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    基于數(shù)字基因表達(dá)譜篩選雙側(cè)去勢大鼠附睪的差異表達(dá)基因

    2022-06-30 08:08:02趙振軍
    關(guān)鍵詞:附睪去勢文庫

    李 巖,石 慧,趙振軍

    (煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

    附睪是高等動(dòng)物重要的雄性生殖器官,具有多種生理功能,如參與精子成熟和濃縮、分泌和重吸收各種分子和蛋白質(zhì)等,且具有儲(chǔ)存精子的功能[1-4]。附睪發(fā)育和正常功能的維持主要受雄激素和睪丸因子的調(diào)節(jié)。在雙側(cè)去勢的動(dòng)物模型中,附睪的重量將減少至正常重量的25%。若給去勢動(dòng)物補(bǔ)充睪酮可使附睪重量增加約三倍,但即使補(bǔ)充超生理劑量的睪酮,附睪重量仍不能完全恢復(fù)至去勢前重量[5]。 在分子水平上,雙側(cè)去勢最終會(huì)導(dǎo)致附睪基因表達(dá)譜的改變。CHAUVIN和GRISWOLD利用Affymetrix芯片平臺(tái),在雙側(cè)去勢小鼠附睪頭、體、尾中篩選出50個(gè)受雙氫睪酮調(diào)控且上調(diào)兩倍以上的轉(zhuǎn)錄本,如Adam7、Gstm2和Erabp等[6]。此外,EZER和ROBAIRE構(gòu)建了成年Brown Norway 雄性大鼠的雙側(cè)去勢模型,并采用芯片技術(shù)檢測了474個(gè)cDNA在去勢組和假手術(shù)組大鼠附睪中的表達(dá)水平差異,發(fā)現(xiàn)去勢7 d后Gpx-1、GST、熱應(yīng)激基因及細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因呈現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢,表明附睪基因表達(dá)的調(diào)控是極其復(fù)雜的[7]。目前為止,雙側(cè)去勢對Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠附睪基因表達(dá)水平的影響尚缺乏較為系統(tǒng)的研究。

    篩選在不同的組織、發(fā)育進(jìn)程或特定病理過程中差異表達(dá)的基因?qū)τ诨A(chǔ)研究和藥物靶標(biāo)的研究都至關(guān)重要。數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)(DGE)利用新一代高通量測序技術(shù)和高性能計(jì)算分析技術(shù),能夠全面、經(jīng)濟(jì)、快速地檢測某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況。目前此技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等領(lǐng)域[8]。如SUN等利用DGE和生物信息分析技術(shù)研究了低精子活力和高精子活力公雞睪丸中的全局差異表達(dá)基因,為深入了解精子運(yùn)動(dòng)的潛在遺傳調(diào)控提供數(shù)據(jù)支持[9]。然而采用DGE技術(shù)研究雙側(cè)去勢大鼠附睪差異表達(dá)基因在國際上尚未見相關(guān)報(bào)道。

    本研究采用DGE技術(shù)在全基因組水平上鑒定了假手術(shù)對照組和雙側(cè)去勢SD雄性大鼠術(shù)后第7天附睪中的差異表達(dá)基因。已有研究表明,去勢后第7天存活的附睪上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平變化最具有代表性,因在這一時(shí)間節(jié)點(diǎn)已檢測不到凋亡細(xì)胞[10]。隨后,我們進(jìn)行了綜合生物信息學(xué)分析,以確定基因的表達(dá)模式及其在附睪中參與的生物學(xué)通路。本研究將為進(jìn)一步研究附睪中受雄激素及睪丸因子調(diào)控的差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能提供數(shù)據(jù)資源。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF 級(jí)成年雄性SD大鼠(30只,周齡為12周,體重均達(dá)到350~400 g)購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(魯)2019-0003,質(zhì)量合格證流水號(hào):1107261911003748。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為20.0±2.0 ℃,相對濕度為 45%~70%,采用人工照明,且12/12 h 明暗交替的條件環(huán)境下適應(yīng)7 d,期間自由飲食飲水。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過煙臺(tái)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

    SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(Con-EP)和雙側(cè)去勢組(Cas-EP),每組10只。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg體重)麻醉。然后結(jié)扎輸精管和睪丸動(dòng)靜脈,從結(jié)扎點(diǎn)取出睪丸,將完整的附睪留在陰囊區(qū)。對照組同時(shí)行假手術(shù)。術(shù)后恢復(fù)7 d后,從去勢和假手術(shù)對照組大鼠中取出全部附睪立即進(jìn)行RNA提取,或冷凍于液氮中,-80℃保存以備RNA提取。

    1.2 文庫構(gòu)建及測序

    大鼠附睪總RNA提取嚴(yán)格按照RNAiso-Plus試劑盒(TaKaRa,D9108A)說明書進(jìn)行。Agilent 2100評估總RNA的純度和質(zhì)量。經(jīng)檢測RIN≥7.0且28S/18S≥1.0,說明提取的RNA足以用于隨后的文庫構(gòu)建和測序。RNA樣品寄送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建,隨后利用Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)測序。

    1.3 tag注釋和基因表達(dá)水平量化

    將raw tag轉(zhuǎn)換為clean tag需要五個(gè)步驟:(1)去除3′端接頭以保留21nt長序列;(2)刪除空讀取(僅包含接頭序列但不含tag的序列);(3)去除低質(zhì)量標(biāo)簽(序列未知的tag);(4)去除過長或過短的tag,僅保留21nt的tag;(5)刪除只有一個(gè)拷貝數(shù)的tag(可能是因?yàn)榕判蝈e(cuò)誤)。隨后將得到的clean tag匹配到不超過1個(gè)核苷酸錯(cuò)配的參考序列。對匹配到多個(gè)位點(diǎn)的clean tag進(jìn)行過濾,只保留明確的匹配tag。為了鑒定基因表達(dá),計(jì)算每個(gè)基因的明確tag數(shù),然后標(biāo)準(zhǔn)化為每百萬個(gè)標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄本數(shù)(TPM)。

    1.4 差異表達(dá)基因的提取

    為了挖掘雙側(cè)去勢后大鼠附睪中差異表達(dá)的基因,本研究采用Audic 等提出的改進(jìn)算法[10]。假設(shè)A基因?qū)?yīng)的clean tag數(shù)為x,每個(gè)基因的表達(dá)水平僅為所有基因表達(dá)水平的一小部分,因此P(x)符合泊松分布。此外,假設(shè)樣本1和樣本2的clean tag數(shù)分別為N1和N2,而樣本1和樣本2中基因A的clean tag數(shù)分別為x和y?;駻在兩個(gè)樣本中表達(dá)的概率相等,可用公式計(jì)算:

    利用Benjamini-Hochberg方法[11],通過假發(fā)現(xiàn)率(FDR)控制獲得的P值。提取FDR≤0.001且log2(倍數(shù)改變)≥1的差異表達(dá)基因。用皮爾遜相關(guān)系數(shù)測定了兩個(gè)庫間的相關(guān)性。

    1.5 Gene Ontology(GO)及KEGG Pathway顯著性富集分析

    GO功能顯著性富集分析用于分析所有匹配基因以注釋它們潛在的生物學(xué)功能。Pathway分析利用KEGG生物通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集度分析。對篩選出的差異表達(dá)基因經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋,可準(zhǔn)確定位到對應(yīng)的Pathway條目中,經(jīng)超幾何檢驗(yàn),得到差異基因顯著富集通路。P值用Bonferroni校正法(Q值)校正,并將閾值設(shè)置為0.05以表示顯著富集的標(biāo)簽。

