生物大分子藥物無創(chuàng)眼內(nèi)遞送研究進(jìn)展

熊殷，樊星硯，王亦凡，魏剛,

（1. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院, 教育部智能化遞藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201203；2. 復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海200040；3. 上海市免疫治療工程研究中心，上海201203）

眼睛是感知世界最重要的器官。眼部疾病如得不到及時(shí)有效的治療將影響視力，特別是眼內(nèi)疾病具有導(dǎo)致失明的風(fēng)險(xiǎn)，為患者的生活帶來不便和痛苦。據(jù)世界衛(wèi)生組織2019年發(fā)布的《世界視覺報(bào)告》，全球至少有22億人視力受損，其中至少有10億人的視力損傷本可預(yù)防或尚可治愈[1]。由于眼睛具有高度的敏感性和復(fù)雜的保護(hù)機(jī)制，眼內(nèi)藥物遞送面臨著巨大的挑戰(zhàn)。但眼睛具有免疫豁免特性，與其他器官相比，多肽、蛋白以及基因一類的生物大分子藥物更適合用于眼內(nèi)疾病的治療。與小分子藥物相比，生物大分子藥物的優(yōu)勢(shì)在于其藥理活性更強(qiáng)，具有高效力和高特異性。如雷珠單抗、阿柏西普、康柏西普等生物大分子藥物用于治療老年黃斑變性等新生血管性眼底疾病的效果顯著。對(duì)于目前尚無藥可醫(yī)的致盲性眼部遺傳疾病，基因治療與生物大分子藥物更是為患者帶來了保留視力的希望。然而，生物大分子藥物通常具有相對(duì)分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，親水性強(qiáng)等特點(diǎn)，難以跨越生物屏障；且其穩(wěn)定性差，體內(nèi)半衰期短，進(jìn)一步為其制劑設(shè)計(jì)增加了難度[2-3]。對(duì)于眼科疾病的治療，滴眼給藥一直是最容易被患者接受的給藥方式。但是由于眼部存在諸多吸收屏障，生物大分子藥物幾乎無法通過滴眼給藥的方式滲透入眼內(nèi)[4]。目前這一類藥物需要采取眼內(nèi)注射的方式給藥，患者順應(yīng)性差，且易引起多種并發(fā)癥。因此，眼科臨床亟需新型的無創(chuàng)給藥系統(tǒng)，有效地將這些生物大分子藥物靶向遞送至眼內(nèi)病灶部位。

理想的生物大分子藥物眼部遞送系統(tǒng)應(yīng)具備以下特征：1）能穿透眼部吸收屏障，將大分子藥物靶向遞送至眼內(nèi)病灶部位，并能滯留較長(zhǎng)時(shí)間；2）能提高生物大分子藥物的穩(wěn)定性，保護(hù)其不被各種酶等降解；3）給藥方式具有無創(chuàng)性，有較好的患者順應(yīng)性，最大程度減少給藥引發(fā)的副作用；4）能實(shí)現(xiàn)控釋或緩釋，以維持藥物的有效治療濃度，減少給藥頻率等。近年來已經(jīng)有許多研究者借助膠束、脂質(zhì)體等納米遞藥系統(tǒng)，或者吸收促進(jìn)劑細(xì)胞穿膜肽，以及一些物理手段實(shí)現(xiàn)了大分子藥物的眼內(nèi)遞送，特別是通過滴眼給藥的方式將有效濃度的蛋白藥物或基因藥物遞送至眼底病灶部位，在動(dòng)物模型體內(nèi)抑制了脈絡(luò)膜新生血管、眼內(nèi)腫瘤等復(fù)雜眼底疾病的進(jìn)程，為實(shí)現(xiàn)眼底疾病的無創(chuàng)治療帶來了曙光。

1 眼部疾病概述

眼球的解剖結(jié)構(gòu)以晶狀體為界可分為眼前段和眼后段（見圖1）。眼前段包括角膜、結(jié)膜、虹膜、睫狀體、房水和晶狀體，眼后段則包括鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜及玻璃體。其中，角膜、結(jié)膜和鞏膜包裹在眼球的最外層，阻礙外源性物質(zhì)進(jìn)入，使眼球成為一個(gè)相對(duì)封閉的器官。

