宏基因二代測(cè)序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應(yīng)用

上官麗娟，王海龍，尚 晶，王智軍，侯苗苗，薛嵐平

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病病原體復(fù)雜，病程進(jìn)展兇險(xiǎn)，如何更快、更準(zhǔn)明確病原體一直是診斷難點(diǎn)。傳統(tǒng)診斷方法中，腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性率低，PCR技術(shù)在無(wú)特定提示情況下，難以發(fā)揮作用。近年來(lái)，宏基因組二代測(cè)序技術(shù)逐漸發(fā)展，2014年國(guó)際上報(bào)告了首例使用mNGS診斷神經(jīng)感染的病例。我國(guó)自2015年開始出現(xiàn)相關(guān)研究的報(bào)道。該技術(shù)具有無(wú)需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理及無(wú)偏倚測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)標(biāo)本中所有的病原體核酸進(jìn)行檢測(cè)，在臨床中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注，尤其是對(duì)一些病因不明的患者。但由于mNGS檢測(cè)流程復(fù)雜，涉及環(huán)節(jié)多，結(jié)果解讀尚缺乏統(tǒng)一規(guī)范，檢測(cè)結(jié)果易受多種因素影響，易出現(xiàn)與最終診斷不符的情況。本研究基于mNGS對(duì)常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢出情況的分析，結(jié)合臨床，探討mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2019-01至2021-12山西省白求恩醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者85例為研究對(duì)象。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《神經(jīng)內(nèi)科疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)》。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在腦膜炎、腦炎或腦脊髓膜炎臨床表現(xiàn)或體征；(2)腦脊液性狀提示炎性反應(yīng)；(3)完成mNGS和相關(guān)傳統(tǒng)檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)拒絕腰穿或存在腰穿禁忌證；(2)腫瘤、自身免疫性腦炎、風(fēng)濕免疫性疾病患者；(3)妊娠；(4)其他不適宜入組的情況。本研究通過(guò)山西白求恩醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵從赫爾辛基宣言，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料來(lái)源 回顧研究對(duì)象的臨床資料，建立格式化信息采集表，采集患者的一般資料、臨床特征、傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果、mNGS檢測(cè)結(jié)果及預(yù)后轉(zhuǎn)歸信息，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)化處理。

1.2.2 樣本采集與檢測(cè) 入選患者均行腰穿檢查，遵循腰椎穿刺標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)范，除留取腦脊液常規(guī)、生化、涂片、培養(yǎng)及相關(guān)抗體檢測(cè)等項(xiàng)目外，另留取2～3 ml 腦脊液樣本，保存在無(wú)菌管中密封，-20 ℃儲(chǔ)存并干冰運(yùn)輸至華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)公司行mNGS檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。同時(shí)留取患者的全血，由本單位中心實(shí)驗(yàn)室完成血清特異性抗體檢測(cè)和(或)血培養(yǎng)。

1.2.3 mNGS判讀與質(zhì)控 測(cè)序深度20 M，陽(yáng)性：覆蓋正常，(1) 病毒：檢出序列數(shù)覆蓋到病毒參考基因組上≥3個(gè)不重疊的區(qū)域，則報(bào)告檢出該病毒；(2)對(duì)于細(xì)菌、真菌和寄生蟲，考慮微生物基因組大小的不同，首先將檢測(cè)到的序列標(biāo)準(zhǔn)化為每兆數(shù)據(jù)量檢測(cè)到的序列(reads per million, RPM)，然后計(jì)算臨床標(biāo)本和陰性質(zhì)控(NTC)的RPM的比值(RPM-r)。當(dāng)RPM-r≥10，則報(bào)告檢出該病原體，否則報(bào)告沒(méi)有檢出。

1.2.4 相關(guān)定義 最終診斷為出院診斷或死亡診斷，結(jié)合臨床擬診、傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)、輔助檢查(包括腰椎穿刺腦脊液常規(guī)檢測(cè)、頭部影像學(xué)檢查和腦電圖檢查等)結(jié)果綜合判斷。傳統(tǒng)方法為腦脊液涂片、腦脊液培養(yǎng)、PCR、相關(guān)抗體檢測(cè)及血培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測(cè)及典型頭部影像學(xué)表現(xiàn)。以最終診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。準(zhǔn)確率計(jì)算公式為mNGS陽(yáng)性病例與最終診斷相符患者例數(shù)占總納入例數(shù)的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，兩組準(zhǔn)確率的比較采用率的檢驗(yàn)，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 85例中，男44例，女41例，年齡14～77歲，平均(43.04±16.86)歲。臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、意識(shí)障礙及精神行為異常，顱腦影像多提示腦膜受累或腦脊髓組織受累(12/85)。74例病情好轉(zhuǎn)，10例預(yù)后較差或死亡，1例二次復(fù)發(fā)。11例預(yù)后不良患者中5例檢測(cè)時(shí)間存在延誤，2例無(wú)法明確病原體，2例病毒感染后合并周圍神經(jīng)損害，1例病毒感染后繼發(fā)自身免疫性腦炎。