    1.6 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析

    采用實(shí)時(shí)定量PCR(real time quantitative PCR,qPCR)檢測相關(guān)差異基因的表達(dá)水平。首先取1 μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板,利用ReverTra Ace試劑盒(日本TOYOBO公司,FSK-100)合成cDNA第一條鏈。然后在QIAGEN的Roter Gene Q儀器上使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒(Life Technologies,11733-038)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)體系共50 μL:cDNA 1μL,SYBR green 25 μL,正向引物(0.3 μmol/L) 1.5 μL,反向引物(0.3 μmol/L) 1.5 μL,滅菌H2O 21 μL。反應(yīng)程序采用兩步法擴(kuò)增:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,[95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s] 40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)源性參照物。2-ΔΔCt方法用于計(jì)算受檢樣本中基因表達(dá)水平的差異[12]。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,引物序列見表1。

    表1 qPCR引物序列

    2 結(jié)果與分析

    2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

    為初步篩選假手術(shù)對照組和雙側(cè)去勢大鼠附睪中的差異表達(dá)基因,本研究分別構(gòu)建了Con-EP和Cas-EP文庫,并用Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)測序。在每個(gè)庫中獲得了超過450萬個(gè)raw tag。在去除低質(zhì)量的tag之后,約剩余96%的raw tag,即9 143 758個(gè)clean tag。其中兩個(gè)庫中共有209 405個(gè)不同的clean tag(表2)。

    表2 Con-EP和Cas-EP文庫測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    為了評估DGE數(shù)據(jù)的正態(tài)性,我們比較了tag表達(dá)的分布,因?yàn)閠ag的拷貝數(shù)實(shí)際反映了mRNA表達(dá)水平[13]。如圖1所示,在兩個(gè)DGE庫中,total clean tag和distinct clean tag顯示出相似的分布模式,表明在Con-EP和Cas-EP庫的構(gòu)建過程中不存在偏差。在total clean tag中,占優(yōu)勢的高表達(dá)tag是那些拷貝數(shù)超過100的tag,而在distinct clean tag中,占優(yōu)勢的高表達(dá)tag的拷貝數(shù)小于5。該結(jié)果表明小部分mRNA 高表達(dá),而大部分mRNA低水平表達(dá),符合細(xì)胞 mRNA的表達(dá)特征。

    圖1 Con-EP和Cas-EP文庫中clean tag的拷貝數(shù)分布

    2.2 大鼠參考基因的標(biāo)記定位

    為了將DGE圖譜轉(zhuǎn)化為基因表達(dá),將兩個(gè)DGE文庫的tag序列與NCBI注冊的大鼠基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。Con-EP和Cas-EP文庫中匹配的clean tag分別為293萬和315萬,分別占clean tag總數(shù)的62.89%和70.32%(表2)。在兩個(gè)文庫中,分別有41164個(gè)和46270個(gè)匹配的distinct clean tag,分別占42.10%和41.45%。飽和度分析結(jié)果表明,當(dāng)clean tag數(shù)量達(dá)到200萬時(shí),基因數(shù)的增長曲線變得平坦,表明兩個(gè)樣本的測序均趨于飽和(圖2)。用無歧義標(biāo)記計(jì)算的每百萬個(gè)標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本數(shù)(TPM,transcript per million tags)是表征基因表達(dá)水平的一個(gè)很好的指標(biāo)?;虮磉_(dá)的累積分布表明,約有一半的基因表達(dá)在10個(gè)拷貝以下(log10(TPM)<1),90%的基因表達(dá)量不超過100個(gè)拷貝,只有一小部分基因高表達(dá)(圖3)。

