的相互作用，可能對(duì)生物防治效果產(chǎn)生消極或積極的影響。因此，在兩種生防菌的組合下，生防活性與個(gè)體活性相比可以提高、降低或相近[18]。所以，如何篩選出兼容且適合的品種，決定著共培養(yǎng)體系能否成功構(gòu)建。

在此背景下，本試驗(yàn)采用從樟子松根際分離篩選得到雙向伯克霍爾德氏（Burkholderia ambifaria）菌株ZB155，通過與多種優(yōu)秀的生防木霉菌種進(jìn)行兼容性評(píng)價(jià)，進(jìn)行離體互作的分析及共培養(yǎng)體系的構(gòu)建來探究其在生防作用上的潛力。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株：雙向伯克霍爾德氏（Burkholderia ambifaria）菌株ZB155、綠木霉（Trichoderma vi-rens）ZT05和T43、哈茨木霉（T. harzianum）T101和T14、綠色木霉（T. viride）5436、立枯絲核菌SH，其中菌株ZB155、ZT05、T101分離自遼寧省章古臺(tái)樟子松人工林根際土壤，菌株T14、5436、SH分離自黑龍江省葦河林業(yè)局苗圃，菌株T43引自以色列。上述菌株保存于黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 菌株培養(yǎng)方法

將-20 ℃保存的菌株ZB155接種在牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r·min^-1振蕩培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液12 000 r·min^-1離心10 min取上清。經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾除菌，得到無菌的ZB155發(fā)酵液。

將4 ℃保存的木霉ZT05接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，25 ℃靜置培養(yǎng)。4 d后用無菌打孔器（直徑10 mm）切取菌餅，接種于盛有150 mL PD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，每瓶接種3個(gè)菌餅，25 ℃、150 r·min^-1振蕩培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾去除菌絲并在12 000 r·min^-1下離心10 min，將發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾除菌，得到無菌的木霉ZT05發(fā)酵液。

木霉ZT05孢子懸液制備：參照陳臻等[19]的方法，將木霉ZT05活化后接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃靜置培養(yǎng)7 d后，在平板中加入10 mL無菌水，用無菌接種環(huán)輕輕刮取，將表面孢子洗脫。無菌水稀釋后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定，調(diào)節(jié)孢子液濃度為1.0×10⁶cfu·mL^-1。

1.3 木霉與促生細(xì)菌ZB155兼容性測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)方法分別測(cè)定5株木霉（包括ZT05、T101、T43、T14、5436）與促生細(xì)菌ZB155的兼容性。

參照尹大川等[20]的方法，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法：在距PDA平板中央2.5 cm處接種4個(gè)10 μLZB155菌液液滴，28 ℃靜置培養(yǎng)。24 h后在PDA平板中央接種木霉，25 ℃靜置培養(yǎng)。以未接種細(xì)菌為空白組，當(dāng)空白組木霉菌落長滿平板時(shí)，測(cè)量處理組的木霉菌落直徑，并計(jì)算抑制率，每個(gè)處理3次重復(fù)。

抑制率（%）=細(xì)菌菌落中心至真菌菌落邊緣距離/細(xì)菌菌落中心至真菌菌落中心距離×100

1.4 ZB155發(fā)酵液對(duì)ZT05生長及生防作用的影響

在前期兼容性測(cè)定試驗(yàn)中，篩選出了具有與菌株ZB155共培養(yǎng)可能性的木霉菌種，在離體條件下測(cè)定ZB155發(fā)酵液胞外代謝產(chǎn)物對(duì)木霉生長及拮抗活性的影響。

1.4.1 對(duì)ZT05菌絲生長的影響 將0.22 μm過濾除菌的ZB155發(fā)酵液按照1%、5%、10%、20%、30%（V∶V），5個(gè)濃度梯度分別加入PDA培養(yǎng)基中，將木霉ZT05接種于平板中央。以不添加ZB155發(fā)酵液為對(duì)照處理，25 ℃下靜置培養(yǎng)，在培養(yǎng)48 h和96 h時(shí)測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4.2 對(duì)ZT05孢子萌發(fā)的影響 參照陳雨等[21]的方法，菌株ZT05孢子懸液經(jīng)含上述1%、5%、10%、20%、30%（V∶V），5個(gè)不同濃度ZB155發(fā)酵液的0.1%吐溫80溶液處理6 h后，調(diào)節(jié)孢子濃度至1.0×10⁵cfu·mL^-1后接種于無菌水-瓊脂培養(yǎng)基平板中，25 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，在光學(xué)顯微鏡40倍鏡條件下觀察分生孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。

