不同沉水植物葉片附著細(xì)菌群落多樣性及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)差異*

昂正強(qiáng)，孫曉健，曹新益，周 淇，關(guān)保華，曾 巾

(1：中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008)(2：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)(3：河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，南京 210098)

沉水植物是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者，具有凈化水體、降低營(yíng)養(yǎng)鹽濃度等重要生態(tài)功能[1].葉片是沉水植物重要的器官，可以進(jìn)行光合作用，調(diào)節(jié)植物自身的資源和能量[2]；同時(shí)它們能提供一個(gè)較大面積的水-植物界面[3]，并在界面上形成生物膜，為細(xì)菌附著定殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微生態(tài)位，形成葉片附著細(xì)菌群落[4].葉片附著細(xì)菌數(shù)量眾多、種類豐富[3]，這些細(xì)菌能為沉水植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，部分細(xì)菌還能幫助植物抵抗病原體，對(duì)植物生長(zhǎng)和健康十分重要[5].同時(shí)，葉片附著細(xì)菌作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在促進(jìn)水體中有機(jī)物降解以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)過程中都發(fā)揮著重要作用[6].因此研究葉片附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，可以豐富人們對(duì)這種特殊生境下生物多樣性的認(rèn)識(shí)，對(duì)于保護(hù)水生植物健康、維護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境有深遠(yuǎn)意義[7].

有研究發(fā)現(xiàn)，葉片附著細(xì)菌群落和浮游細(xì)菌群落之間存在一些共有微生物[8].生活在周圍水域的浮游細(xì)菌一般被認(rèn)為是沉水植物葉片附著細(xì)菌的主要種子庫(kù)，對(duì)葉片附著細(xì)菌群落組成有重要影響[9]，沉水植物可以通過不同葉片上復(fù)雜的物理或生化特性來選擇宿主特異性的細(xì)菌群落[10].同樣，浮游細(xì)菌群落也會(huì)受到沉水植物的影響[11]，葉片附著細(xì)菌可能擴(kuò)散到浮游細(xì)菌群落中.同時(shí)，葉片附著細(xì)菌和周圍水體中浮游細(xì)菌群落也存在一些截然不同的細(xì)菌類群[12-13]，這表明細(xì)菌在兩種生境之間的擴(kuò)散或交換可能是有限的，物理屏障或宿主選擇性差異使得葉片附著細(xì)菌群落和浮游細(xì)菌群落之間產(chǎn)生分化[10].然而，目前的研究缺乏對(duì)這兩個(gè)相互影響的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能之間異同的理解.

影響植物葉片附著細(xì)菌群落的因素，過去通常用環(huán)境因素來解釋[14]，最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)宿主植物自身的生化特性對(duì)葉片附著細(xì)菌群落有重要影響.劉凱輝等[15]觀測(cè)金魚藻(Ceratophyllumdemersum)、伊樂藻(Elodeanuttallii)和菹草(Potamogetoncrispus)3種沉水植物葉片附著細(xì)菌的分布特征，發(fā)現(xiàn)不同植物種類通過葉表物理形態(tài)和結(jié)構(gòu)差異顯著影響葉片附著細(xì)菌群落.Cai等[16]對(duì)太湖不同地點(diǎn)的馬來眼子菜(Potamogetonmalaianus)葉片附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同取樣點(diǎn)馬來眼子菜附著細(xì)菌組成具有高度的相似性，推斷其也具有一定的宿主選擇作用.但這些研究大多集中于對(duì)沉水植物葉表附著細(xì)菌種類、密度、生物量等指標(biāo)的比較，目前對(duì)于不同植物宿主如何影響葉片附著細(xì)菌群落組成和多樣性以及細(xì)菌群落物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的研究仍然十分匱乏.

本研究選取苦草(Vallisnerianatans)、黑藻(Hydrillaverticillata)、穗狀狐尾藻(Myriophyllumspicatum)等典型沉水植物，在東太湖試驗(yàn)站構(gòu)建中尺度模擬實(shí)驗(yàn)體系，分別設(shè)置單物種體系(低植物物種多樣性)和多物種體系(高植物物種多樣性)，模擬不同植物多樣性配置和植物種類對(duì)水體浮游細(xì)菌和葉片附著細(xì)菌群落的影響，應(yīng)用高通量測(cè)序解析浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落差異.本研究旨在回答以下科學(xué)問題：(1)不同植物物種多樣性體系中，浮游細(xì)菌和植物葉片附著細(xì)菌群落的差異如何？(2)在高植物物種多樣性體系中，不同種類植物葉片附著細(xì)菌群落的差異如何？(3)不同植物葉片附著細(xì)菌物種共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中是否存在關(guān)鍵物種，關(guān)鍵物種是否不同？