圖1 眼球解剖結(jié)構(gòu)Figure 1 Anatomical structure of eyeball

與眼球結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，眼部疾病可根據(jù)病變部位分為眼前段疾病和眼后段疾病。角膜炎及結(jié)膜炎（俗稱紅眼?。┦堑湫偷难矍岸渭膊?，一般由細(xì)菌、真菌或病毒等微生物引起。其他常見的眼前段疾病還包括干眼癥（也稱角結(jié)膜干燥癥）、白內(nèi)障、角膜新生血管、糖尿病性角膜病變等。以視網(wǎng)膜中央黃斑區(qū)退行性病變?yōu)樘卣鞯睦夏晷渣S斑變性，即年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，ARMD）是最常見的眼后段疾病，可分為干性和濕性黃斑變性，后者與新生血管相關(guān)，表現(xiàn)為視力迅速下降，病情發(fā)展較快，易引起失明[5]。眼后段疾病還包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤及脈絡(luò)膜黑色素瘤等。此外，葡萄膜炎、青光眼等疾病累及整個(gè)眼球，同時(shí)影響眼前段和眼后段組織[6]。

2 治療眼部疾病的生物大分子藥物

生物大分子藥物指采用生物技術(shù)獲得的細(xì)胞、微生物，以及各種動(dòng)物或人源組織等生物材料制備的用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品，包括多肽類藥物、單克隆抗體（單抗）和重組蛋白等蛋白質(zhì)類藥物以及核酸類藥物等。在過去的幾十年中，結(jié)構(gòu)生物化學(xué)、基因工程、藥物制劑等領(lǐng)域都取得了重大突破，從而促進(jìn)了生物大分子藥物的臨床應(yīng)用，包括治療各種眼部疾病。2020年全球銷售額排名前100（TOP 100）的藥品中，包括單抗、抗體偶聯(lián)藥物、重組蛋白在內(nèi)的大分子藥物共42個(gè)，銷售額占比49%。目前已上市用于治療眼部疾病的生物大分子藥物見表1。其中，阿柏西普屬于重組融合蛋白，于2011年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。該藥物作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的誘騙受體，防止VEGF-A與相應(yīng)的受體VEGFR-1及VEGFR-2結(jié)合，從而抑制新生血管生成，并降低血管通透性，臨床上可用于治療濕性老年性黃斑變性及黃斑水腫[7]。阿柏西普2020年全球銷售額達(dá)79.09億元，位列TOP 100榜單第5名。奧克纖溶酶是首個(gè)獲批用于治療玻璃體黃斑粘連的眼科藥物，作為一種重組蛋白酶，通過降解玻璃體和視網(wǎng)膜交界面的蛋白使兩者之間的粘連分離，進(jìn)而避免導(dǎo)致黃斑裂孔[8]。單抗類藥物阿達(dá)木單抗連續(xù)數(shù)年蟬聯(lián)全球藥品銷售額冠軍。其為抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）藥物，于2016年獲批用于非感染性葡萄膜炎的治療，是首個(gè)也是目前唯一可用于治療葡萄膜炎的非糖皮質(zhì)激素藥物[9]。

表1 美國(guó)和中國(guó)已上市用于治療眼部疾病的生物大分子藥物Table 1 Biomacromolecules approved in US and China for ophthalmologic application

3 眼部吸收屏障與給藥途徑

如圖1所示，眼部存在多種吸收屏障，主要包括角膜屏障、結(jié)膜屏障、血-房水屏障（bloodaqueous barrier，BAB）、血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retina barrier，BRB）、淚液清除等。圖2展示了滴眼給藥后藥物吸收進(jìn)入眼內(nèi)的2條主要途徑，分別為角膜途徑和結(jié)膜-鞏膜途徑。經(jīng)眼表滴入給藥后，淚液膜是藥物吸收的第一道屏障。淚液更新的速率大約為1 μL · min-1，加之眨眼清除與鼻淚管引流，多數(shù)藥物在數(shù)分鐘之內(nèi)從眼表流失[10-11]。經(jīng)鼻淚管引流進(jìn)入體循環(huán)的藥物還可能產(chǎn)生全身毒性和副作用。致密的疏水性角膜上皮層是局部滴眼給藥后藥物吸收的主要屏障，相對(duì)分子質(zhì)量大、親水性的藥物很難透過，而親脂性藥物的透過又受限于角膜的親水性基質(zhì)層。因此，藥物的角膜滲透能力與其親脂性呈拋物線關(guān)系，對(duì)數(shù)油水分配系數(shù)（LogP）在2.0 ~ 2.5區(qū)間的藥物通常具有較好的角膜滲透速率[12]。結(jié)膜上皮除具有緊密連接外，還分布有毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管，可阻礙外源性物質(zhì)進(jìn)入眼內(nèi)[6,11]。相較于角膜，鞏膜組織的結(jié)構(gòu)更為疏松，親水性及相對(duì)分子質(zhì)量較大的藥物易通過此途徑吸收入眼。此外，眼前段還有BAB，由睫狀體的無色素睫狀上皮細(xì)胞與虹膜毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞組成，阻礙藥物經(jīng)虹膜血管進(jìn)入眼內(nèi)。玻璃體液富含膠原蛋白、透明質(zhì)酸等物質(zhì)，具有黏彈性，大分子藥物不易從玻璃體擴(kuò)散至視網(wǎng)膜。攜帶正電荷的藥物還會(huì)與帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸或膠原蛋白結(jié)合，進(jìn)一步阻礙其擴(kuò)散[10]。BRB外側(cè)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞之間及其內(nèi)側(cè)的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間同樣具有緊密連接，有效限制了藥物分子通過脈絡(luò)膜血液循環(huán)向眼后段運(yùn)輸，只有部分親脂性的小分子藥物可少量透過。

