IRE1α缺陷通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)蛋白降低軟骨細(xì)胞的自噬功能

軟骨細(xì)胞直接參與軟骨生長、發(fā)育及軟骨組織正常功能的維持。當(dāng)軟骨遭受機(jī)械、損傷、衰老、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，會(huì)引發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生一系列響應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。自噬作為真核細(xì)胞內(nèi)另一種保護(hù)機(jī)制，通過溶酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑，吞噬和清除受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)等，幫助細(xì)胞執(zhí)行正常功能。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬互為因果、互相影響、協(xié)同完成細(xì)胞正常功能的執(zhí)行和穩(wěn)態(tài)的維持，但二者之間具體的調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究旨在闡明軟骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵調(diào)控分子肌醇依賴性激酶1α（IRE1α）如何通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)蛋白（CHERP）和鈣離子信號影響自噬，為進(jìn)一步探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的相互調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為軟骨發(fā)育的機(jī)制探究提供新的思路，也可能為骨軟化癥、軟骨發(fā)育不全等疾病的防治尋找到重要突破口和靶分子。

惠州市根除Hp處方大數(shù)據(jù)分析可見，單獨(dú)考慮“三聯(lián)療法”或“四聯(lián)療法”標(biāo)準(zhǔn)，“三聯(lián)療法”、“四聯(lián)療法”根除Hp處方的使用率在2010年較低，2016年，基本“三聯(lián)”處方率達(dá)到35.88%，“四聯(lián)”處方率達(dá)到15.53%，說明惠州市的根除Hp處方正在逐步的規(guī)范化。見表3、圖4。

1 材料和方法

1.1 材料

人軟骨細(xì)胞C28/I2 由美國紐約大學(xué)Professor Chuanju Liu惠贈(zèng)。DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基（BI）；抗體：IRE1α（CST）、GAPDH，XBP1（u+s）、Nrf2、PERK、p-PERK、β-actin、p-IRE1、LC3I/Ⅱ（CST，Proteintech）；抑制劑和激動(dòng)劑：4μ8c、雷帕霉素（Rapa）、巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1）、衣霉素（TM）（MCE）、SYBR qPCR mix（Vazyme）、自噬雙熒光病毒（漢恒生物）、PVDF膜（Millipore）、Ⅱ型膠原酶（Worthington）、小鼠基因組提取試劑盒（Bimake）、RNA提取試劑盒（Bioteke）ambion、八連管（Thermo scientific）、鈣離子熒光探針（Beyotime）、Ripa裂解液（強(qiáng)）（Beyotime）、HiScriptII Q RT SuperMix逆轉(zhuǎn)錄（Vazyme）。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞提取 課題組前期成功構(gòu)建軟骨組織特異性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）。ERN1小鼠和ERN1；Col2-Cre小鼠交配繁殖所得同窩新生鼠經(jīng)鼠尾基因型鑒定后，用2%的戊巴比妥鈉加高濃度的CO處死，分離提取原代軟骨細(xì)胞，并將細(xì)胞分為對照組（ERN1）和ERN1 CKO（ERN1；Col2-Cre）組。原代軟骨細(xì)胞提取步驟：小鼠浸泡于75%酒精5 min后切開腿部表皮，暴露出完整腿部結(jié)構(gòu)，向外側(cè)挑開髕韌帶，顯微鑷分離小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨（白色半透明狀），除凈表面韌帶及肌肉。關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)PBS沖洗干凈后，Ⅱ型膠原酶（1 mg/mL）消化過夜，離心垂懸至培養(yǎng)皿培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)獲得重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理審委會(huì)的批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照其要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 NCBI 查詢CHERP 的CDS 序列，Gene ID：10523，數(shù)據(jù)庫顯示共2751個(gè)堿基，設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增獲得CHERP片段，運(yùn)用LIC法連接重組質(zhì)粒，DH5α感受態(tài)內(nèi)擴(kuò)增后送擎科生物公司測序，成功獲得兩株測序正確的單克隆菌落，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-（-）-CHERP構(gòu)建成功（引物：方向?yàn)?'-3'，F(xiàn)：CTCGAGATGGAGATGCCGCTGCC；R：GATATCCTACTTACACTCGTCCC TGGCC，引物設(shè)計(jì)軟件為Primer5，下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體為同源臂序列）。