2.2 mNGS病原體檢出情況 85例患者中共檢出21種病原體，部分病原體最終判讀為與臨床情況不符，分別為3例金黃色葡萄球菌、1例EBV、1例庚型肝炎病毒、1例水痘帶狀皰疹病毒、1例銅綠假單胞桿菌、1例弗氏檸檬酸桿菌及1例提蒙普雷沃菌，其余檢出結(jié)果與最終診斷相符。檢出情況見圖1。

紅色代表檢出結(jié)果與最終診斷不符，藍(lán)色代表檢出結(jié)果與最終診斷相符

2.3 mNGS與傳統(tǒng)方法檢測(cè)病原的比較 85例中，mNGS檢出陽(yáng)性57例，其中與最終診斷符合48例，不符合9例；傳統(tǒng)方法檢出陽(yáng)性23例，其中與最終診斷符合22例，不符合1例。兩種方法準(zhǔn)確率分別為56.5% (48/85)及25.9%(22/85)，兩種方法準(zhǔn)確率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=16.42，<0.001)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者mNGS與傳統(tǒng)診斷方法的檢出結(jié)果見表1。

進(jìn)一步亞組分析，細(xì)菌組27例，mNGS檢出陽(yáng)性20例，其中與最終診斷符合19例，不符合1例，準(zhǔn)確率70.4%；傳統(tǒng)方法檢出陽(yáng)性8例，其中與最終診斷符合7例，不符合1例，準(zhǔn)確率25.9%。病毒組36例，mNGS檢出陽(yáng)性22例，與最終診斷符合17例，不符合5例，準(zhǔn)確率47.2%；傳統(tǒng)方法檢出陽(yáng)性6例，均與最終診斷相符，準(zhǔn)確率16.7%。結(jié)核組20例，mNGS檢出陽(yáng)性13例，其中與最終診斷符合10例，不符合3例，準(zhǔn)確率為50.0%；傳統(tǒng)方法檢出陽(yáng)性7例，均與最終診斷相符，準(zhǔn)確率35.0%。因梅毒螺旋體及真菌感染各1例，歸為其他組，不做分析。在前3個(gè)亞組中，結(jié)核組兩種方法準(zhǔn)確率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，細(xì)菌和病毒感染組準(zhǔn)確率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)常見急危重癥，及早診斷、盡快治療的關(guān)鍵在于快速確定病原體。傳統(tǒng)診斷模式首先依賴患者的病史、查體和影像學(xué)特點(diǎn)確定擬診病原體，然后進(jìn)行腦脊液常規(guī)、生化、涂片、PCR、腦脊液培養(yǎng)及血培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測(cè)，單一傳統(tǒng)檢測(cè)方法準(zhǔn)確率低，可檢病原體有限，聯(lián)合檢測(cè)操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，容易延誤治療。而mNGS因其無(wú)偏倚測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)標(biāo)本中所有的病原體核酸進(jìn)行檢測(cè)，能更好地提高準(zhǔn)確率，同時(shí)保證時(shí)效性。本研究中85例患者mNGS檢出致病病原體的比例為56.5%，傳統(tǒng)方法為25.9%，mNGS優(yōu)于傳統(tǒng)方法，準(zhǔn)確率與我國(guó)《中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的腦脊液宏基因組學(xué)第二代測(cè)序應(yīng)用專家共識(shí)》中提到的準(zhǔn)確率接近。具體到每一例陽(yáng)性患者致病病原體檢出方面，mNGS單獨(dú)檢出31例，傳統(tǒng)方法單獨(dú)檢出5例，兩者共同檢出17例。mNGS病原體檢出能力優(yōu)于傳統(tǒng)方法，提示對(duì)疑似感染而傳統(tǒng)方法無(wú)法明確病原體的患者，可將mNGS作為傳統(tǒng)方法的有利補(bǔ)充手段。