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究所用苦草、黑藻、穗狀狐尾藻和微齒眼子菜(Potamogetonmaackianus)均采集于中國(guó)科學(xué)院太湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)研究站(31°2′0.75″N, 120°25′17.23″E)的不同圍隔體系.實(shí)驗(yàn)設(shè)置8個(gè)圍隔，分別為4個(gè)低植物多樣性處理和4個(gè)高植物物種多樣性處理.圍隔長(zhǎng)2 m、寬2 m，深1.6 m左右.圍隔采用防水PVC材料，底部插入沉積物中，上部高出水面.圍隔中混勻的沉積物理化性狀基本一致；實(shí)驗(yàn)用水來自與東太湖連通的池塘，經(jīng)孔徑1 mm的篩網(wǎng)過濾后用水泵打入圍隔中.體系中植物由人工均勻種植，初始種植植物株數(shù)相同.低植物物種多樣性處理只種植1種沉水植物苦草，高植物物種多樣性處理種植苦草、穗狀狐尾藻、微齒眼子菜、黑藻、金魚藻、輪藻(Charophyceae)、水盾草(Cabomba)和篦齒眼子菜(Potamogetonpectinatus)8種沉水植物.

1.2 樣品采集

2021年1月24日，于觀測(cè)站進(jìn)行樣品采集.使用采水器采集每個(gè)圍隔體系內(nèi)的水下約0.5～0.6 m處水樣，用滅菌的聚乙烯瓶迅速收集500 mL水樣.使用采草器在距水面0.6～0.9 m處采集每種植物的葉片，取中間綠色長(zhǎng)勢(shì)良好的部位進(jìn)行采集.在低植物多樣性處理圍隔體系內(nèi)采集苦草葉片樣品，在高植物物種多樣性處理圍隔體系中采集苦草、黑藻、穗狀狐尾藻和微齒眼子菜葉片樣品.每種植物采集6片葉片合并作為一個(gè)樣品，用無菌水沖洗3次后立即置于50 mL離心管中.將采集的樣品放置于4℃保溫箱內(nèi)冷藏，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室以備后續(xù)處理.

1.3 樣品預(yù)處理及理化指標(biāo)測(cè)定

將植物葉片放在含有35 mL PBS緩沖液(130 mmol/L NaCl，7 mmol/L Na2HPO4，3 mmol/L NaH2PO4，pH=7.0，0.02% Silwet L-77)的50 mL離心管中，漩渦振蕩5 min；用滅菌的鑷子將葉片移入另一個(gè)干凈的含35 mL PBS緩沖液的50 mL離心管中，漩渦振蕩5 min.將前兩步洗脫的PBS緩沖液通過0.2 μm的濾膜過濾(milipore，USA)[9]，所得濾膜用來提取DNA.

1.4 DNA提取和高通量測(cè)序

使用E.Z.N.A.? Water DNA試劑盒(Omega，USA)提取植物葉片附著細(xì)菌和浮游細(xì)菌的DNA.用NanoDrop ND2000(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，并通過0.8%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察[19].

采用正向引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增體系(20 μL：0.4 μL FastPfu聚合酶、0.8 μL正向引物(5 μmol/L)、0.8 μL反向引物(5 μmol/L)、4 μL 5×Fast Pfu 緩沖液、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)和10 ng模板DNA).反應(yīng)條件為95℃ 2 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，10℃終止反應(yīng)[20].用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，并用Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))進(jìn)行純化.利用Qubit?3.0(Life Invitrogen)對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，利用Illumina公司的MiSeq-PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，由廣東美格基因科技有限公司完成.

使用Trimmomatic(v.0.33)[21]對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控.使用FLASH(v.1.2.11)[22]軟件進(jìn)行拼接.使用USEARCH軟件(v.4.2.52)[23]根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit)聚類，并在聚類的過程中使用帶有denovo策略的UCHIME算法[24]去除單一序列和嵌合體.應(yīng)用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目(RDP)分類器基于SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)(1.32版本)檢索每個(gè)OTU的分類信息[25]，以80%的閾值確定OTU的分類學(xué)屬性[26].

