固定酶底物法測定生活飲用水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌精密度分析

雷靜 廖爽 喬茜茜 呂警

摘???要：總大腸菌群目前作為評價水質的一項指標，是反映水樣是否受到糞便污染的指標。固定酶底物法是從美國引進的一種大腸桿菌新型檢測方法。該方法采用酶底物法測定生活飲用水中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌，分析了不同濃度水樣的精密度，低濃度水樣的精密度為，1.6%、2.0%;中濃度水樣的精密度為1.3%、1.8%;高濃度水樣的精密度為2.0%、4.3%;陽性標準菌株的精密度均為0.86%。

關鍵詞：酶底物法???總大腸菌群???大腸埃希氏菌???精密度

中圖分類號：R123???????????文獻標識碼：A???????????文章編號：1672-3791（2022）07（b）-0000-00

Precision?Analysis?of?Total?Coliform?group?and?Escherichia?Coli?in?Drinking?Water by?Enzyme?Substrate?Method

LEI?Jing1 LIAO?Shuang1??QIAO?Qianqian1 LYU?Jing2*

（1.Xinjiang?Changyuan?Water?Science?Research?Institute?Co.?Ltd.;2.Quality?and?Safety?Testing?Center?of?Urumqi?Agricultural?Products，?Urumqi，?XinJiang?Uygur?Autonomous?Region，?830000?China）

Abstract：?Total?coliform?group?is?currently?used?as?an?index?to?evaluate?water?quality，?which?is?an?indicator?of?whether?the?water?sample?is?contaminated?by?feces.?Enzyme?substrate?method?is?a?new?detection?technology.?This?method?uses?enzyme?substrate?method?to?determine?the?total?coliform?group?and?Escherichia?coli?in?drinking?water，?and?analyzes?the?precision?of?different?concentrations?of?water?samples.?The?precision?of?low?concentration?of?water?samples?is?1.6%?and?2.0%.?The?precision?of?medium?concentration?water?sample?was?1.3%?and?1.8%.?The?precision?of?high?concentration?water?sample?was?2.0%?and?4.3%.The?precision?of?positive?standard?strains?was?0.86%.

Key?Words：?Enzyme?substrate?method;?Total?coliform;?Escherichia?coli;?Precision

微生物常規(guī)檢測指標為總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌。它們均可作為檢驗腸道致病菌的指示菌，是進行衛(wèi)生學評價的重要內(nèi)容?？偞竽c菌群是指一群在37?℃培養(yǎng)24?h，能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1]?？偞竽c菌群目前作為評價水質的一項指標，是反映水樣是否受到糞便污染的指標[2]。生活飲用水中針對大腸菌群、大腸埃希菌等的檢測技術主要包括乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法、濾膜法、固體酶底物法[3]?，其中多管發(fā)酵法為仲裁法[4]。固定酶底物法[5]是從美國引進我國的一種大腸桿菌檢測方法，此方法簡單、方便、快速、無培養(yǎng)基的制作與干擾等優(yōu)點[6]。目前被美國、歐洲及大部分亞洲國家廣泛應用于水中總大腸菌群、糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）及大腸埃希氏菌的檢測。并通過美國EPA、《水與廢水標準檢測方法》以及我國《生活飲用水標準檢驗方法》認證[7]。

1????實驗部分

1.1??材料與試劑

1.1.1試劑

在該實驗中酶底物法所用酶底物法檢測試劑?MMO-MUG培養(yǎng)基，無菌定量瓶（帶100?mL刻度），51孔定量檢測盤均購買于西安立科環(huán)?？萍加邢薰?。

1.1.2儀器設備

隔水式恒溫培養(yǎng)箱型號：GHP-9270，高壓蒸汽滅菌器型號：LDZX-50KBS，程控定量封口機型號：LK-2010，手提式暗箱紫外分析儀型號：ZK-5。

1.1.3??標準菌株

陽性標準菌株：大腸埃希菌菌種號CMCC（B）44102?來源：南京便診生物科技有限公司;陰性標準菌株：銅綠假單胞菌菌種號CICC?21636來源：中國工業(yè)菌種保藏中心。