進(jìn)一步亞組分析，在細(xì)菌感染組中，mNGS較傳統(tǒng)方法的優(yōu)越性尤為突出，傳統(tǒng)方法無(wú)單獨(dú)檢出病例，mNGS額外檢出了11例，其中9例前期已接受經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療。既往研究表明，病原體培養(yǎng)容易受到抗菌治療的影響，抗生素治療后患者腦脊液培養(yǎng)準(zhǔn)確率可降至9%～11%，而高通量測(cè)序只需要識(shí)別微生物微量的DNA片段，抗生素治療后病原體仍有較高的準(zhǔn)確率。該文進(jìn)一步指出，當(dāng)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療超過(guò)4 d后，mNGS的準(zhǔn)確率也會(huì)受影響。本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS補(bǔ)充傳統(tǒng)方法同樣適用于病毒感染患者。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌等胞內(nèi)菌感染，現(xiàn)有檢測(cè)手段有限，在傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，是否需要長(zhǎng)時(shí)間抗結(jié)核治療，經(jīng)常是臨床醫(yī)師十分困惑的問(wèn)題，本文結(jié)核組患者因例數(shù)較少，mNGS檢測(cè)準(zhǔn)確率較傳統(tǒng)方法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是準(zhǔn)確率已顯示一定趨勢(shì)，提示未來(lái)mNGS或可為結(jié)核桿菌的檢出提供一定的技術(shù)支撐，本研究3例結(jié)核患者通過(guò)mNGS檢測(cè)得以確診，調(diào)整治療方案后預(yù)后良好。

本研究mNGS與傳統(tǒng)方法同時(shí)陽(yáng)性的比例為20.0%，較共識(shí)偏低，這可能與傳統(tǒng)方法陽(yáng)性率偏低及傳統(tǒng)方法不夠深入全面有關(guān)。本研究mNGS檢測(cè)結(jié)果中有9例判讀為與最終診斷不符，涵蓋了EBV、庚型肝炎病毒等病原菌，其中金黃色葡萄球菌3例。關(guān)于EBV感染，F(xiàn)an等指出EBV多數(shù)情況下不是致病病原體，對(duì)陽(yáng)性結(jié)果判讀應(yīng)慎重，中國(guó)專家共識(shí)及Xing團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提出部分DNA病毒可在CNS中潛伏，判讀應(yīng)結(jié)合臨床。不符結(jié)果中最多見的為銅綠假單胞桿菌及金黃色葡萄球菌，Xing等指出細(xì)菌性腦膜炎常見病原體(如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等)可能是非細(xì)菌性腦膜炎患者的mNGS假陽(yáng)性，而許多類似報(bào)道亦表明對(duì)于檢出病原體為疑似背景污染或醫(yī)院環(huán)境中廣泛存在的微生物時(shí)，判讀結(jié)果要慎重。本研究mNGS未檢出病原體的比例為43.6%，病毒及結(jié)核感染組的檢出比例較整體更低。有研究指出由于RNA檢測(cè)的缺失，mNGS不能顯著預(yù)測(cè)病毒性腦炎和/或腦膜炎，必須改進(jìn)DNA/RNA共提取方法，以提高其準(zhǔn)確率。對(duì)結(jié)核等胞內(nèi)菌感染患者，目前mNGS主要采用腦脊液上清進(jìn)行檢測(cè)，而胞內(nèi)菌破壁相對(duì)困難，因此檢測(cè)時(shí)很可能遺漏部分胞內(nèi)感染的核酸信息，導(dǎo)致準(zhǔn)確率低。此外，若宿主對(duì)病原體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)烈，腦脊液樣本中白細(xì)胞計(jì)數(shù)增多，促使樣本中人源核酸比例升高，從而降低病原體的檢出，亦會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為陰性。綜上，目前檢測(cè)結(jié)果為陰性可能與核酸提取方法相對(duì)簡(jiǎn)單、胞內(nèi)菌檢測(cè)時(shí)破壁受限核酸信息釋放不充分以及宿主免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)干擾病原體核酸信息提取等因素有關(guān)。

總之, mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病病原體診斷方面的優(yōu)越性十分突出，下一步臨床應(yīng)用中我們應(yīng)多積累經(jīng)驗(yàn)，不斷優(yōu)化mNGS的使用。當(dāng)然，本研究為單中心研究，每一類病原體例數(shù)相對(duì)較少，尤其是關(guān)于真菌及梅毒螺旋體方面的研究，后續(xù)將不斷擴(kuò)大樣本，進(jìn)一步分類研究。另外，因本研究按入排標(biāo)準(zhǔn)，篩除了部分非中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者，欠缺對(duì)mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者診斷效能的深入驗(yàn)證。后期我們將納入所有進(jìn)行mNGS的患者對(duì)此進(jìn)行探究。