1.5 網(wǎng)絡(luò)分析

在本研究中，基于Sparse correlations for compositional data(SparCC)(https://bitbucket.org/yonatanf/sparcc)方法分析OTU兩兩之間的關(guān)系，選擇相對(duì)豐度 > 0.02%以及在1/2以上樣本中存在的OTU進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取標(biāo)準(zhǔn)為強(qiáng)相關(guān)性(SparCC|r|> 0.60)和統(tǒng)計(jì)顯著性(P< 0.01)[27-28].同時(shí)將環(huán)境變量整合到網(wǎng)絡(luò)分析中，以揭示節(jié)點(diǎn)和環(huán)境變量之間的關(guān)系.通過Cytoscape(v3.6.1)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的可視化.計(jì)算Zi(模塊內(nèi)連通性)和Pi(模塊間連通性)，以顯示網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)渥饔?區(qū)分網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的4個(gè)子類別的標(biāo)準(zhǔn)：外圍節(jié)點(diǎn)(Zi≤ 2.5，Pi≤ 0.62)，連接點(diǎn)(Zi≤ 2.5，Pi≥ 0.62)，模塊核心(Zi≥ 2.5，Pi≤ 0.62)和網(wǎng)絡(luò)核心(Zi≥ 2.5，Pi≥ 0.62).

基于高植物物種多樣性體系中4種植物，分別與水體構(gòu)建了4個(gè)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò).使用R(v3.6.1)中的“igraph”包(v1.2.4.1)計(jì)算模塊化指數(shù)、平均度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù).模塊化網(wǎng)絡(luò)通常由不同的模塊組成，網(wǎng)絡(luò)中的模塊是一組互相連接度高的節(jié)點(diǎn)，它們與其它模塊中的節(jié)點(diǎn)連接較少；網(wǎng)絡(luò)模塊化指數(shù)旨在衡量網(wǎng)絡(luò)劃分為模塊的程度[29-30].模塊化指數(shù)>0.4表示網(wǎng)絡(luò)達(dá)到了一定的模塊化程度，具有模塊性.平均度也稱為平均連通性，描述網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的平均連接邊數(shù)，可以指示網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度[31].此外，使用R中的“igraph”包[32]生成了1000個(gè)隨機(jī)Erd?s-Rényi網(wǎng)絡(luò)，其節(jié)點(diǎn)和邊數(shù)與觀察網(wǎng)絡(luò)相同，并計(jì)算它們的拓?fù)鋮?shù).在R軟件中使用Z-test測(cè)試觀察網(wǎng)絡(luò)和隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)之間拓?fù)涮卣鞯牟町怺33].

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果通過生物信息學(xué)軟件QIIME、Mothur及統(tǒng)計(jì)軟件R等處理分析[34-35].使用QIIME腳本“alpha_diversity.py”命令[36]計(jì)算OTU豐富度、系統(tǒng)發(fā)育多樣性.使用QIIME腳本“beta_diversity.py”命令[36]進(jìn)行β多樣性分析.水體理化指標(biāo)、α多樣性、β多樣性箱型圖和分類學(xué)信息圖繪圖使用GraphPad Prism 8完成.同時(shí)在SPSS(v.20.0)中使用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)每組數(shù)據(jù)之間差異的顯著性.使用非度量多維尺度分析(NMDS)對(duì)不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可視化，并使用R軟件的“vegan”包[36]進(jìn)行相似性分析(ANOSIM)，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同生境(植物、水體)間的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 水體理化指標(biāo)

圖1 植物種植體系水體理化因子(每種處理設(shè)置4個(gè)重復(fù).L-w:低植物物種多樣性圍隔水體；H-w:高植物物種多樣性圍隔水體.箱型圖上不同小寫字母表示不同物種多樣性體系水體環(huán)境因子之間差異顯著.獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)，P<0.05)

2.2 水體浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落α多樣性及群落組成差異

從8個(gè)圍隔的28個(gè)葉片樣品中共獲得了7903583條有效16S rRNA基因序列和11168個(gè)OTU.α多樣性分析顯示，浮游細(xì)菌群落OTU豐度和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)多樣性顯著低于植物葉片附著細(xì)菌群落(P<0.05)(圖2).高植物多樣性體系中的浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落α多樣性稍高于低植物多樣性體系但不顯著(P> 0.05)(圖2A, B).高植物多樣性體系中黑藻葉片附著細(xì)菌群落α多樣性顯著高于其它植物(P<0.05)，苦草和穗狀狐尾藻葉片附著細(xì)菌群落α多樣性較低(圖2C, D).