分離ERN1基因缺陷的原代軟骨細(xì)胞并進(jìn)行敲除效率的驗(yàn)證，ERN1 CKO組IRE1α蛋白質(zhì)表達(dá)水平（圖3A）和mRNA表達(dá)（圖3B）均明顯下調(diào)，自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7的表達(dá)明顯下降（圖3B）。在原代小鼠軟骨細(xì)胞中加入自噬抑制劑Bafilomycin A1抑制自噬溶酶體生成后，Western blot結(jié)果顯示，Bafilomycin A1（圖3C-E）處理后Control+Bafilomycin A1組較Control組LC3 Ⅱ/LC3 I比值上調(diào)（＜0.01），ERN1 CKO +Bafilomycin A1組較ERN1 CKO組LC3Ⅱ/LC3I比值上調(diào)（＜0.05）、較Control+Bafilomycin A1組LC3Ⅱ/LC3I比值下降（＜0.05）。

幼兒教育是一生學(xué)習(xí)的啟蒙階段，對以后的學(xué)習(xí)有著重要的影響，而語言學(xué)習(xí)更是學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)，只有語言學(xué)習(xí)的更好，才能更好地開始其它學(xué)科的學(xué)習(xí)。因此這對教師語言教學(xué)能力有著嚴(yán)格的要求，教師語言教學(xué)能力的高低直接影響了幼兒的語言學(xué)習(xí)能力。教師的語言教學(xué)能力不僅體現(xiàn)了教師的個(gè)人素養(yǎng)，也對幼兒養(yǎng)成正確的言語有著重要的影響。因此，教師可以針對語言教學(xué)能力進(jìn)行相關(guān)的訓(xùn)練，例如對教師組織培訓(xùn)活動(dòng)、教師之間觀察交流活動(dòng)。教師在日常上課時(shí)，也可有意識地進(jìn)行相關(guān)的訓(xùn)練。經(jīng)過長時(shí)間的積累，教師就會(huì)掌握系統(tǒng)的語言教學(xué)方法，提高語言教學(xué)能力。

又名頂真，即某段文字由若干短句組成，每一句的最后一個(gè)字（詞）與下一句開頭的第一個(gè)（詞）相同。運(yùn)用頂針修辭手法，不但能使句子結(jié)構(gòu)整齊，語氣貫通，而且能突出事物之間環(huán)環(huán)相扣的有機(jī)聯(lián)系。例如：

1.2.6 4μ8c、Rapa、Bafilomycin A1實(shí)驗(yàn) Rapa實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞貼壁生長后，4μ8c（100 nmol/L）處理C28I2細(xì)胞24 h后，加入Rapa（25 μmol/L）處理6 h后提取總蛋白。Bafilomycin實(shí)驗(yàn)：Bafilomycin（500 nmol/L）處理原代軟骨細(xì)胞24 h后提取總蛋白。

自噬雙熒光病毒預(yù)處理原代小鼠軟骨細(xì)胞24 h，加入自噬激活劑Rapa處理6 h后，自噬雙熒光病毒實(shí)驗(yàn)顯示ERN1 CKO鼠軟骨細(xì)胞中LC3-GFP較Control組熒光增強(qiáng)（圖4 A、B），加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM處理12 h后（圖4 C、D），出現(xiàn)相似結(jié)果。

1.2.8 免疫細(xì)胞熒光 細(xì)胞貼壁生長后換成無血清培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Lipofectamin2000（2 μL/μg）與質(zhì)粒分別在37 ℃孵育5 min，混勻孵育10 min后加入培養(yǎng)基，6 h后換液，48 h后4%多聚甲醛固定細(xì)胞，依次進(jìn)行0.5%Triton X-100通透10 min，PBS清洗，山羊血清封閉30 min，一抗4 ℃過夜（LC3，1∶200，LAMP1，1∶800），PBS清洗，熒光二抗室溫避光孵育3 h，PBS清洗，DAPI避光孵育5 min，抗熒光衰減封片劑封片后，共聚焦顯微鏡下拍攝結(jié)果。