    圖2 測序飽和度分析

    圖3 基于unambiguous tag的基因表達(dá)累積分布

    2.3 雙側(cè)去勢大鼠附睪差異表達(dá)基因分析

    為了比較雙側(cè)去勢大鼠附睪差異表達(dá)基因,將tag的基因表達(dá)水平在Con-EP和Cas-EP兩個(gè)文庫中的分布進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化,并提取FDR≤0.001 且 log2fold-change≥1的顯著差異表達(dá)的tag。兩個(gè)文庫之間共有11 191個(gè)tag(匹配到2 448個(gè)基因)發(fā)生了顯著變化。其中,1 632個(gè)基因在雙側(cè)去勢后的大鼠附睪中表達(dá)上調(diào),816個(gè)基因表達(dá)下調(diào)?;虮磉_(dá)水平的倍數(shù)變化(log2)介于-16.5~10.4之間。約90%以上的基因(2 274)上調(diào)或下調(diào)1.0到5.0倍之間(圖4(a))。兩個(gè)文庫的皮爾遜相關(guān)系數(shù)僅為0.658,表明去勢對大鼠附睪基因表達(dá)譜有顯著影響(圖4(b))。

    圖4 Con-EP與Cas-EP文庫差異表達(dá)基因分析

    為驗(yàn)證DGE技術(shù)鑒定的差異表達(dá)基因的可靠性,隨機(jī)挑選6個(gè)差異表達(dá)的基因(上調(diào)基因:Rab3b、Hsd3b6和Hormad2,下調(diào)基因Lcn9、Ly6g5c和Smcp)進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。如表3所示,qPCR結(jié)果與測序數(shù)據(jù)一致,證實(shí)了測序結(jié)果的真實(shí)性(P值均小于0.01)。

    表3 差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證

    GO富集分析結(jié)果表明,所有上調(diào)和下調(diào)節(jié)基因的基因功能分布相似,但上調(diào)組突觸部分和輔助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是唯一的,而電子載體和病毒粒子部分則僅存在于下調(diào)組(圖5)。

    圖5 差異表達(dá)基因的GO富集分析

    2.4 差異表達(dá)基因的通路分析

    為進(jìn)一步了解雙側(cè)去勢后大鼠附睪中差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,本研究采用KEGG本體論方法對差異基因的功能注釋進(jìn)行分類。在KEGG數(shù)據(jù)庫的2 448個(gè)差異表達(dá)基因中,有1 881個(gè)基因被定位到250條通路中。通路富集分析表明,代謝通路、氧化磷酸化通路以及溶酶體通路是前三條顯著富集的途徑。

    3 討 論

    高通量轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)字基因表達(dá)標(biāo)簽分析對于全局轉(zhuǎn)錄組研究十分高效且經(jīng)濟(jì)[14-15],利用這些技術(shù)可以方便、準(zhǔn)確地分析多個(gè)樣本中差異表達(dá)的基因。因此本研究采用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù),研究了成年大鼠和雙側(cè)去勢大鼠附睪中差異表達(dá)基因。

    數(shù)據(jù)分析表明,共有2 448個(gè)基因在雙側(cè)去勢大鼠附睪中的表達(dá)差異顯著,其中1 632個(gè)基因上調(diào),816個(gè)基因下調(diào)。在這些差異表達(dá)的基因中,有1 881個(gè)基因被定位到KEGG數(shù)據(jù)庫中的250條通路。通路富集分析表明,代謝通路、氧化磷酸化通路和溶酶體通路是三條顯著富集的途徑。據(jù)報(bào)道,雄激素狀態(tài)將顯著影響哺乳動(dòng)物附睪的正常結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的維持,這種對雄激素的依賴性反映在對器官的代謝調(diào)控上[16]。在四種主要的附睪上皮細(xì)胞類型,即主細(xì)胞、基底細(xì)胞、狹窄細(xì)胞和亮細(xì)胞中,主細(xì)胞對循環(huán)雄激素的剝奪尤為敏感,而其他三種細(xì)胞類型受影響較小[9]。雙側(cè)去勢動(dòng)物附睪最明顯的形態(tài)學(xué)變化之一是主細(xì)胞頂端微絨毛數(shù)量減少。雄激素剝奪后,粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量減少,但高爾基體或線粒體的變化較小[16]。 除影響附睪細(xì)胞形態(tài)外,雄激素剝奪可能影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的整體代謝過程,如大鼠體內(nèi)雄激素對合成代謝反應(yīng)和為這種反應(yīng)提供前體或輔助因子的其他途徑有相當(dāng)大的影響。因此,雄激素缺乏的動(dòng)物附睪脂質(zhì)合成減少,戊糖磷酸途徑和丙酮酸羧化酶的活性也減少。另一方面,在成年動(dòng)物中,雄激素剝奪后細(xì)胞DNA和RNA顯著減少。在蛋白質(zhì)代謝方面,雄激素對蛋白質(zhì)合成速率和蛋白質(zhì)合成類型影響不大,但對某些特定的分泌性蛋白質(zhì)影響較為顯著。然而,雄激素可以增加附睪蛋白質(zhì)的平均周轉(zhuǎn)時(shí)間[16]。