圖2 不同植物物種多樣性體系中浮游細(xì)菌和植物葉片附著細(xì)菌群落α多樣性(每組樣品有4個(gè)重復(fù).L:低植物物種多樣性；H:高植物物種多樣性；w:水體；kc:苦草；hwz:穗狀狐尾藻；yzc:微齒眼子菜；hz:黑藻.箱型圖上不同的小寫字母表示顯著差異.單因素ANOVA分析，P < 0.05)

在門分類水平上，浮游細(xì)菌群落和苦草葉片附著細(xì)菌群落的物種組成不同(圖3A)，不同種類沉水植物葉片附著細(xì)菌群落組成也存在一定差異(圖3B).α-變形菌綱(α-proteobacteria，20.35%)、β-變形菌綱(β-proteobacteria，30.59%)、γ-變形菌綱(γ-proteobacteria，11.91%)和擬桿菌門(16.51%)是苦草葉片附著細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(綱).相比之下，浮游細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(綱)是擬桿菌門(29.55%)和β變形菌綱(35.86%)(圖3).細(xì)菌群落相對(duì)豐度top5 OTU表顯示，植物葉片附著細(xì)菌群落相對(duì)豐度top5 OTU有3個(gè)是α-變形菌綱，而浮游細(xì)菌群落相對(duì)豐度的top5 OTU有5個(gè)屬于擬桿菌.其中Rhodobacteraceae(紅桿菌科，隸屬于α-變形菌綱)是葉片附著細(xì)菌top5 OTU獨(dú)有(表1)，Actinomycetales(放線菌目，隸屬于放線菌科)和Polynucleobacter(多核桿菌屬，隸屬于β-變形菌綱)是浮游細(xì)菌top5 OTU獨(dú)有(表1).還有一些細(xì)菌如Flavobacterium(黃桿菌屬，隸屬于擬桿菌門)在浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落中都有分布(表1).

圖3 不同樣品組在門分類水平上的細(xì)菌群落組成(L: 低植物物種多樣性；H: 高植物物種多樣性；w: 水體；kc: 苦草；hwz: 穗狀狐尾藻；yzc: 微齒眼子菜；hz:黑藻)

表1 不同植物物種多樣性體系中浮游細(xì)菌和植物葉片附著細(xì)菌群落相對(duì)豐度前5的OTUs

2.3 浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落的β多樣性差異

圖4 不同植物物種多樣性體系中浮游細(xì)菌和植物葉片附著細(xì)菌群落β多樣性(L:低植物物種多樣性；H:高植物物種多樣性；w:水體；kc:苦草；hwz:穗狀狐尾藻；yzc:微齒眼子菜；hz:黑藻.箱型圖上不同的小寫字母表示顯著差異.單因素ANOVA分析，P < 0.05)

表2 相似性分析(ANOSIM)測(cè)試不同植物物種多樣性體系中浮游、植物葉片附著細(xì)菌群落組成的差異

圖5 Mantel和偏Mantel 檢驗(yàn)分析葉片附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系(顯著相關(guān)(P<0.05)用橙黃色表示，不顯著相關(guān)用灰色方塊表示)

2.4 高植物物種多樣性體系植物葉片附著細(xì)菌群落的共現(xiàn)模式

基于高植物物種多樣性體系中不同植物(苦草、黑藻、微齒眼子菜和穗狀狐尾藻)構(gòu)建4個(gè)不同的細(xì)菌物種共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，為了探索環(huán)境因素對(duì)植物葉片細(xì)菌的影響，將環(huán)境變量加入到網(wǎng)絡(luò)分析中.將OTU節(jié)點(diǎn)按照門水平分類賦予不同的顏色.結(jié)果顯示，總氮濃度與苦草(86.36%)、狐尾藻(82.35%)、微齒眼子菜(56%)葉片細(xì)菌群落的相關(guān)關(guān)系以正相關(guān)關(guān)系為主(圖6A，B，C)，與黑藻(40.82%)葉片細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)以負(fù)相關(guān)關(guān)系為主(圖6D).氨氮濃度與微齒眼子菜(75%)葉片細(xì)菌群落的相關(guān)關(guān)系以正相關(guān)關(guān)系為主(圖6C).觀察到4個(gè)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣髋c相應(yīng)的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)顯著不同(P<0.05)，表明細(xì)菌群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)是非隨機(jī)的(表3).所有植物的葉片附著細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)正相關(guān)關(guān)系占比較高，平均度較高.不同植物網(wǎng)絡(luò)顯示，苦草(58.79%)和黑藻(65.47%)網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)關(guān)系以正相關(guān)為主，苦草模塊化指數(shù)更高，穗狀狐尾藻平均度較高(表3).