1.2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 待原代細(xì)胞長滿約85%密度時(shí)，PBS清洗后加入Ripa裂解液，冰上裂解40 min，每10 min劇烈渦旋震蕩1次，15 000 r/min離心12 min后吸取上清，加入6×SDS混勻后沸水浴8 min，所得蛋白按照實(shí)驗(yàn)室先前方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

明器，是一種專為隨葬而仿照實(shí)物制成的器物〔1〕。雄安新區(qū)所在的河北省雄縣、安新縣、容城縣，近幾十年來在一些漢墓的發(fā)掘過程中土了許多模型明器，其類型較為豐富，具有一定的研究價(jià)值，是研究雄安新區(qū)漢代喪葬制度及思想文化等方面的重要資料。

整理國故，雖然首先是回到產(chǎn)生、盛行那個(gè)思想的具體時(shí)代，但更重要的是要評判是非、重估價(jià)值。眾所周知，進(jìn)化論的風(fēng)靡同時(shí)帶來一種“進(jìn)步”的信念，表現(xiàn)在時(shí)間觀上，即主張古今有別，進(jìn)而強(qiáng)調(diào)自古及今是一個(gè)推陳出新、日益增進(jìn)和提升的過程，古不及今。這種不可逆的線性時(shí)間觀不僅嘲笑“德配天地道冠古今”的不變論，也有別于傳統(tǒng)的循環(huán)、輪回思想，更沖擊了各種以古為尊世風(fēng)日下的歷史倒退論。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，伴隨自噬水平升高

在C28/I2細(xì)胞中加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM處理不同時(shí)間后，檢測到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白IRE1α（由ERN1基因編碼產(chǎn)生），XBP1s表達(dá)上調(diào)（＜0.05）。自噬標(biāo)記蛋白分子p62 表達(dá)下調(diào)（＜0.05），LC3Ⅱ/LC3I 表達(dá)上調(diào)（＜0.05），自噬水平上升（圖1）。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記鈣離子實(shí)驗(yàn) 用TM（10μg/mL）處理3 h后，將ERN1 CKO 和對照小鼠的原代軟骨細(xì)胞收集在200μL HBSS平衡鹽溶液中。將鈣離子熒光探針4 μmol/L Fluo-4AM與細(xì)胞懸液混合，并在37 ℃下孵育20 min。HBSS洗滌2次后，使用含有1%FBS的HBSS（200μL）重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液在37 ℃下孵育40 min。用HBSS洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中鈣離子的水平。

2.2 軟骨細(xì)胞中抑制IRE1α磷酸化，自噬激活受損

C28/I2細(xì)胞中加入IRE1α磷酸化（p-IRE1α）抑制劑4μ8c 預(yù)處理24 h 后加入自噬激活劑Rapa（圖2），Western blot結(jié)果顯示，Rapa處理后LC3Ⅱ/LC3I 表達(dá)上調(diào)（＜0.01），Rapa聯(lián)合4μ8c處理組相較Rapa組，LC3Ⅱ/LC3I 比值降低（＜0.05）。

2.3 軟骨細(xì)胞中IRE1α敲除，自噬小體生成受阻

1.2.3 qPCR檢測原代軟骨細(xì)胞中ERN1、ATG5、ATG7的表達(dá) 待原代細(xì)胞長滿約85%密度時(shí)，PBS清洗后加入RL裂解液按說明書步驟進(jìn)行RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA用于qPCR反應(yīng)，全部流程按照實(shí)驗(yàn)室先前方法步驟。（引物方向均為5'-3'，ERN1，F(xiàn)：ACACCGA CCACCGTATCTCA，R：CTCAGGATAATGGTAGCC ATGTC；ATG5，F(xiàn)：TGTGCTTCGAGATGTGTGGTT，R：GTCAAATAGCTGACTCTTGGCAA；ATG7，F(xiàn)：GT TCGCCCCCTTTAATAGTGC，R：TGAACTCCAACG TCAAGCGG）。

