針灸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

丁 霞，霍新慧，昂沙爾·畢哈孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種目前仍然原因不明的慢性自身免疫疾病，其特征是關(guān)節(jié)滑膜炎癥[1]，通常會導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞并使患者的生活質(zhì)量顯著下降，現(xiàn)在仍然沒有能完全治愈的方法[2]。西醫(yī)藥物治療雖效果顯著，但副作用大，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重；中醫(yī)外治法療效顯著，治療費(fèi)用較合適，在治療RA方面有很大的科學(xué)研究價值和臨床應(yīng)用前景[3]。自噬(autophagy)被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，自噬在各種自身免疫性疾病(包括RA)中失調(diào)，并與多種免疫和非免疫細(xì)胞的成熟存活和增殖有關(guān)，在RA發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用[4]。目前針刺和艾灸對于細(xì)胞自噬干預(yù)RA的報道較少，但自噬蛋白表達(dá)與RA的關(guān)聯(lián)可能對本病的發(fā)病機(jī)制發(fā)揮著重要作用，故本研究分別以艾灸和針刺干預(yù)RA大鼠，比較兩種手段對RA的作用差別，并觀察二者對大鼠滑膜組織自噬相關(guān)蛋白的影響，從而探討RA的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 試劑 完全弗氏佐劑(美國Sigma公司，美國，批號：SLBW7430)；甲氨蝶呤片(規(guī)格2.5 mg/片，購于上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥廠，批號：161003)；特制香煙型純艾條(規(guī)格4 mm×120 mm，南陽臥龍漢醫(yī)艾絨廠)；懸灸支架(蘄春上工記艾灸器具開發(fā)有限公司);華佗牌一次性不銹鋼針灸針(規(guī)格0.3 mm×13 mm蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司)；LC3-Ⅱ試劑盒(英國Abcam公司，批號：GR3201455-1)；Beclin-1試劑盒(英國Abcam公司，批號：GR3204186-1)；內(nèi)參GAPPH(英國Abcam公司，批號:GR3249122-1)。

1.1.2 儀器 多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司，型號：Infinite M200 Pro)；通用型電泳儀(美國BIO-RAD Serial公司，型號：042BR11250)；電泳槽(美國BIO-RAD Serial公司，型號：552BR071035)；轉(zhuǎn)印槽(美國BIO-RAD Serial公司，型號：49BR36704)；微型離心機(jī)(美國六一儀器廠，型號：WD-2105A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar 健康大鼠50只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量160～200 g，購置并飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證許可證編號:SYXK(新)2016-0002。將大鼠飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃、濕度55 %～60 %的標(biāo)準(zhǔn)居住環(huán)境，自由攝食及飲水，12 h光照。屏障環(huán)境質(zhì)量合格證65000700000749。

1.3 造模方法

建立佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠(Adjuvant arthritis，AA)模型，各組大鼠左足趾底部皮膚常規(guī)消毒后注射完全弗氏佐劑(0.1 mL/只)進(jìn)行造模，造模3 d后根據(jù)課題組前期經(jīng)驗(yàn)[5]利用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)進(jìn)行評分。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)正常為0分；足小趾關(guān)節(jié)腫脹為1分；趾關(guān)節(jié)、足趾均腫脹為2分；踝關(guān)節(jié)以下腫脹為3分；踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹為4分。每只大鼠四肢評分分?jǐn)?shù)相加值即為AI值，分?jǐn)?shù)超過6分即造模成功。

1.4 分組方法

50只健康大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，對大鼠進(jìn)行稱重、標(biāo)號，選取10只為正常組(隨機(jī)數(shù)字表法)，將剩余40只造模成功的大鼠隨機(jī)分為造模組、陽性對照組、針刺組和艾灸組(隨機(jī)數(shù)字表法)，每組10只。

1.5 干預(yù)方案

1.5.1 正常組和造模組 兩組大鼠均不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5.2 陽性對照組 大鼠按照0.1 mg/100 g的劑量進(jìn)行甲氨蝶呤灌胃，1次/3 d(每周2次)，共21 d。

1.5.3 艾灸組 用自制鼠架將大鼠擺好姿勢，用自行改良的懸灸支架固定溫灸純艾條(規(guī)格4 mm×120 mm)，選取雙側(cè)足三里、腎俞(按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》動物穴位圖譜[6])艾條溫和懸灸治療，兩個腧穴同時進(jìn)行，每穴20 min，左右側(cè)腧穴交替進(jìn)行。1次/d(均上午9:00開始)，每次20 min，連續(xù)干預(yù)6 d后休息1 d,共21 d。