表3 高植物物種多樣性體系植物葉片附著細(xì)菌群落觀察網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)

圖6 基于SparCC相關(guān)分析的環(huán)境因子和細(xì)菌物種-物種網(wǎng)絡(luò)特征((A)苦草；(B)穗狀狐尾藻；(C)黑藻；(D)微齒眼子菜.連接兩個(gè)節(jié)點(diǎn)的每條邊代表正(紅線)或負(fù)(黑線)相關(guān)關(guān)系)

高植物物種多樣性體系中不同植物網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物種信息表顯示(表4)，在苦草網(wǎng)絡(luò)中的7個(gè)關(guān)鍵OTU中，有4個(gè)來自擬桿菌門.在穗狀狐尾藻葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵OTU中，OTU112295來自疣微菌門(Verrucomicrobiae)和OTU102189來自藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)，它們屬于相對(duì)豐度top5 OTU優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(表1).在黑藻葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中的7個(gè)關(guān)鍵OTU中，4個(gè)來自β-變形菌綱，另有OTU270來自浮霉菌門(Planctomycetes)，屬于相對(duì)豐度top5 OTU優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(表1).在微齒眼子菜葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中的9個(gè)關(guān)鍵OTU中，4個(gè)來自α-變形菌綱；其中OTU93909和OTU158474屬于相對(duì)豐度top5 OTU優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(表1).在所有植物葉片附著細(xì)菌的綜合網(wǎng)絡(luò)中，15個(gè)關(guān)鍵OTU有10個(gè)來自α-變形菌綱.

表4 高植物物種多樣性體系中不同植物物種共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的模塊核心和連接點(diǎn)*

3 討論

3.1 物種多樣性對(duì)浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落的影響存在差異

研究結(jié)果顯示，種植更多種類的沉水植物能顯著降低水體中TN、TP濃度(圖1).與浮游細(xì)菌群落相比，葉片附著細(xì)菌群落表現(xiàn)出較高的α多樣性(OTU豐富度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性)(圖2).葉片附著細(xì)菌在水體和植物組織之間的界面生活方式賦予了其從這2種來源獲取營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，宿主植物可通過分泌物或光合產(chǎn)物提供養(yǎng)分來支持更高多樣性的細(xì)菌群落[37]，同時(shí)為細(xì)菌提供更多的生存空間[10].系統(tǒng)發(fā)育多樣性與群落內(nèi)物種之間的關(guān)鍵功能差異相關(guān)，可能代表植物葉片附著細(xì)菌和浮游細(xì)菌功能上的差異[38].此外，葉片的內(nèi)生細(xì)菌向外遷移到葉表面后也可能對(duì)附著細(xì)菌群落做出特殊貢獻(xiàn)[39]，這可以部分增加附著細(xì)菌群落豐富度，并形成不同的群落組成.同時(shí)浮游植物群落可以顯著影響浮游細(xì)菌的多樣性[37]，沉水植物因自身競(jìng)爭(zhēng)和化感作用可能抑制浮游植物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響浮游細(xì)菌多樣性.在不同植物物種多樣性體系的對(duì)比中，觀察到高植物物種多樣性體系中植物葉片附著細(xì)菌群落的α多樣性較高.沉水植物葉面可能有大量的碳源供葉片附著細(xì)菌利用[40]，與單種植物相比，更多種類的沉水植物能提供更多種類的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[41-42]，來支持更多的細(xì)菌物種存活.其次，采樣的季節(jié)(冬天)水生植物大都處在衰亡初期，相比其它生長(zhǎng)階段，衰亡初期的植物能夠?yàn)楦街谄浔砻娴募?xì)菌提供更多的無機(jī)和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[43]，隨著植物種類增加，高植物物種多樣性體系有更多樣的植物處于衰亡期，從而能提供更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得體系內(nèi)植物葉片附著細(xì)菌群落有更高的α多樣性指數(shù)[44].