圖2 滴眼給藥后藥物的眼部吸收途徑Figure 2 Ocular absorption routes after topical instillation

上述眼部吸收屏障一方面保護(hù)眼睛不受外來異物的影響，但另一方面也給藥物的眼內(nèi)遞送，特別是眼后段藥物遞送帶來了困難。生物大分子藥物可通過滴眼、局部注射及全身給藥方式應(yīng)用。傳統(tǒng)滴眼液的眼部生物利用度一般小于5%，大分子藥物的吸收則更少[13]。目前眼部應(yīng)用的生物大分子藥物，除了賽奈吉明直接作用于角膜表面外，其他治療眼后段疾病的生物大分子藥物均采用眼內(nèi)注射（包括玻璃體內(nèi)注射和視網(wǎng)膜下腔注射）的方式給藥（見表1）。眼內(nèi)注射給藥的優(yōu)勢(shì)在于可繞過眼前段吸收屏障，使藥物直達(dá)眼內(nèi)。然而，眼內(nèi)注射是一種高侵入性的給藥方式，不僅對(duì)給藥技術(shù)的要求較高，還易引發(fā)眼部出血、疼痛、眼內(nèi)壓升高、視網(wǎng)膜脫落、白內(nèi)障、眼內(nèi)炎等并發(fā)癥，且頻繁注射導(dǎo)致患者的順應(yīng)性差[14]。此外，視網(wǎng)膜下腔注射、脈絡(luò)膜上腔注射等給藥方式雖然可繞過結(jié)膜和鞏膜屏障，在病灶部位達(dá)到更高的治療濃度，但給藥操作難度更大，同時(shí)也具有更大的風(fēng)險(xiǎn)[6,15]。除阿達(dá)木單抗和替妥木單抗通過全身作用發(fā)揮藥效外，治療眼部疾病通常不采用全身給藥。這是因?yàn)锽RB使藥物難以經(jīng)此途徑滲透入眼，生物利用度極低，僅有1% ~ 2%的藥物可到達(dá)玻璃體，且易導(dǎo)致全身副作用[16]。因此，滴眼給藥仍是患者最樂于接受的給藥方式，但需要借助有效的遞送系統(tǒng)改善眼部生物利用度，提高療效及安全性，才能解決生物大分子藥物無創(chuàng)眼內(nèi)遞送的難題。

4 多肽蛋白類藥物的無創(chuàng)眼內(nèi)遞送

近年來，研究者不斷嘗試?yán)媚z束、脂質(zhì)體等納米遞藥系統(tǒng)或細(xì)胞穿膜肽等吸收促進(jìn)劑通過滴眼給藥將多肽蛋白類藥物遞送入眼，并在大分子藥物的眼后段遞送方面取得了一定突破。

4.1 膠束載體

膠束是兩親性嵌段共聚物在水中自組裝形成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定的膠體溶液。將膠束作為眼部藥物遞送載體的優(yōu)勢(shì)在于：1）具有黏膜黏附特性的聚合物膠束可延長(zhǎng)藥物在眼表的滯留時(shí)間，不易被眨眼或淚液清除；2）粒徑較小，通常小于100 nm，有利于滲透進(jìn)入眼部組織；3）可將疏水藥物包載于膠束內(nèi)核以起到增溶作用，且形成的水性溶液澄清透明，不會(huì)干擾視力；4）可緩慢釋放藥物；5）增加藥物的穩(wěn)定性，提高藥效，減少副作用[17]。