2.4 軟骨細(xì)胞中IRE1α敲除，自噬溶酶體形成受阻

1.2.7 自噬雙熒光病毒實(shí)驗(yàn) 用自噬雙熒光腺病毒（GFP-LC3）預(yù)混polybrene（10 μg/mL）轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞細(xì)胞6 h后換液，24 h后用TM（0.5 μg/mL）或Rapa（25 μmol/L）處理細(xì)胞，觀察不同時(shí)間點(diǎn)紅綠熒光強(qiáng)度。在自噬流過程中，綠色熒光的強(qiáng)度逐漸減弱。

由于直齒輪的輪齒在接觸的瞬間是整個(gè)齒寬的線接觸，傳動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的嚙合沖擊較大。斜齒輪也是線接觸，但它是由齒面上一點(diǎn)開始，漸漸向下延伸而通過整個(gè)齒面，因而沖擊較小，在載荷狀態(tài)和轉(zhuǎn)速相同的情況下，直齒輪的傳動(dòng)噪聲比斜齒輪大5dB左右，但斜齒輪傳動(dòng)時(shí)有附加軸向力，故需采取平衡軸向力的措施。一般斜齒輪分度圓上的螺旋角β取16°～20°為宜。而人字齒類似于兩個(gè)斜齒輪的組合，其在傳動(dòng)時(shí)無附加軸向力，傳動(dòng)平穩(wěn)，噪聲低。但制造相對復(fù)雜、成本比較高。

數(shù)據(jù)處理軟件為GraphPad Prism 8。指標(biāo)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，在方差齊性基礎(chǔ)上應(yīng)用單樣本、兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)以及單因素方差分析進(jìn)行組間比較，＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.5 軟骨細(xì)胞中IRE1α調(diào)控CHERP表達(dá)及鈣離子濃度

Western blot結(jié)果顯示，ERN1 CKO鼠軟骨細(xì)胞中CHERP表達(dá)較Control組上升（＜0.05，圖5）。鈣離子熒光探針結(jié)果顯示，IRE1α缺陷型軟骨細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子含量明顯上升（＜0.01，圖6A、B）。

2.6 軟骨細(xì)胞中過表達(dá)CHERP抑制自噬激活

為進(jìn)一步研究CHERP 與自噬的關(guān)系，構(gòu)建pcDNA3.1-（-）-CHERP真核表達(dá)質(zhì)粒，酶切結(jié)果顯示重組質(zhì)粒連接成功（圖7A），質(zhì)粒測序（圖7B）后進(jìn)一步在C28/I2細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證過表達(dá)效率，Western blot結(jié)果顯示兩株單克隆菌落來源的CHERP真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖7C）。C28/I2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-（-）-CHERP 48 h后，p62蛋白表達(dá)水平上調(diào)（圖8A）。

2.7 軟骨細(xì)胞中IRE1α挽救CHERP抑制的自噬

為進(jìn)一步探究IRE1α，CHERP以及自噬之間的關(guān)系，在C28/I2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-（-）-IRE1α與pcDNA3.1-（-）-CHERP 48 h后，自噬小體LC3免疫熒光檢測（圖9）顯示，pcDNA-3.1-（-）-IRE1α組較pcDNA-3.1-（-）對照組LC3熒光增強(qiáng)，pcDNA3.1-（-）-CHERP 處理組較對照組LC3熒光減弱，pcDNA3.1-（-）-IRE1α+pcDNA3.1-（-）-CHERP處理組LC3熒光強(qiáng)度介于兩單獨(dú)處理之間。