NMDS分析結(jié)果表明，浮游細(xì)菌群落與植物葉片附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的相似度較低(圖4)，ANOSIM分析結(jié)果(表2)驗(yàn)證了它們之間均存在顯著差異.一方面，擴(kuò)散限制可能導(dǎo)致浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落產(chǎn)生差異.和根際土壤-植物連續(xù)體類似[45]，水生植物葉際分泌物、營(yíng)養(yǎng)成分、細(xì)菌等會(huì)在水體中進(jìn)行遷移擴(kuò)散，可能會(huì)在植物葉片-水體連續(xù)體中形成空間梯度.另一方面，通過細(xì)菌群落溯源分析，發(fā)現(xiàn)水環(huán)境可能是葉面附著細(xì)菌的主要來源，平均貢獻(xiàn)65.79%的附著細(xì)菌群落[46].細(xì)菌在水體和葉片表面生物膜這兩種生境之間的擴(kuò)散或交換也是有限的，宿主選擇性的差異使得葉片附著細(xì)菌群落和浮游細(xì)菌群落之間產(chǎn)生分化[10]，植物宿主選擇效應(yīng)是塑造沉水植物葉片附著細(xì)菌群落的另一個(gè)重要因子.

在門分類水平上，相比植物葉片附著細(xì)菌群落，浮游細(xì)菌群落的擬桿菌門和β-變形菌綱相對(duì)豐度較高(圖3).擬桿菌門在以高等水生植物為初級(jí)生產(chǎn)者的清水態(tài)湖泊中居多[47]，可以協(xié)助部分有機(jī)大分子物質(zhì)分解.而變形菌門有顯著的固氮作用，廣泛分布于全球不同類型的湖泊中，數(shù)量極為豐富[10].隨著植物物種多樣性增加，浮游細(xì)菌的擬桿菌門比例降低.李琳琳等[48]的研究發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度影響浮游細(xì)菌的群落組成，擬桿菌門數(shù)量隨著營(yíng)養(yǎng)鹽濃度減弱而減少.植物葉片附著細(xì)菌群落相對(duì)豐度top5 OTU中有3個(gè)屬于α-變形菌綱，其中紅桿菌(隸屬α-變形菌綱)是葉片附著細(xì)菌top5 OTU獨(dú)有的(表1)，它在附著細(xì)菌生物膜早期形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[49].而在浮游細(xì)菌群落中序列數(shù)相對(duì)豐度top5 OTU有3個(gè)屬于β-變形菌綱，它們當(dāng)中比如放線菌和多核桿菌(隸屬β-變形菌綱)是浮游細(xì)菌top5 OTU獨(dú)有的(表1).這些細(xì)菌屬于廣泛分布的淡水湖泊浮游細(xì)菌典型種群，浮游細(xì)菌群落獨(dú)有OTU中也表明這些細(xì)菌或許不具備在葉片表面成為優(yōu)勢(shì)物種的能力.另外，還有一些細(xì)菌，如黃桿菌(隸屬擬桿菌)(表1)，在浮游細(xì)菌群落和植物葉片附著細(xì)菌群落中都有分布，它們可能具備多樣的代謝方式和更強(qiáng)的生存適應(yīng)能力.

3.2 不同水生植物葉片附著細(xì)菌群落存在差異

高植物物種多樣性體系中，黑藻葉片附著細(xì)菌群落α多樣性顯著高于其它植物(P<0.05).有研究發(fā)現(xiàn)，沉水植物與葉片附著細(xì)菌發(fā)生相互作用時(shí)能夠分泌化感物質(zhì)，這些化感物質(zhì)能夠?qū)?xì)菌產(chǎn)生影響[50].對(duì)于化感活性強(qiáng)的植物，大量胞外分泌物可能有針對(duì)性地抑制一種或者幾種細(xì)菌的生長(zhǎng)，降低細(xì)菌群落的多樣性[51].本研究中的4種沉水植物，黑藻的化感活性較弱，微齒眼子菜和穗狀狐尾藻的化感活性較強(qiáng)[52]，這有可能導(dǎo)致黑藻葉片附著細(xì)菌多樣性明顯高于另外幾種沉水植物.盡管本研究沒有分析葉片附著真菌的組成，但有研究證明黑藻葉片分泌物促進(jìn)了細(xì)菌-真菌的正向相互作用，從而促進(jìn)了凋落物的分解和再循環(huán)，增加自身α多樣性[53].