1.4.3 對(duì)ZT05拮抗活性影響B(tài)E1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

按照上述方法，將經(jīng)ZB155發(fā)酵液處理的ZT05菌株孢子液接種在PDA平板中，進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)。

平板對(duì)峙試驗(yàn)中，將立枯絲核菌SH接種在平板中央，在距中心2.5 cm處接種4個(gè)10 μLZT05孢子液滴（1×10⁶cfu·mL-1），25 ℃靜置培養(yǎng)4 d。以不接種ZT05為對(duì)照組，測(cè)量平板中央SH病原菌的菌落直徑并計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100

1.5 ZT05發(fā)酵液對(duì)ZB155生長及生防作用的影響

1.5.1 對(duì)ZB155生長的影響 在牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基中分組添加上述1%、5%、10%、20%、30%（V∶V）5個(gè)濃度梯度的木霉ZT05發(fā)酵液，以不添加發(fā)酵液組為空白對(duì)照。28 ℃下震蕩培養(yǎng)48 h后測(cè)量OD₆₃₀值。

1.5.2 對(duì)ZB155生物膜形成的影響 參照 O'Toole[22]的方法，使用結(jié)晶紫法檢測(cè)生物膜形成。在牛肉膏蛋白胨（NB）液體培養(yǎng)基中按上述1%、5%、10%、20%、30%（V/V）5個(gè)濃度梯度加入木霉ZT05的發(fā)酵液，以不加入發(fā)酵液為對(duì)照，每組3次重復(fù)，最終測(cè)量OD₅₅₀值。

1.5.3 ZB155拮抗活性的影響 按上述方法，將ZB155經(jīng)含有上述濃度ZT05發(fā)酵液的1%的吐溫80溶液中處理1 h后，進(jìn)行拮抗對(duì)峙試驗(yàn)。先將4個(gè)10 μLZB155菌液接種在距平板中央2 cm處，培養(yǎng)24 h。再在平板中央接種SH，25 ℃下靜置培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)后測(cè)量病原菌菌落直徑，測(cè)量抑制率，并測(cè)量抑菌帶寬度。

1.6 共培養(yǎng)體系對(duì)立枯絲核菌的抑制作用

在系統(tǒng)研究木霉ZT05與促生細(xì)菌ZB155相互作用的前提下，探究在共培養(yǎng)體系條件下木霉ZT05與促生細(xì)菌ZB155對(duì)立枯絲核菌的抑制作用。

1.6.1 對(duì)峙培養(yǎng)對(duì)立枯絲核菌的抑制作用

分別設(shè)置單獨(dú)接種ZT05、ZB155及共接種ZT05和ZB155等3個(gè)接種處理，將培養(yǎng)好的ZB155菌液（1.0×10⁸cfu·mL^-1）與ZT05孢子懸液（1.0×10⁶cfu·mL^-1）10 μL按照上述接種處理接種在距離PDA平板中心2.5 cm的一端，在另一端距接種點(diǎn)5.0 cm處接種病原菌SH菌餅。在28 ℃下靜置培養(yǎng)4 d，測(cè)量病原菌菌落直徑并計(jì)算抑制率。

1.6.2 發(fā)酵液對(duì)立枯絲核菌的抑制作用 按照K.Velmourougane的方法[23]，使用PD75∶NB25液體培養(yǎng)基（PD與NB比例為75∶25），提前接入10 μLZT05孢子懸液（1×10⁶cfu·mL-1），25 ℃震蕩培養(yǎng)，48h后接種10 μL ZB155菌液（1.0×10⁸cfu·mL^-1）振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后的發(fā)酵液過濾后以1 200 r·min^-1離心10 min獲取上清液，并經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾除菌，便得到ZT05與ZB155共培養(yǎng)體系的發(fā)酵液。

平板對(duì)峙：在PDA培養(yǎng)基中添加20%濃度的共培養(yǎng)發(fā)酵液，以不添加發(fā)酵液組為空白對(duì)照。平板中央接種SH，以不同濃度處理為對(duì)照組，在25 ℃下靜置培養(yǎng)至空白組菌絲長滿平板后，測(cè)量對(duì)照組菌落半徑并計(jì)算抑制率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用 Excel 2019 軟件進(jìn)行初步處理，數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，每個(gè)指標(biāo)設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。使用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)菌株生長、生物膜形成、抑制率進(jìn)行單因素方差分析，使用 Origin 2019軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兼容性測(cè)定