膠束的特性使其適合作為多肽類藥物滴眼給藥的載體，與傳統(tǒng)的溶液、混懸或乳劑型滴眼劑相比，其在藥效與舒適性方面有更好表現(xiàn)。環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）是由11個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，屬于免疫抑制劑，臨床上可用于治療干眼癥。由于CsA水溶性差（12 mg · L-1，25℃），難以配制成有效濃度的溶液型滴眼劑[18]。2003年，CsA眼用乳劑Restasis（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%）被FDA批準(zhǔn)上市。該產(chǎn)品處方中應(yīng)用蓖麻油為油相，吐溫和甘油為乳化劑，易產(chǎn)生眼部燒灼感、結(jié)膜充血、刺痛等不良反應(yīng)[19]。Di Tommaso等[20]采用甲氧基聚乙二醇和己基取代聚乳酸制備0.05% CsA膠束，粒徑為（35±1）nm，所得溶液澄清透明，利用膠束增溶特性克服了CsA溶解度差的問題，可更好地被眼部耐受，提高患者用藥的舒適度。同時(shí)，CsA膠束溶液連續(xù)5 d每天滴眼給藥2次，測(cè)得每克大鼠角膜中含CsA（1 540±400）ng，顯著高于市售乳劑藥物Restasis組，其原因在于前者可作為藥物貯庫(kù)緩慢釋放。膠束溶液劑和乳劑組血漿中的CsA質(zhì)量濃度均低于檢測(cè)限，可避免CsA的全身性副作用[20]。Cholkar等[21]采用優(yōu)化比例（1∶0.05）的氫化蓖麻油40和辛基酚聚醚40制備0.1% CsA納米膠束，同樣得到澄清透明的水溶液，平均粒徑為22.4 nm。值得一提的是，該納米膠束每日4次（每次間隔2 h）連續(xù)滴眼給藥5 d后，不僅在眼前段組織有較高的藥物分布[每克角膜組織中含CsA（7 805±325）ng，每克結(jié)膜組織中含CsA（2 125±575）ng]，在眼后段的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織中也有CsA的分布，每克組織中含CsA（53.7±31.3）ng。眼組織藥物分布提示，納米膠束可通過結(jié)膜-鞏膜途徑將CsA遞送至視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜[21]。2018年8月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)0.09% CsA眼用溶液Cequa上市，其采用新型專利納米膠束配方，是一種不含防腐劑的水溶液，每日滴眼2次可促進(jìn)淚液產(chǎn)生，用于治療干眼癥[22]。

4.2 脂質(zhì)體載體

脂質(zhì)體具有類似細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可攜帶親水性或親脂性藥物，也是研究的最多的藥物遞送載體之一。將功能性分子修飾在脂質(zhì)體上能進(jìn)一步促進(jìn)生物大分子藥物的眼內(nèi)遞送。膜聯(lián)蛋白A5（annexin A5，AnxA5）是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)其可跨越血管屏障，且在角膜上皮中高表達(dá)[23-24]。因此，研究者猜想AnxA5可用于促進(jìn)局部給藥向眼組織遞送。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)AnxA5修飾且包載氯化鈣的脂質(zhì)體其人角膜上皮細(xì)胞攝取量是未修飾AnxA5脂質(zhì)體的近3倍，同時(shí)在體外模型中其可成功跨越角膜上皮屏障。Davis等[25]采用此遞藥系統(tǒng)包載抑制新生血管生成的大分子藥物貝伐單抗，結(jié)果顯示，與游離的貝伐單抗溶液相比，滴眼給藥后AnxA5的修飾使兔視網(wǎng)膜的貝伐單抗?jié)舛仍黾恿私?0倍。因此，有望利用AnxA5修飾的脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)將抗VEGF藥物無創(chuàng)遞送至眼后段，從而治療老年黃斑變性等眼底疾病。

另有研究者同樣采用AnxA5修飾的脂質(zhì)體將轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng) 因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）通過無創(chuàng)給藥的方式遞送至玻璃體。滴眼給藥1h后，玻璃體中TGF-β1的質(zhì)量濃度達(dá)（114.70 ±12.40）ng · L-1，該質(zhì)量濃度與先前在ARMD模型中被證明有效的TGF-β1質(zhì)量濃度一致。Draize眼刺激性試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，兔眼對(duì)該制劑良好耐受，眼部刺激性較低[26]。ARMD的發(fā)展可能與TGF-β1/SMAD（small mother against decapentaplegic）通路的失調(diào)有關(guān)[27]。采用無創(chuàng)給藥方式將TGF-β1遞送至眼后段病灶部位，可控制ARMD的發(fā)生發(fā)展，并對(duì)視網(wǎng)膜起到一定的保護(hù)作用。

4.3 吸收促進(jìn)劑

針對(duì)眼部存在的多種吸收屏障，不同作用機(jī)制的吸收促進(jìn)劑被嘗試應(yīng)用于眼部無創(chuàng)給藥。傳統(tǒng)的吸收促進(jìn)劑主要包括乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等螯合劑及吐溫80（Tween 80）等非離子型表面活性劑。EDTA可打開上皮細(xì)胞間的緊密連接，從而促進(jìn)藥物通過細(xì)胞旁路途徑滲透；而Tween 80可通過擾動(dòng)磷脂?；湼纳萍?xì)胞膜通透性[28]。但是眼部組織非常敏感，含有這些小分子吸收促進(jìn)劑的滴眼液可能會(huì)導(dǎo)致眼部刺激，長(zhǎng)期應(yīng)用的眼部蓄積毒性也值得關(guān)注。