NMDS分析結(jié)果表明，不同的植物葉片附著細(xì)菌群落之間相似度較低(圖4)，ANOSIM分析結(jié)果(表2)也顯示它們之間均存在顯著差異.外界環(huán)境和植物本身都對(duì)附著細(xì)菌群落造成一定的影響，水體中的化學(xué)物質(zhì)，包括氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽、溶解性有機(jī)物等，包括植物葉片分泌或滲出的物質(zhì)，比如糖類、有機(jī)酸、酚類等[54]，它們作為細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或者干擾物質(zhì)，都會(huì)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)造成影響[55].例如，隨著植物物種多樣性升高，體系NH3-N水平下降會(huì)導(dǎo)致葉片的可溶性糖含量增加和可溶性氨基酸含量減少[56]，從而潛在地影響葉表面的生化特性.關(guān)于植物種類對(duì)附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究發(fā)現(xiàn)：宿主專一性對(duì)附著細(xì)菌群落有重要影響，不同種類的植物葉片由于其獨(dú)特的化學(xué)組成、葉片滲出物、物理結(jié)構(gòu)等因素，具有差異顯著的附著細(xì)菌群落[10,57].本研究結(jié)果顯示，微齒眼子菜葉片附著細(xì)菌群落的β多樣性顯著更高.這可能是兩方面因素導(dǎo)致的，一方面是因?yàn)槲X眼子菜葉片結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，表面可能存在更多的微環(huán)境異質(zhì)性[58].另一方面可能是由于微齒眼子菜的生長(zhǎng)代謝更易受到環(huán)境因子的影響，進(jìn)而影響附著細(xì)菌[59].微齒眼子菜本身對(duì)環(huán)境條件的變化比苦草、黑藻等沉水植物更加敏感[60]，環(huán)境的變化使其葉表有更強(qiáng)的異質(zhì)性，其葉表附著細(xì)菌群落會(huì)有更高的β多樣性.此外，水體環(huán)境因子如氨氮、硝氮對(duì)附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響都非常大(圖5，6)，氮素對(duì)沉水植物葉片生物膜細(xì)菌群落具有重要影響[61].水體氨氮、硝態(tài)氮等不同形態(tài)氮素濃度的變化可能會(huì)影響沉水植物葉片分泌物的組成及含量，從而影響附著細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[62]；同時(shí)它們與附著細(xì)菌生物膜中反硝化細(xì)菌群落的變化顯著相關(guān)[63].不同沉水植物葉片附著細(xì)菌群落差異的具體機(jī)制仍然需要更深入的研究探討.

在門分類水平上，不同植物的葉片附著細(xì)菌豐度不同，苦草葉片中擬桿菌門、β-變形菌綱和γ-變形菌綱較多，微齒眼子菜和黑藻以α-變形菌綱和擬桿菌門居多，穗狀狐尾藻中α-變形菌綱、β-變形菌綱、擬桿菌門所占比例較高(圖3).幾種沉水植物的葉片形態(tài)差異極大，苦草葉片為線型；微齒眼子菜、黑藻和穗狀狐尾藻葉片為披針形，邊緣呈淺波狀，不同的葉形為細(xì)菌提供了不同的附著基質(zhì)[64].不同的植物有不同種類的內(nèi)生細(xì)菌[45]，在生長(zhǎng)過程中植物不同的內(nèi)生細(xì)菌可能會(huì)通過組織縫隙，表面裂口等物理通道或隨植物的代謝產(chǎn)物一并遷移到植物葉表，最終各自形成獨(dú)特的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[9].此外，葉片附著細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖可能與周圍水體環(huán)境密切相關(guān)，營(yíng)養(yǎng)鹽負(fù)荷、特殊的生境條件等都會(huì)影響葉片附著細(xì)菌的種類和豐度[64].