5種木霉與促生細(xì)菌ZB155的體外共培養(yǎng)4 d后，測(cè)定不同處理木霉菌落直徑，計(jì)算抑制率。由表1和圖1可知，菌株ZT05的抑制率為4.67%，與菌株ZB155的兼容性最好，與其他4種木霉抑制率相比存在顯著性差異（P<0.05），木霉ZT05菌落與細(xì)菌ZB155的菌落之間沒有明顯抑制帶，且菌落接觸后可繞過細(xì)菌菌落繼續(xù)生長。

2.2 木霉與促生細(xì)菌的離體互作

2.2.1 ZB155發(fā)酵液對(duì)ZT05的影響

（1）對(duì)菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響。ZB155發(fā)酵液代謝產(chǎn)物對(duì)ZT05菌落具有抑制作用。由圖2可以看出，菌株ZT05培養(yǎng)48 h時(shí)，不同濃度梯度之間ZT05生長存在顯著差異（P<0.05），但在培養(yǎng)96 h后，低濃度（1%～10%）之間差異減小，且均與空白對(duì)照無顯著差異，只在高濃度（20%～30%）處理下，存在顯著差異（P<0.05）。

結(jié)果表明菌株ZT05對(duì)ZB155發(fā)酵液代謝產(chǎn)物具有一定的適應(yīng)性，但在高濃度條件下，ZB155發(fā)酵液代謝產(chǎn)物對(duì)ZT05的生長仍會(huì)產(chǎn)生抑制，抑制率為34.63%。

在孢子萌發(fā)方面，經(jīng)過ZB155發(fā)酵液處理過的ZT05孢子在瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后萌發(fā)率接近90%，因此，ZB155發(fā)酵液對(duì)ZT05孢子的萌發(fā)無抑制作用。

（2）拮抗作用。ZT05孢子經(jīng)過1%～20%的ZB155發(fā)酵液處理6 h后，ZT05的拮抗活性并沒有出現(xiàn)顯著差異，其對(duì)立枯絲核菌的生長抑制率為68.96%～76.58%，見圖3。

其中當(dāng)ZB155發(fā)酵液濃度為30%時(shí)，抑制率為66.81%，與空白組差異顯著（P<0.05），ZB155發(fā)酵液對(duì)ZT05的拮抗活性產(chǎn)生了抑制作用，見圖4。

2.2.2 ZT05發(fā)酵液對(duì)ZB155的影響B(tài)E1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

（1）對(duì)ZB155生長的影響。用不同濃度（1%～30%）的ZT05發(fā)酵液加入NB培養(yǎng)基后，ZB155產(chǎn)生了不同程度的增長，其中在濃度為20%時(shí)OD₆₃₀最大值為0.584 3，20%以后促進(jìn)作用逐漸變緩，但較空白組仍有顯著差異（P<0.05）?？梢奪T05的發(fā)酵液對(duì)ZB155生長起到了促進(jìn)作用，且這個(gè)作用在前期會(huì)隨著濃度增加而增加，在濃度為20%時(shí)達(dá)到最高，見圖5。

（2）對(duì)ZB155生物膜的影響。

ZT05發(fā)酵液的添加對(duì)ZB155細(xì)菌生物膜的形成具有抑制作用，培養(yǎng)48 h后，1%～30% ZT05發(fā)酵液添加濃度處理，生物膜OD₅₅₀值為0.282 7～0.312 1。同對(duì)照處理OD₅₅₀值0.315 6相比，低濃度（1%～20%）時(shí)無顯著差異，高濃度（30%）時(shí)差異顯著（P<0.05），見圖6。

（3）對(duì)ZB155拮抗活性的影響。

不同ZT05發(fā)酵液濃度梯度處理后，菌株ZB155對(duì)立枯絲核菌的抑制作用無顯著性差異，對(duì)SH的抑制率為68.52%～71.06%（圖7）。通過觀察抑菌帶也可發(fā)現(xiàn)，寬度均為0.25 cm左右，沒有明顯差異（圖8）。說明ZT05發(fā)酵液對(duì)ZB155的拮抗活性沒有影響。

2.2.3 共培養(yǎng)體系對(duì)立枯絲核菌的抑制作用

（1）對(duì)峙培養(yǎng)對(duì)立枯絲核菌的抑制作用。和單獨(dú)對(duì)峙培養(yǎng)相比，活體共培養(yǎng)可顯著提高對(duì)立枯絲核菌生長的抑制作用，其中單獨(dú)接種ZT05菌落對(duì)峙的抑制率為28.57%，單獨(dú)接種ZB155菌落對(duì)峙時(shí)的抑制率為14.29%，ZT+ZB處理組的抑制率為38.10%，均形成顯著差異（P<0.05），見圖9。