3 討論

IRE1α作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器，通過感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的壓力刺激，向下游傳遞信號，激活未折疊蛋白反應(yīng)，參與應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激帶來的壓力，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的保護(hù)。研究表明IRE1α/XBP1s信號通路參與維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)減少凋亡，但I(xiàn)RE1α調(diào)控軟骨細(xì)胞生理活動(dòng)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。自噬作為細(xì)胞基本生理功能之一，有研究報(bào)道自噬在軟骨的發(fā)育生長過程中有著不可或缺的作用，完整的自噬流包括自噬小體的形成，自噬小體與溶酶體融合，以及溶酶體內(nèi)的降解。研究證實(shí)自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激二者是動(dòng)態(tài)互連的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后，對于自噬具有誘導(dǎo)和抑制的雙重作用，通過調(diào)控自噬實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，而目前關(guān)于軟骨細(xì)胞中IRE1α與自噬相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。本文我們重點(diǎn)探討了軟骨細(xì)胞中IRE1α調(diào)控自噬的作用與機(jī)制。

首先我們在人軟骨細(xì)胞C28/I2中觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑TM上調(diào)自噬水平，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自噬誘導(dǎo)劑Rapa處理后，IRE1α磷酸化抑制劑4μ8c抑制C28/I2細(xì)胞中p-IRE1α水平，同時(shí)LC3Ⅱ/LC3I的比值下調(diào)，提示C28/I2細(xì)胞中IRE1α功能活性受損可以部分抑制自噬的激活（圖2）。然后通過提取ERN1 CKO小鼠原代軟骨細(xì)胞驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，敲除IRE1α后，自噬相關(guān)蛋白ATG5和ATG7的表達(dá)降低，提示自噬可能受損（圖3B）。自噬抑制劑BafilomycinA1通過抑制自噬溶酶體的生成，阻斷LC3Ⅱ的降解，從而導(dǎo)致LC3Ⅱ蓄積性增高，我們使用BafilomycinA1處理原代軟骨細(xì)胞后觀察到IRE1α敲除后，下調(diào)原代軟骨細(xì)胞中LC3Ⅱ的蓄積性增高，提示IRE1α缺陷時(shí)，軟骨細(xì)胞中自噬小體生成受阻（圖3C）。進(jìn)一步在原代軟骨細(xì)胞中通過自噬雙熒光病毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證自噬流的變化，觀察到Rapa或TM處理后，未降解的LC3-GFP熒光強(qiáng)度明顯高于對照組，提示自噬小體的降解受阻，即自噬溶酶體生成受到抑制（圖4）。此外，研究指出細(xì)胞內(nèi)鈣離子在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，其中有研究表明鈣離子對自噬起負(fù)向調(diào)控作用，也有研究表明鈣離子對自噬發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)的作用。我們進(jìn)一步探究IRE1α對鈣離子的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)IRE1α缺陷的軟骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)蛋白CHERP以及鈣離子含量明顯上升（圖5、6）。在C28/I2細(xì)胞中過表達(dá)CHERP，抑制自噬激活（圖7、8），過表達(dá)IRE1α能部分恢復(fù)CHERP抑制的細(xì)胞自噬（圖9）。結(jié)合前文實(shí)驗(yàn)，提示軟骨細(xì)胞中IRE1α可能通過調(diào)節(jié)CHERP影響鈣離子信號進(jìn)而調(diào)控自噬的激活。后續(xù)我們將進(jìn)一步驗(yàn)證，IRE1α如何通過自噬影響軟骨細(xì)胞的生理活動(dòng)。綜上，本文成功從ERN1CKO小鼠中分離出原代軟骨細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞中敲除IRE1α，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)蛋白CHERP表達(dá)上調(diào)，胞內(nèi)鈣離子含量上升，同時(shí)阻滯自噬流中自噬小體與自噬溶酶體的形成。本研究初步闡明軟骨細(xì)胞中IRE1α調(diào)控自噬的可能機(jī)制，為進(jìn)一步探究IRE1α與軟骨發(fā)育，軟骨相關(guān)疾病的關(guān)系提供一定的理論基礎(chǔ)。