細(xì)胞穿膜肽通常由5 ~ 40個(gè)氨基酸組成，可通過能量依賴或非依賴途徑高效介導(dǎo)與其共價(jià)或非共價(jià)連接的藥物穿過細(xì)胞膜或生物組織屏障[29]。因穿膜能力強(qiáng)且毒性低，近年來穿膜肽逐漸被研究者用作新型眼部吸收促進(jìn)劑，如反式轉(zhuǎn)錄激活因子（trans-activator of transcription，TAT），PEP-1，penetratin及多聚精氨酸等[29-30]。它們多為陽離子穿膜肽，穿膜能力與所帶正電荷相關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)penetratin的氨基酸進(jìn)行色氨酸突變有利于進(jìn)一步增強(qiáng)其眼部滲透能力[31]。

蛋白類藥物大多由于相對(duì)分子質(zhì)量大、親水性強(qiáng)而無法跨越角膜上皮屏障。將穿膜肽以融合蛋白或物理混合的形式作為大分子藥物滴眼劑的吸收促進(jìn)劑，可顯著增加其眼部吸收。FK506結(jié)合蛋白12（FK506 binding protein 12，F(xiàn)K506BP）具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用和抗炎活性。利用分子生物學(xué)技術(shù)制備細(xì)胞穿膜肽PEP-1與FK506BP的融合蛋白，滴眼給藥后，該融合蛋白對(duì)肉毒桿菌毒素A或低濕度氣流誘導(dǎo)的2種干眼癥模型均具有較好的治療作用，在增加淚液分泌的同時(shí)顯著降低白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、TNF-α、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）等多種炎癥因子的表達(dá)，而單獨(dú)的FK506BP滴眼效果不佳[32-33]。

Zhang等[34]設(shè)計(jì)并制備了穿膜肽TAT與內(nèi)皮抑素（endostatin）的融合蛋白。與游離的內(nèi)皮抑素相比，融合蛋白的體外細(xì)胞攝取量顯著增加，且呈濃度及時(shí)間依賴性，巨胞飲作用可能是融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑。TAT-內(nèi)皮抑素融合蛋白滴眼給藥后，可跨越眼部吸收屏障到達(dá)視網(wǎng)膜，并且有效抑制了小鼠脈絡(luò)膜新生血管[34]。TAT與酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（acidic fibroblast growth factor-His，aFGF-His）的融合蛋白經(jīng)大鼠眼表滴入給藥30 min后，同樣可以分布于視網(wǎng)膜組織，并對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型起到顯著保護(hù)作用，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)得以維持，減少了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡并改善了視網(wǎng)膜功能；aFGF-His由于難以到達(dá)視網(wǎng)膜而無法發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用，該組視網(wǎng)膜損傷程度與生理鹽水組類似[35]。de Cogan等[36]將穿膜肽聚精氨酸（R6）與抗VEGF藥物貝伐單抗或雷珠單抗簡(jiǎn)單地物理混合，滴眼給藥后，大分子藥物可被有效遞送至大鼠眼后段組織。同時(shí)研究者選用與人眼結(jié)構(gòu)更為接近的豬眼作為體外模型，同樣證明了該復(fù)合物可將大分子藥物遞送至玻璃體及視網(wǎng)膜。R6/貝伐單抗復(fù)合物每日滴眼2次，持續(xù)給藥10 d可顯著減小小鼠脈絡(luò)膜新生血管的病變范圍，療效與玻璃體內(nèi)注射貝伐單抗相當(dāng)[36]。利用細(xì)胞穿膜肽高效的跨越生物屏障能力，可通過無創(chuàng)的滴眼給藥的方式將蛋白類藥物遞送至眼后段，進(jìn)而發(fā)揮藥效。

4.4 其他遞送方法

離子電滲療法是基于離子電滲裝置、以離子流驅(qū)動(dòng)藥物滲透的一種非侵入給藥方式。如圖3所示，置于眼部的載藥電極與耳后接地電極間形成穩(wěn)定電場(chǎng)，促進(jìn)帶電荷的藥物跨越眼部屏障，向眼內(nèi)滲透。目前，離子電滲療法已被成功用于將抗生素及類固醇等小分子藥物遞送入眼，但是很少有研究利用此種方法實(shí)現(xiàn)大分子藥物的眼內(nèi)遞送。Molokhia等[37]采用離子電滲療法將0.6 mg貝伐單抗遞送入兔眼，證明了此種方法的可行性。然而，盡管離子電滲療法可幫助獲得較高的眼內(nèi)藥物濃度，藥物的快速清除在一定程度上限制了其應(yīng)用。鑒于此，有研究者提出了基于納米載體的離子電滲療法，以實(shí)現(xiàn)持續(xù)的藥物遞送并維持藥物濃度[38]。此外，低頻超聲導(dǎo)入等物理手段也可輔助大分子藥物跨鞏膜途徑到達(dá)兔眼后端[39]。