1.2???試驗方法

用無菌定量瓶量取100?mL水樣（或稀釋后水樣），將2.?7?g?M?M?O-M?U?G培養(yǎng)基加入待測水樣中，使其完全溶解，混合均勻，然后將100?mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內(nèi)，用手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，用程控定量封口機封口，放入（37±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h（如顯色不明顯可延長至28?h）。將培養(yǎng)24?h后的定量盤取出觀察，如孔格內(nèi)水樣變黃則說明該孔內(nèi)含有大腸菌群，將培養(yǎng)24?h后的定量盤放置于波長366?nm?紫外光下照射，有熒光的孔格說明該孔內(nèi)含有大腸埃希氏菌。最后計算變黃或變黃且有熒光的孔數(shù)對照酶底物法51孔最可能數(shù)（MPN）表，查出其代表的總大腸菌群或大腸埃希氏菌最可能數(shù)[8]。

2???結果與分析

2.1低濃度水樣檢測結果

如表2所示，通過預試驗選擇的中濃度水樣進行了6次平行檢測，樣品稀釋10倍，總大腸菌群、大腸埃希氏菌平行檢測結果有了一些差異，精密度分別為1.3%、1.8%。

2.3??高濃度水樣檢測結果

如表3所示，通過預試驗選擇的高濃度水樣進行了6次平行檢測，樣品稀釋10?000倍，總大腸菌群、大腸埃希氏菌平行檢測結果差異比低濃度和中濃度要大，精密度分別為2.0%、4.3%。

2.4陽性標準菌株菌懸液檢測結果

如表4所示，將已復活復壯的陽性標準菌株配制成1麥氏比濁度的菌懸液，細菌約為3×108?cfu/mL，再將菌懸液稀釋108倍再進6次平行行檢測。精密度均為0.86%，因為該實驗中所使用的陽性標準菌株為大腸埃希菌，可以作為總大腸菌群的陽性指示菌，故總大腸菌群、大腸埃希氏菌平行檢測結果一致，精密度也一致。

2.5?陰性及空白對照

陰性對照試驗參照陽性對照實驗檢測方法，經(jīng)24?h培養(yǎng)后，陰性對照的51孔定量盤樣品的顏色未發(fā)生變化，呈現(xiàn)陰性反應，該次樣品測定結果有效。測定總大腸菌群、大腸埃希氏菌空白時，用無菌水代替試樣參照陽性對照實驗檢測方法經(jīng)24?h培養(yǎng)后的?51?孔定量盤均無任何顏色反應，檢測結果滿足實驗要求。

3??結果與討論

該次實驗總大腸菌群精密度檢測結果為?1.3%≤RSD≤2.0%?;大腸埃希氏菌精密度檢測結果為?1.8%≤RSD≤4.3%。固定酶底物法操作方便，檢測時間、培養(yǎng)時間都較短，而且不需要確認試驗，能夠對水樣中的微生物污染情況進行準確檢測和判斷;能夠同時檢測大腸菌群和具有病原學意義的大腸埃希氏菌，特異性較高，靈敏高，可以很大程度降低實驗過程中引入的污染，避免了二次污染的發(fā)生，對實驗操作環(huán)境要求較低，不需要嚴格的無菌環(huán)境，對監(jiān)測人員技術能力要求降低。酶底物法很好地彌補了傳統(tǒng)檢測方法在檢測時間、靈敏度上的不足，可以很好地應用在生活飲用水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測，替代傳統(tǒng)方法成為微生物檢測的發(fā)展趨勢。

參考文獻

[4]?樓小平，林增飛.多管發(fā)酵法和酶底物法檢測總大腸菌群的結果差異性[J].凈水技術，2020，39（6）：14-17，37.

[5] 張曉華，高瑞紅，王驥濤，等.酶底物法檢測水中菌落總數(shù)的效果評價[J].山西醫(yī)藥雜志，2020，49（12）：1491-1492.

[6] 黃利美，黃錦婷，楊穎.酶底物法與多管發(fā)酵法檢測大腸菌群的方法探討[J].飲食保健，2018，5（1）：260.

[7]? 楊曉冉，朱超，張付海，等.固定酶底物法測定水中糞大腸菌群的優(yōu)點及影響因素[J].環(huán)境科學導刊，2017，36（5）：87-90.

[8] 羅勻.水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）兩種檢測方法的比較研究[J/OL].城市建設理論研究（電子版）：551-555[2013-06-15].https：//wenku.baidu.com/view/b6ad7bc019e8b8f67c1cb952？fr=xueshu.