（2）發(fā)酵液對(duì)立枯絲核菌的抑制作用。

由圖10可看出，ZT05與ZB155液體共培養(yǎng)發(fā)酵液（20%添加濃度）可顯著提高對(duì)立枯絲核菌生長的抑制作用，抑制率為76.67%，與其他兩組單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵液處理相比，差異顯著（P<0.05）

3 討論

3.1 兼容性分析

良好的菌株兼容性對(duì)成功建立木霉與促生細(xì)菌共培養(yǎng)體系至關(guān)重要，可起到協(xié)同增效的作用，否則由于菌種之間的相互競爭與抑制作用，會(huì)導(dǎo)致共培養(yǎng)體系生防水平的下降。

本試驗(yàn)采用對(duì)峙培養(yǎng)法，根據(jù)抑菌圈大小、菌落直徑變化程度和菌落形態(tài)有無變化等[24]，初步了解對(duì)峙效果后，通過計(jì)算抑制率進(jìn)行優(yōu)良兼容性木霉菌株的篩選。經(jīng)計(jì)算，菌株ZT05與菌株ZB155的兼容性最好，但抑制率僅為4.67%，顯著低于其余4個(gè)木霉菌株。對(duì)峙培養(yǎng)條件下，木霉菌株ZT05可以在細(xì)菌菌落周圍正常生長，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，木霉與細(xì)菌之間抑菌帶不明顯，甚至覆蓋細(xì)菌菌落，其他木霉菌株不僅會(huì)形成明顯抑菌帶，而且生長受到抑制，并且隨著對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)間增加，生長逐漸停滯。因此，在兼容性分析中篩選出具有共培養(yǎng)可能性的ZT05+ZB155組合，為進(jìn)一步研究互作機(jī)制打下良好基礎(chǔ)。

3.2 木霉與促生細(xì)菌的離體互作研究

本部分進(jìn)行了促生細(xì)菌ZB155的發(fā)酵液與木霉ZT05發(fā)酵液對(duì)對(duì)方在生長及生防作用能力影響上的離體互作研究。因?yàn)槲⑸锷乐苿┑某晒υ诤艽蟪潭壬先Q于引入的微生物主動(dòng)在目標(biāo)定殖的能力[25]，比如根際促生細(xì)菌（PGPR）生物膜的形成就與根部定殖有關(guān)。PGPR在根系分泌物濃度較高的地方形成微菌落或生物膜。在這些生物膜中，細(xì)菌之間相互溝通，以協(xié)調(diào)一致的方式發(fā)揮作用，并與抗性的誘導(dǎo)有關(guān)[26]。所以，除了通過與病原菌立枯絲核菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)以外，還對(duì)木霉ZT05的分生孢子萌發(fā)率及促生細(xì)菌ZB155的生物膜形成情況也進(jìn)行了分析。

菌株ZB155發(fā)酵液對(duì)ZT05的生長和對(duì)立枯絲核菌的拮抗能力產(chǎn)生了抑制作用，但并沒有影響孢子萌發(fā)率。ZB155對(duì)ZT05的抑制效果與添加發(fā)酵液的濃度有關(guān)，在高濃度處理（20%～30%）中產(chǎn)生顯著的抑制作用，而在的低濃度處理（1%～10%）中，抑制作用不顯著。對(duì)峙培養(yǎng)中，經(jīng)高濃度ZB155發(fā)酵液處理的木霉ZT05菌株對(duì)立枯絲核菌的抑制率下降，與低濃度及空白處理產(chǎn)生顯著差異（P<0.05），其原因也與ZT05的生長有關(guān)。經(jīng)發(fā)酵液處理的ZT05菌落較稀疏，明顯是受到了生長方面的抑制作用，而木霉主要的拮抗作用便來自于競爭和寄生作用，當(dāng)ZT05本身的生長受到抑制時(shí)，其對(duì)病原菌的抑制效果也會(huì)受到影響。

菌株ZT05發(fā)酵液對(duì)ZB155的生長具有促進(jìn)作用，對(duì)病原菌的拮抗作用無影響。木霉ZT05發(fā)酵液胞外代謝產(chǎn)物低濃度處理（1%～20%）后，促生細(xì)菌ZB155生物膜形成同對(duì)照相比無顯著差異（P>0.05），在對(duì)峙培養(yǎng)中，菌株ZB155對(duì)病原菌的拮抗作用并未受到影響。