圖3 眼部離子電滲遞藥示意圖Figure 3 Iontophoresis for ocular drug delivery

5 基因的無創(chuàng)眼內(nèi)遞送

眼睛是基因治療的理想器官，對(duì)其進(jìn)行基因治療具有以下獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：在體內(nèi)相對(duì)獨(dú)立，體積較小，由于存在BRB而具有免疫豁免權(quán)；易于接觸，可采用不同的遞送方式靶向各種眼組織；治療后易于評(píng)估組織結(jié)構(gòu)和視力功能的恢復(fù)情況[40]。

眼部疾病的基因治療具有充分的病理學(xué)依據(jù)。包括萊伯先天性黑蒙癥（Leber's congenital amaurosis，LCA）、視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）在內(nèi)的多種視網(wǎng)膜疾病都與視網(wǎng)膜色素上皮層特定的基因突變有關(guān)，例如RPE65，bestrophin及LRAT等[40]。Luxturna是美國(guó)批準(zhǔn)的首個(gè)眼科基因治療藥物，用于治療雙等位RPE65基因突變導(dǎo)致的遺傳性視網(wǎng)膜疾病——Ⅱ型先天性黑蒙癥，于2017年12月上市，給藥途徑為視網(wǎng)膜下腔注射（見表1）。這種給藥方式可以將基因直接遞送到視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞，但是易引起視網(wǎng)膜出血甚至視網(wǎng)膜脫落等副作用[41]。此外，也有研究者嘗試采用基因療法治療青光眼、ARMD等神經(jīng)退行性眼科疾病[42-43]。

由于裸露的核酸分子具親水特性，尺寸較大且?guī)ж?fù)電荷，因此很難有效地跨越細(xì)胞膜。為解決這一難題，研究者們開發(fā)了多種遞藥系統(tǒng)以確?；蜻M(jìn)入至靶細(xì)胞內(nèi)。病毒載體雖具有轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)勢(shì)，但潛在的免疫原性及染色體毒性限制了其臨床應(yīng)用[44]。目前研究者致力于開發(fā)安全性更佳、更易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的非病毒載體，但其基因轉(zhuǎn)染效率較病毒載體偏低，在遞送系統(tǒng)中引入細(xì)胞穿膜肽可進(jìn)一步解決此問題。

5.1 陽離子脂質(zhì)體載體

陽離子脂質(zhì)體可與帶負(fù)電的基因通過靜電相互作用結(jié)合，保護(hù)其不被體內(nèi)的核酸酶降解，并增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)基因遞送。Puras等[45]采用乳化溶劑揮發(fā)法制備質(zhì)粒DNA（pCMS-EGFP）陽離子脂質(zhì)體。與Lipofectamine 2 000組相比，該脂質(zhì)體主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，可更高效轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞且細(xì)胞毒性更低。另有研究者采用RGD肽修飾的脂質(zhì)體包載小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其在RPE細(xì)胞中具有更高的遞送效率，且通過整合素受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[46]。

粒徑是影響脂質(zhì)體眼內(nèi)分布的重要因素。Lajunen等[47]采用微射流方法制備了包載質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)體，并將轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾于陽離子脂質(zhì)體表面，通過調(diào)整該脂質(zhì)體粒徑，經(jīng)滴眼給藥后可有效滲透眼部吸收屏障并靶向視網(wǎng)膜色素上皮層。眼內(nèi)分布結(jié)果顯示，粒徑小于80 nm的脂質(zhì)體可滲透至視網(wǎng)膜色素上皮層，而粒徑大于100 nm的脂質(zhì)體多分布于脈絡(luò)膜內(nèi)皮層。適宜粒徑的配體修飾脂質(zhì)體有潛力成為通過滴眼給藥治療視網(wǎng)膜疾病的基因載體。

陽離子脂質(zhì)體可借助不同內(nèi)吞途徑增強(qiáng)包載基因的入胞效率，經(jīng)修飾后還可增加其滲透屏障的能力。但是陽離子脂質(zhì)體的缺點(diǎn)在于其潛在的視網(wǎng)膜毒性及可能干擾視力等副作用[48]。目前采用陽離子脂質(zhì)體作為非病毒基因載體治療視網(wǎng)膜疾病的研究較少。