3.3 不同植物葉片附著細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)的差異

生態(tài)網(wǎng)絡(luò)可以代表生態(tài)系統(tǒng)中的各種生物相互作用，例如捕食、競(jìng)爭(zhēng)和共生[65].物種(節(jié)點(diǎn))通過相互作用成對(duì)連接[53]，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩詾槔斫饧?xì)菌群落內(nèi)成員的潛在相互作用或生態(tài)位分化提供了線索[66].本研究構(gòu)建了不同植物葉片附著細(xì)菌的物種共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)這些群落中物種之間的生態(tài)相互作用.注意到高植物物種多樣性體系中所有植物的網(wǎng)絡(luò)有最高的平均度，表明形成網(wǎng)絡(luò)的類群之間有積極的聯(lián)系；正相關(guān)關(guān)系接近負(fù)相關(guān)關(guān)系的2倍(表3)，可能意味著各種植物葉片的附著細(xì)菌的成員在附生群落中具有更強(qiáng)烈的積極相互作用[67].同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)穗狀狐尾藻葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中負(fù)相關(guān)關(guān)系比例較高(49.5%)，這表明物種之間的競(jìng)爭(zhēng)較強(qiáng)，網(wǎng)絡(luò)在干擾下更加穩(wěn)定[68].苦草葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)有最高的模塊性(表3)，顯示苦草葉片中附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜[69].在一項(xiàng)群落演替研究中證實(shí)，捕食者和獵物之間的相互作用強(qiáng)度及其復(fù)雜性有助于食物網(wǎng)的穩(wěn)定性[65,70].隨著網(wǎng)絡(luò)中更高程度和更積極的聯(lián)系，葉片附著細(xì)菌的成員可能在附生群落中具有更強(qiáng)烈的相互促進(jìn)作用.附生細(xì)菌含有許多參與植物葉片生物膜形成的基因，這需要不同種類細(xì)菌的合作[70]，并且可能在附生網(wǎng)絡(luò)中形成較高比例的正相關(guān)關(guān)系.特別是黑藻和苦草葉片附生細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中存在更多的正相關(guān)關(guān)系，這意味著它們的葉片附著細(xì)菌之間有更強(qiáng)共生關(guān)系，可能對(duì)不同的環(huán)境有更強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)能力[71].

網(wǎng)絡(luò)分析還可以揭示關(guān)鍵物種的信息，一般來說如模塊核心和連接點(diǎn)等高連接度的節(jié)點(diǎn)由于對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要影響而被視為關(guān)鍵物種[29]，因?yàn)樗鼈冊(cè)诰S持細(xì)菌群落組成和功能的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[72].纖維素是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，植物葉片的組成和分泌物中富含多糖和纖維素，變形菌、擬桿菌在多糖或木質(zhì)纖維素降解中發(fā)揮重要作用[69]，這可以解釋各植物葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種都出現(xiàn)了變形菌門和擬桿菌門.植物葉片生物膜在構(gòu)建過程中和一些附著細(xì)菌有著密不可分的關(guān)系，黑藻葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種中OTU160584和OTU101083屬于嗜甲基菌(g_Methylophilus)，穗狀狐尾藻和微齒眼子菜葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物種中OTU85983和OTU131840屬于紅桿菌(f_Rhodobacter)，它們都在葉片生物膜的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[71,73].這些OTU可能為其它細(xì)菌在構(gòu)建葉片生物膜時(shí)提供碳養(yǎng)分，從而影響整個(gè)附生細(xì)菌群落在植物葉片上的構(gòu)建[70].苦草和黑藻附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物種中OTU185、OTU115144和OTU109577屬于黃桿菌屬(g_Flavobacterium)，這一快生型細(xì)菌被稱為營(yíng)養(yǎng)鹽(磷酸鹽)增溶劑，而磷在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起重要作用，在限磷條件下，快速生長(zhǎng)的細(xì)菌尤其受到影響[74].在植物分解階段磷含量的快速損失為黃桿菌與其它細(xì)菌之間的優(yōu)先合作提供了機(jī)會(huì)，促進(jìn)參與分解的細(xì)菌群落之間的合作[52].可以推測(cè)，這些細(xì)菌可能在植物葉片生物膜的構(gòu)建、糖類的降解等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.

4 結(jié)論

1)浮游細(xì)菌和葉片附著細(xì)菌的群落多樣性和結(jié)構(gòu)具有顯著差異.與浮游細(xì)菌群落相比，葉片附著細(xì)菌群落表現(xiàn)出較高的α多樣性(OTU豐富度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性).植物可通過分泌物或光合產(chǎn)物提供養(yǎng)分來支持更高多樣性的細(xì)菌群落，同時(shí)為細(xì)菌提供更多的生存空間.

2)與單一植物物種體系相比，高植物物種多樣性體系中植物葉片附著細(xì)菌群落α多樣性較高.更多種類的沉水植物能提供更多種類的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而可支持更多的細(xì)菌物種存活.

3)沉水植物葉片附著細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌群屬于變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes).不同植物葉片附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，宿主選擇效應(yīng)是塑造沉水植物葉片附著細(xì)菌群落的重要因子.植物也通過影響水體中的氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽等濃度，間接影響葉片附著細(xì)菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu).

4)高植物物種多樣性體系中苦草葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)最復(fù)雜，穗狀狐尾藻葉片附著細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中物種之間競(jìng)爭(zhēng)較強(qiáng)，網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定.嗜甲基菌、紅桿菌、黃桿菌是物種共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物種，可能在植物葉片生物膜的構(gòu)建、糖類的降解等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用.