綜合分析，菌株ZT05和ZB155的互作中，以相互促進(jìn)為主，只在高濃度處理中才表現(xiàn)出抑制作用，考慮到木霉的抗菌化合物在自然條件下的濃度遠(yuǎn)低于本研究使用的濃度[27]，因此上述結(jié)果可以為接下來的活體共培養(yǎng)體系的建立打下基礎(chǔ)。

3.3 共培養(yǎng)體系的立枯絲核菌的抑制作用

共培養(yǎng)（co-culture）是在一個(gè)培養(yǎng)容器中一起培養(yǎng)兩種或多種微生物的方法。共培養(yǎng)可以在液體或固體培養(yǎng)基中進(jìn)行。當(dāng)使用液體培養(yǎng)時(shí)，該方法也稱為 “混合發(fā)酵”[28]。共培養(yǎng)體系與之前離體互作的區(qū)別在于，離體的互作更多是探究菌物之間胞外代謝產(chǎn)物的相互影響，并且從空間上講，兩者是分開獨(dú)自培養(yǎng)在自己的最適環(huán)境中。然而共培養(yǎng)體系會(huì)更加復(fù)雜，因?yàn)楣才囵B(yǎng)體系的成功不僅取決于生防菌的個(gè)體能力，還取決于它們之間的相互作用[29]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)木霉ZT05與促生細(xì)菌ZB155活體共培養(yǎng)時(shí)對(duì)立枯絲核菌SH的拮抗活性增強(qiáng)，其中共培養(yǎng)體系發(fā)酵液對(duì)立枯絲核菌的抑制效果顯著?；铙w共培養(yǎng)時(shí)，ZT+ZB處理與ZT或ZB單獨(dú)處理組對(duì)比時(shí)，抑制率均有顯著提高（P<0.5）?？梢钥闯?，ZT05在加入ZB155共培養(yǎng)后ZB155對(duì)其生長產(chǎn)生一定抑制，導(dǎo)致其菌落明顯比單獨(dú)接種時(shí)稀疏，菌落直徑減小，但抑制率卻不降反升。原因是ZB155雖減少了ZT05與SH的營養(yǎng)競爭能力，但自身也分泌了更多的胞外代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生拮抗性，這兩方面因素均發(fā)生作用。從結(jié)果看，促進(jìn)的作用要強(qiáng)于抑制的作用，這在后來的發(fā)酵液培養(yǎng)中也得到了證明。木霉活體抑制率較高，而發(fā)酵液抑制率較低，因?yàn)槠渲饕霓卓棺饔眠€是來自于活體的營養(yǎng)競爭。相反，促生細(xì)菌ZB155發(fā)酵液抑制率相比活體抑制率較高，是因?yàn)槠渲饕堪獯x產(chǎn)物產(chǎn)生抑菌作用。所以將ZT與ZB在適當(dāng)?shù)臐舛缺壤才囵B(yǎng)后，無論是活體對(duì)峙培養(yǎng)還是發(fā)酵液對(duì)峙培養(yǎng)，都比單獨(dú)接種有更高的抑制率。這也證明，在共培養(yǎng)體系的條件下，的確是達(dá)到了“1+1>1”的效果，但是否是“1+1>2”，還需要更加深入的研究。BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

為了更好地了解這些微生物在根際的相容性，還需要進(jìn)一步的接種試驗(yàn)，并且在共培養(yǎng)體系的構(gòu)建上需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組合、溫度、共培養(yǎng)方式等，以求兩種菌之間最大的兼容性。但至少在本次試驗(yàn)中，我們見證了構(gòu)建共培養(yǎng)體系的優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

4.1 比較T43、T101、ZT05、T14、5436這5株木霉菌株，ZT05是與促生細(xì)菌ZB155具有最佳兼容性的，可用于構(gòu)建共培養(yǎng)體系。

4.2 在離體互作中，木霉ZT05與促生細(xì)菌ZB155之間并沒有展現(xiàn)出明顯的抑制作用，尤其是在生防作用方面。

4.3 木霉ZT05與促生細(xì)菌ZB155的共培養(yǎng)體系在對(duì)立枯絲核菌的拮抗作用研究中展現(xiàn)出了較好的作用，相比于單獨(dú)培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系的拮抗作用有明顯的增強(qiáng)，尤其在發(fā)酵液的對(duì)峙中，促進(jìn)作用明顯。這證明了多種菌株共培養(yǎng)體系的建立是有利的。

4.4 本次離體共培養(yǎng)體系的建立展現(xiàn)了其優(yōu)越性及潛力，在生防作用上，為以后的接種試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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