5.2 聚合物載體

一些陽離子聚合物可通過靜電相互作用及疏水作用與DNA結(jié)合，與陽離子脂質(zhì)體相比，其形成的復(fù)合物粒徑更小，更有利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染[49]。天然聚合物和合成聚合物都被大量研究用作基因遞送載體，其中一些載體可有效實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)眼內(nèi)基因遞送。

5.2.1 天然聚合物載體在天然聚合物中，殼聚糖及其衍生物因細(xì)胞毒性低、無免疫原性、生物相容性好且可生物降解，成為最常見的非病毒基因載體。殼聚糖具有黏膜黏附特性，可與黏膜上皮相互作用，延長(zhǎng)制劑在眼表的滯留時(shí)間。此外，殼聚糖還可打開細(xì)胞間緊密連接，促進(jìn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。但殼聚糖也存在一些局限性，如在生理pH條件下溶解度低、體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低等[40-50]。優(yōu)化殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量或與其他材料聯(lián)用可提高基因的轉(zhuǎn)染效率。Klausner等[51]比較了相對(duì)分子質(zhì)量為5 700，7 300，340 000的殼聚糖向角膜遞送基因的能力，結(jié)果顯示較低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖與DNA形成的復(fù)合物更容易解離，采用相對(duì)分子質(zhì)量為5 700的殼聚糖制備的納米粒具有最高的大鼠角膜轉(zhuǎn)染效率。天然聚合物透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）也具有可生物降解、生物相容性好、無毒、無免疫原性等特點(diǎn)。其大量存在于細(xì)胞外基質(zhì)及眼內(nèi)玻璃體液中，具有黏彈性，是眼科制劑的理想載體。此外，透明質(zhì)酸可與表達(dá)于人角膜和結(jié)膜上的受體CD44特異性結(jié)合[52]。CD44參與受體介導(dǎo)內(nèi)吞過程，可促進(jìn)采用HA作為載體的制劑向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。HA-CD44相互作用可啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染[53]。de la Fuente等[54]采用殼聚糖和透明質(zhì)酸共同構(gòu)建納米基因載體。與裸質(zhì)粒DNA相比，滴眼給藥后制劑組展現(xiàn)了更強(qiáng)的體內(nèi)角膜轉(zhuǎn)染能力及較長(zhǎng)時(shí)間的基因表達(dá)[53-54]。

明膠具有良好的親水性，是常見的天然聚合物載體。MUC5AC蛋白表達(dá)的改變與干眼病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。有研究者選擇明膠作為非病毒基因載體，將編碼MUC5AC蛋白的質(zhì)粒包載在陽離子明膠納米粒中。實(shí)驗(yàn)性干眼癥小鼠經(jīng)滴眼給藥治療后，其角膜和結(jié)膜中MUC5AC蛋白的表達(dá)量及淚液分泌量都顯著提高，炎性細(xì)胞因子TNF-α及趨化因子干擾素誘生蛋白10（interferon-inducible protein-10，IP-10）等的表達(dá)顯著降低，且小鼠未出現(xiàn)眼部刺激或水腫[55]。

5.2.2 合成聚合物載體樹枝狀高分子聚酰胺-胺（polyamindoamine，PAMAM）同樣可以通過靜電相互作用與基因結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，可作為基因遞送的有效載體。較高代數(shù)PAMAM的細(xì)胞內(nèi)吞能力較強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率較高，其中PAMAM G4和PAMAM G5通常被用作眼科藥物遞送載體[56-57]。如Mastorakos等[58]設(shè)計(jì)了氨基功能化的端羥基PAMAM樹枝狀聚合物（PAMAM G4）來有效壓縮DNA，并采用曲安奈德作為核定位增強(qiáng)子以實(shí)現(xiàn)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，同時(shí)摻入聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化樹枝狀大分子進(jìn)一步保護(hù)基因載體，提高制劑的穩(wěn)定性。但是較高的轉(zhuǎn)染效率常伴隨著細(xì)胞毒性。Liu等[59]則選擇較低代數(shù)的PAMAM G3，并聯(lián)合采用細(xì)胞穿膜肽penetratin共同壓縮質(zhì)粒DNA，在保證制劑對(duì)眼部組織毒性較低，同時(shí)利用細(xì)胞穿膜肽的高效穿膜能力進(jìn)一步增強(qiáng)基因載體的轉(zhuǎn)染效率，促進(jìn)其向眼底轉(zhuǎn)運(yùn)。該復(fù)合物經(jīng)大鼠結(jié)膜囊滴入給藥，10 min后質(zhì)粒即可分布于眼后段視網(wǎng)膜組織，且可滯留8 h以上。值得一提的是，在該基因載體的幫助下，質(zhì)粒可分布于視網(wǎng)膜，但是在角膜卻幾乎未見分布，提示該復(fù)合物可能通過非角膜途徑，即鞏膜途徑進(jìn)入眼內(nèi)。