    本研究采用qPCR方法驗(yàn)證了隨機(jī)選擇的6個(gè)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的差異基因。結(jié)果表明,這些基因在去勢組和假手術(shù)對照組附睪中的表達(dá)趨勢與DGE測序豐度的變化一致,從而證實(shí)了DGE測序技術(shù)的可靠性。值得注意的是,在去勢后表達(dá)顯著下調(diào)的基因Lcn9屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)家族。該家族是一個(gè)結(jié)構(gòu)保守、功能多樣的蛋白質(zhì)家族,廣泛參與了免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長和代謝調(diào)節(jié)、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和前列腺素合成等,因此在附睪中具有重要的生物學(xué)功能[17]。已有文獻(xiàn)報(bào)道,大鼠Lcn9 mRNA僅在附睪頭段呈特異性表達(dá),且在雙側(cè)去勢大鼠的附睪中,Lcn9 mRNA水平在去勢后1 d顯著下降,在隨后的3~7 d基本檢測不到其表達(dá),即使給去勢7 d后的大鼠補(bǔ)充睪酮,仍未能檢測到。此外,免疫組化結(jié)果表明,Lcn9蛋白在45日齡大鼠附睪頭段/起始段區(qū)域上皮細(xì)胞中開始表達(dá),此后其表達(dá)逐漸增加并保持在高水平,表明Lcn9蛋白參與了附睪的發(fā)育和成熟過程[18]。除Lcn9外,DGE測序中還檢測到Lcn家族的其他成員在去勢后的附睪中表達(dá)顯著下調(diào),如Lcn2、Lcn5、Lcn6、Lcn8、Lcn10、Lcn12和Lcn13,它們基因表達(dá)水平下調(diào)倍數(shù)(log2)分別為1.3倍、4倍、3倍、8倍、10倍、6倍、4倍。因此Lcn基因家族為DGE篩選出的受雄激素及睪丸因子調(diào)控的重要候選基因家族,其在附睪中的生物學(xué)功能及調(diào)控精子成熟的機(jī)制有待于深入研究探討。

    此外,本科研組前期研究篩選出59個(gè)去勢前后差異表達(dá)的microRNA,其中24個(gè)上調(diào),35個(gè)下調(diào),且在不同周齡的大鼠附睪中呈現(xiàn)出發(fā)育時(shí)序規(guī)律性變化,表明它們是受雄激素水平調(diào)節(jié)的[19]。本研究中去勢引起的雄激素水平的變化可能導(dǎo)致某些microRNA表達(dá)水平的變化,而附睪基因表達(dá)譜變化可能是這些microRNA精細(xì)調(diào)控的結(jié)果。建立microRNA與本研究篩選出的差異表達(dá)基因的對應(yīng)關(guān)系將成為今后研究工作的重點(diǎn)。

    綜上,本研究是對雙側(cè)去勢大鼠附睪基因表達(dá)譜的首次系統(tǒng)性研究,將為進(jìn)一步研究附睪中受雄激素及睪丸因子調(diào)控的差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能提供數(shù)據(jù)資源。

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