1.5.4 針刺組 大鼠固定、選穴和治療時間同艾灸組，操作者左手爪切按壓所刺部位，右手持針，以拇、食、中三指挾持針柄，快速進(jìn)針，每天由同一人對大鼠進(jìn)行針刺，每間隔5 min進(jìn)行提插捻轉(zhuǎn)。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 AI指數(shù)測定 各組大鼠按照1.3操作方法于造模成功和治療結(jié)束后進(jìn)行AI指數(shù)評分。

1.6.2 足爪容積測定 采用排水法原理和AI指數(shù)同一時間點(diǎn)測量足爪容積，具體測定方法如下：標(biāo)記AA大鼠踝關(guān)節(jié)高點(diǎn)之上1 cm處，用裝滿水的10 mL玻璃刻度管，由專人將大鼠足部垂直插入水中至記號后取出，再用灌滿水的5 mL注射器往刻度管中加水至原有高度之后觀測注射器中剩余水量，加入刻度管中的水量即為足爪容積，每只足爪測量兩次取平均值。

1.6.3 血清指標(biāo)測定 大鼠治療21 d后統(tǒng)一處理，將各組大鼠予10 %水合氯醛腹腔麻醉后，腹主動脈采血做相應(yīng)記號，并放置于室內(nèi)1 h，4 ℃離心(3 000 r/min)5 min，取上清液放入EP管內(nèi)-20 ℃保存。按照ELISA試劑盒試說明書逐步檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β水平。

1.6.4 自噬指標(biāo)測定 剝離滑膜組織后，放入4 %多聚甲醛固定液中保存。滑膜組織常規(guī)病理切片，脫蠟至水，按照Western Blot檢測大鼠滑膜組織LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)量，內(nèi)參為GAPDH。取大鼠滑膜組織用冰研磨，然后離心分離取上清，蛋白量的測定使用相應(yīng)的BCA 蛋白質(zhì)試劑盒；依次加樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和室溫封閉；按抗體說明書加入一抗LC3-Ⅱ(1∶3 000)、Beclin-1(1∶3 000)、置4 ℃冰箱過夜，洗膜，再加入二抗(1∶10 000)，ECl顯色;放于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光其蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 AI指數(shù)和足爪容積比較

4組大鼠造模后與正常組比較，其AI指數(shù)和足爪容積指標(biāo)均明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與造模組比較，大鼠經(jīng)治療后，其AI指數(shù)和足爪容積指標(biāo)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。見表1。

表1 各組大鼠AI指數(shù)和足爪容積比較

2.2 血清TNF-α、IL-1β水平比較

與正常組比較，造模組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與造模組比較，陽性對照組、針刺組和艾灸組TNF-α、IL-1β水平均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-1β比較

2.3 滑膜組織LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，造模組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Beclin-1蛋白表達(dá)明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，陽性對照組和針刺組Beclin-1蛋白表達(dá)上升顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與造模組比較，針刺組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Beclin-1蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，艾灸組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Beclin-1蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖1。

表3 各組大鼠滑膜組織LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性、炎癥性自身免疫性疾病，病因和發(fā)病機(jī)制目前仍然不明確，病情會導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞甚至畸形，更嚴(yán)重者可導(dǎo)致關(guān)節(jié)糜爛和全身器官受累[7]。由于RA無法治愈，其治療目標(biāo)是減少關(guān)節(jié)炎癥和疼痛，最大限度地發(fā)揮關(guān)節(jié)功能。傳統(tǒng)的西藥雖見效快但毒副反應(yīng)明顯,易產(chǎn)生依賴性且停藥后易反彈；新興的生物制劑雖能避免傳統(tǒng)藥物的某些弊端，但藥價昂貴[8-9]。由此可見現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療 RA 雖然效果明顯，但是仍有不足。

RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇，《濟(jì)生方·痹》云：“非獨(dú)責(zé)之于風(fēng)寒濕，體虛相合，痹證乃生?！盵10]指出 RA 的發(fā)生與內(nèi)、外二因均有關(guān)系。RA是由機(jī)體正氣內(nèi)虛，加之感受風(fēng)、寒、濕等邪氣，壅塞經(jīng)脈，深入骨節(jié)所致。初期治療應(yīng)以驅(qū)邪通絡(luò)、緩急止痛為主，后期則以扶助正氣為主。足三里作為胃經(jīng)的合穴、回陽九針穴之一，能兼顧RA初期和后期病機(jī)，將補(bǔ)益氣血、顧護(hù)正氣貫穿于治療始終[11]?！鹅`樞·四時氣》篇曰：“著痹不去，久寒不已，卒取其三里”，可見足三里穴在治療痹證中的重要地位[12]。腎俞屬足太陽膀胱經(jīng)，為腎的背俞穴，乃腎臟之氣輸注、聚結(jié)于體表之部位，具有補(bǔ)虛培元之功，對臟腑、經(jīng)絡(luò)和氣血津液的失調(diào)都有很好的調(diào)整作用[13]。且腎在體合骨，RA 的典型癥狀就是骨骼關(guān)節(jié)的疼痛、變形。足三里、腎俞二穴，兼顧先天、后天，二穴相配伍，能以后天補(bǔ)先天，先天生后天，可以起到補(bǔ)益正氣、舒緩筋脈的整體調(diào)節(jié)作用，又能疏通局部經(jīng)絡(luò)、活血溫通以止痛。

目前針灸在治療RA方面有獨(dú)特的療效和優(yōu)勢，在提高患者的生活質(zhì)量、改善RA的預(yù)后等方面有著重要作用[9]。針刺穴位治療RA療效顯著[14],有祛風(fēng)散寒、通痹止痛的功效，廣泛的臨床和實(shí)驗(yàn)動物研究表明：艾灸療法應(yīng)用治療關(guān)節(jié)炎具有良好的療效，能減輕癥狀，控制病情，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，被越來越多的患者所接受，有很好的應(yīng)用前景[15-16]。

自噬最初被認(rèn)為是一種細(xì)胞內(nèi)務(wù)處理途徑，通過調(diào)節(jié)分解代謝過程和清除病原體表現(xiàn)出細(xì)胞保護(hù)作用[17]。自噬啟動的主要信號線索集中在PI3K調(diào)節(jié)上[18]。自噬的早期啟動步驟由不同的信號感應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)，包括4種蛋白激酶:哺乳動物雷帕霉素靶復(fù)合物1 (mTORC1)、ULK1、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和AKT[19-20]。微管相關(guān)蛋白輕鏈-3 ( microtubule-as-sociated protein,Light chain-3,LC3)，被稱為酵母細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Atg8的類似物，是自噬體的特異性標(biāo)記蛋白[21]，LC3-Ⅱ復(fù)合物是評估自噬水平的關(guān)鍵指標(biāo)[22]。Beclin蛋白復(fù)合物-1( Beclin-1)是哺乳動物參與自噬的特異性基因，在自噬體的形成過程中至關(guān)重要，是酵母ATG6的同系物，是PI3K復(fù)合物的組成部分[23]。LC3-Ⅱ復(fù)合物、Beclin-1均是有關(guān)自噬相關(guān)蛋白研究的主要主題之一[24]。

現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)自噬也是自身免疫疾病發(fā)病機(jī)理之一，自噬可能參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，自噬已成為RA發(fā)病機(jī)制的媒介[25]。TNF-α和IL-1β是最重要的促炎細(xì)胞因子，它們具有強(qiáng)大的促炎活性，并且可以促進(jìn)各種促炎介質(zhì)的分泌，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜內(nèi)表達(dá)[26]，并能誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞，使蛋白酶和促炎細(xì)胞因子增殖和產(chǎn)生黏附分子[27]。自噬與促炎細(xì)胞因子密切相關(guān)、相互影響，炎癥的激活觸發(fā)自噬體的形成，并且自噬水平的上調(diào)以自噬形成標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ和Beclin-1的顯著增加為標(biāo)志[28]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)造模組相比正常組滑膜組織病理損害嚴(yán)重，大量的炎細(xì)胞浸潤、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)上升。通過治療，陽性對照組、針刺組與艾灸組的滑膜組織病理改變都有明顯減輕，血清中的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β均有所下降；各組的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)均有所降低，其中針刺組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)和艾灸組Beclin-1蛋白表達(dá)下降最明顯，提示無論是針刺還是艾灸對RA均有治療效果，其治療RA的機(jī)制可能與抑制自噬蛋白表達(dá)相關(guān)，自噬可能是RA的發(fā)病機(jī)制之一，但具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。