PEG多被用于與陽離子脂質(zhì)體[47]或PAMAM聚合物[58]等共同構(gòu)建基因遞送載體，可起到穩(wěn)定復(fù)合物的作用，避免因鹽類、蛋白質(zhì)、補(bǔ)體誘導(dǎo)等因素而失活。Jiang等[60]設(shè)計(jì)了一種柔性多價(jià)penetratin（8VP）作為基因載體，壓縮siRNA并促進(jìn)其眼內(nèi)遞送。該基因載體以多臂PEG作為核心，末端加以penetratin修飾。8VP/siRNA可以完整復(fù)合物的形式穿過體外血-視網(wǎng)膜屏障模型，其體外轉(zhuǎn)染效率可達(dá)75%，經(jīng)滴眼給藥10 min后siRNA即可迅速分布到視網(wǎng)膜，且6 h后仍有滯留。荷眼內(nèi)腫瘤的小鼠連續(xù)15 d采用8VP/siRNA滴眼給藥，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)被顯著抑制，且對(duì)眼前段角膜組織幾乎無毒性作用；而陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物滴眼給藥組對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)幾乎無抑制效果，眼部生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與生理鹽水組沒有顯著性差異[60]。該研究實(shí)現(xiàn)了基因的無創(chuàng)眼后段遞送，為眼內(nèi)相關(guān)疾病的基因治療提供了新方案。

此外，聚乙烯亞胺（polyetherimide，PEI）有強(qiáng)大的DNA壓縮能力且具有pH緩沖特性，可實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染，是研究最多的合成聚合物載體之一[61]；但因其潛在的細(xì)胞毒性，應(yīng)用于無創(chuàng)眼部基因遞送的研究較少。

5.3 物理手段介導(dǎo)基因遞送

除利用天然或合成聚合物載體外，超聲等物理學(xué)手段也可提高基因的轉(zhuǎn)染效率。近年來，將超聲微泡造影劑（ultrasound contrast agent，UCA）應(yīng)用于眼部基因遞送獲得了廣泛關(guān)注。UCA在聲場(chǎng)內(nèi)破裂后產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)可使細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞間隙變大，短暫打開血-視網(wǎng)膜屏障，為藥物的視網(wǎng)膜遞送提供一種無創(chuàng)的替代療法。Park等[62]的研究發(fā)現(xiàn)在超聲停止3 h后，被打開的BRB會(huì)重新恢復(fù)。Xu等[63]利用UCA成功將內(nèi)皮抑素-綠色熒光蛋白（endostatin-green fluorescent protein，ES-GFP）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞。

6 總結(jié)與展望

各種眼部疾病不僅影響患者的生活質(zhì)量甚至可能導(dǎo)致失明，同時(shí)也給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)與醫(yī)療負(fù)擔(dān)。隨著人口日趨老齡化，ARMD等年齡相關(guān)性眼科疾病的患病人數(shù)將進(jìn)一步增加。藥劑學(xué)領(lǐng)域的研究者一直致力于開發(fā)新型的眼部藥物遞送系統(tǒng)，以期通過患者更易接受的滴眼給藥方式將生物大分子藥物遞送入眼內(nèi)，特別是眼后段病灶部位，以消除侵入性眼內(nèi)注射帶來的風(fēng)險(xiǎn)。目前大量的研究采用膠束、脂質(zhì)體、細(xì)胞穿膜肽作為載體實(shí)現(xiàn)了生物大分子藥物的無創(chuàng)眼內(nèi)遞送，在動(dòng)物眼科疾病模型上取得了較為理想的效果，有望成為眼內(nèi)注射抗VEGF藥物或基因藥物的替代療法。

設(shè)計(jì)生物大分子藥物的無創(chuàng)眼內(nèi)遞送系統(tǒng)必須兼顧安全性與有效性，以及制劑的臨床轉(zhuǎn)化前景，這為藥物載體的遞送效率、生物相容性、生物降解性以及制備工藝可行性提出了更高的要求。目前，各載體攜帶生物大分子藥物進(jìn)入眼內(nèi)的具體途徑及機(jī)制尚無定論，仍需研究者深入探索，且制劑的穩(wěn)定性及遞送效率仍有待進(jìn)一步提高。此外，還需要構(gòu)建與人類眼科疾病更為接近的動(dòng)物模型，并進(jìn)一步完善治療效果評(píng)價(jià)手段，以便更好地預(yù)測(cè)遞送載體的安全性與有效性。在臨床需求的促動(dòng)下，相信在不久的將來可實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)給藥治療眼底疾病的目標(biāo)。